ISOLASI DAN KARAKTERISASI PARSIAL BAKTERI ALAMI

RESISTEN ANTIBIOTIK AMOXSAN® DARI TANAH GAMBUT CAGAR

BIOSFER GIAM SIAK KECIL BUKIT BATU (GSKBB)

Ella Naster1) Yuana Nurulita1) Delita Zul1)

1)
Jurusan Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Universitas Riau,Pekanbaru, 28293, Indonesia
Ella.naster@student.unri.ac.id

ABSTRACT
Isolate of LBKURCC87 is a natural bacterium that is resistant to ampicillin
antibiotics isolated from peat soil of Giam Siak Kecil Bukit Batu (GSKBB)
biosphere reserve at Riau Province. This study aims to isolate and identify natural
bacteria resistant to isolation is ampicillin from peat soil of Biosphere Reserve of
Giam Siak Kecil Bukit Batu (GSKBB). The method was the spread plate
microorganisms in the agar nutrient medium (NA) containing ampicillin in
multilevel amount, then the resistant bacteria was assessed morphologically and
the biochemical characterization. Morphological characterization was done by
observing macroscopic and microscopic structures. Macroscopic structure was
conducted by observing colony shape, colony color and the shape of colony edge.
The bacteria were grown on NA medium and colony morphological observations
were performed after the culture was incubated at 37 ° C for 18-24 hours. The
biochemical characterization was assessment of MR-VP (methyl red-Voges
proskauer), methyl red, carbohydrate fermentation, catalase and oxidase activity.
The result of this research can be Gram-negative bacteria that resistant to
ampicillin.

Keyword: Antibiotics, Isolation, Resistant, Spread Plate.

ABSTRAK
LBKURCC87 merupakan bakteri alami yang resisten terhadap antibiotik
ampisilin yang diisolasi dari tanah gambut Cagar Biosfer Giam Siak Kecil Bukit
Batu (GSKBB) Provinsi Riau. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan
mengidentifikasi bakteri alami yang resisten terhadap antibiotik ampisilin dari
tanah gambut Biosphere Reserve Giam Siak Kecil Bukit Batu (GSKBB). Metode
isolasi mikroorganisme adalah spread plate pada medium nutrien agar (NA) yang
mengandung ampisilin dalam jumlah bertingkat, kemudian bakteri yang resisten
dikarakterisasi secara morfologi dan karakterisasi biokimia. Karakterisasi
morfologi dilakukan dengan pengamatan struktur makroskopis dan mikroskopis.
Struktur makroskopis dengan mengamati bentuk koloni, warna koloni serta
bentuk tepi koloni. Bakteri ditumbuhkan pada medium NA dan pengamatan

Page 1
morfologi koloni dilakukan setelah kultur diinkubasi pada suhu 37 oC selama 18 –
24 jam. Karakterisasi biokimia yang dilakukan yaitu uji MR-VP (Methil red-
Voges proskauer), metil merah, fermentasi karbohidrat, dan aktivitas katalase, dan
oksidase. Hasil dari penelitian ini adalah isolat LBKURCC87 yang diperoleh
merupakan bakteri alami yang resisten terhadap ampisilin dengan jenis bakteri
Gram negatif.

Kata Kunci: Antibiotik, Isolasi, Resisten, Spread Plate.

PENDAHULUAN adalah suatu keadaaan dimana

Riau merupakan salah satu
provinsi yang memiliki lahan gambut
dengan luas sekitar 45% (4,044 juta
hektar) dari total wilayah yang ada
(Darajat, 2006). Salah satu kawasan
gambut di Riau adalah Cagar Biosfer
Giam Siak Kecil-Bukit Batu
(GSKBB). Kawasan ini merupakan
salah satu cagar biosfer diantara
tujuh cagar biosfer Indonesia
(Partomiharjo et al., 2007) dengan
luas mencapai 84,000 hektar (Devita,
2009).
Tanah merupakan salah satu
habitat bagi mikroorganisme. Dalam
satu gram tanah terdapat jutaan
mikroorganisme. Mikroorganisme
per gram tanah yang subur umumnya
meliputi: bakteri, Actinomycetes,
fungi, alga, dan protozoa (Budiyanto,
2004). Tanah gambut dengan
karakteristik mengandung zat
organik yang tinggi akan mempunyai
komposisi dan jenis mikroorganisme
yang berbeda dengan tanah mineral.
Beberapa bakteri mempunyai
kemampuan alami untuk kebal atau
resisten terhadap efek pengobatan,
seperti antibiotik. Resistensi bakteri
kehidupan bakteri itu sama sekali
tidak terganggu oleh kehadiran
antibiotika. Sifat ini merupakan suatu
mekanisme pertahanan tubuh dari
suatu makhluk hidup. Penemuan dan
penggunaan antibiotik secara luas
dalam bidang kesehatan sejak 1943
telah berhasil menurunkan angka
kematian secara tajam akibat infeksi.
(Misriani, 2013).
Terbatasnya kajian tentang
antibiotik atau antibiotik resisten
alami menyebabkan perlu dilakukan
kajian apakah antibiotik alami dari
lingkungan alami, khususnya gambut
akan menghasilkan mikroorganisme
yang resisten. Pengujian bisa
dilakukan terhadap antibiotik yang
ada di pasaran, salah satunya
antibiotik ampisilin.
Penelitian tanah gambut
masih sangat terbatas sehingga
identifikasi dan karakterisasi bakteri
alami dari tanah gambut Cagar
Biosfer Giam Siak Kecil Bukit Batu
(GSKBB) yang resisten terhadap
antibiotik ampisilin dapat menambah
literatur untuk mengetahui karakter

Page 2
morfologi dan biokimia bakteri alami
daerah tersebut.
METODOLOGI PENELITIAN
Alat yang digunakan dalam
penelitian ini adalah cawan petri,
incubator (Memmert), Autoclaf All
America model 1925/KY-23D, oven
(Fisher Scientific mode 655F), cawan
petri, jarum ose, pipet tetes, micro
pipet, pipet ukur, tabung reaksi, labu
ukur, gelas kimia, erlenmeyer, dan
bunsen, dan alat – alat standar
laboratorium lainnya sesuai prosedur
kerja.
Bahan – bahan yang akan
digunakan dalam penelitian ini
adalah sampel tanah gambut,
Amoxsan® keluaran PT. Sanbe
Farma, Indonesia, Nutrien Agar
Merck (NA), Nutrient Broth Merck
(NB), kristal violet, safranin, lugol
iodin, agar batang, methyl red,
larutan H2O2 3%, larutan
fenildiamina 1%, larutan KOH 40%,
larutan α-naftol, agar batang, asam
sitrat, pepton, K3PO4, yeast ekstrak,
gelatin, NaCl, dekstrosa, KH2PO4,
selulosa, arginin, asparagin, glisin, 2-
nafthol, glukosa, sukrosa, fruktosa,
galaktosa, selobiosa, laktosa, ornitin,
KCl, pati, kasein, MgSO4.7H2O,
NaOH, dan Bahan Lain yang
digunakan adalah sesuai prosedur
kerja.
Deskripsi Lokasi Dan Teknik
Pengambilan Sampel Tanah
Tanah gambut disampling
dari areal Bukit Batu di kawasan
Cagar Biosfer GSKBB, Riau yang
Page 3
terletak di ketinggian 5-10 m dari
permukaan laut. Sampel tanah
diambil dari 1 lokasi yaitu tanah area
transisi. Sampel tanah diambil pada
lapisan permukaan 5 cm dengan
membuang serasah-serasah yang ada
di permukaan tanah. Sampel tanah
diambil untuk 3 kali pengulangan.
Sekitar 3 g sampel tanah dicuplik dan
dimasukkan ke dalam plastik.
Sampel tanah tersebut disimpan pada
suhu 4ºC setelah proses sampling dan
selama transportasi sampel ke
laboratorium.
Isolasi Bakteri
Tanah gambut dilarutkan
dalam akuades steril dengan serial
pengenceran (10-1 sampai 10-4).
Larutan tanah (100 μL) diteteskan
pada permukaan medium nutrien
agar (NA) yang mengandung
Amoksan (2,5 mg.L-1) di dalam
cawan petri, larutan tanah diratakan
dengan menggunakan batang L,
kemudian diinkubasi pada 370C
selama 24-48 jam. Setelah inkubasi
selesai, maka bakteri yang tumbuh
pada medium NA diinokulasi
kembali pada medium NA dengan
berbagai variasi konsentrasi
Ampisilin di dalam cawan petri (5
mg.L-1, 7,5 mg.L-1 dan 10 mg.L-1)
menggunakan metode gores (streak
plate), kemudian diinkubasi pada
suhu kondisi sama sebelumnya yaitu
37ºC selama 24-48 jam untuk
mendapatkan koloni tunggal. Kultur
murni bakteri yang telah diinkubasi
kemudian disubkultur pada media
nutrient agar (cawan petri dan agar
miring) yang akan digunakan untuk
tahap karakterisasi.
Karakterisasi Morfologi
Karakterisasi morfologi
dilakukan dengan pengamatan
struktur makroskopis dan
mikroskopis. Struktur makroskopis
dengan mengamati bentuk koloni,
warna koloni serta bentuk tepi
koloni. Bakteri ditumbuhkan pada
medium NA dan pengamatan
morfologi koloni dilakukan setelah
kultur diinkubasi pada suhu 37oC
selama 18 – 24 jam. Struktur
mikroskopis yang diamati meliputi
bentuk sel dan serta reaksi-reaksi
pengecatan.
Preparat ulas dibuat dengan
mengambil 1 ulasan biakan bakteri
dari nutrient agar miring dengan
menggunakan jarum ose, kemudian
diratakan di atas kaca preparat yang
sudah ditetesi dengan akuades.
Ulasan difiksasi dengan melewatkan
di atas api lampu spiritus hingga
menjadi kering. Selanjutnya ulasan
diberi beberapa tetes kristal violet
dan dibiarkan sekitar 1 menit, lalu
dicuci dengan akuades mengalir,
kemudian ulasan ditetesi dengan
larutan lugol iodine dan dibiarkan
sekitar 1 menit, lalu dicuci dengan
akuades mengalir. Ulasan diberi
larutan pemucat (etanol 96%) setetes
demi setetes hingga tetesan etanol
yang jatuh tidak berwarna, lalu
dicuci dengan akuades mengalir.
Safranin diteteskan di atas ulasan dan
dibiarkan selama 45 detik, lalu dicuci
dengan akuades mengalir. Preparat
Page 4
dikeringkan dengan menempelkan
tisu disisi ulasan, lalu dibiarkan
mengering di udara. Kemudian
preparat diamati di bawah
mikroskop.
Karakterisasi Biokimia
Karakterisasi biokimia yang
dilakukan yaitu uji MR-VP (methil
red-Voges proskauer), methil red,
fermentasi karbohidrat, katalase, dan
oksidase. Pada uji MR-VP, bakteri
umur 24 jam diinokulasi pada kaldu
MR-VP, kemudian diinkubasi pada
suhu 37oC selama 24 jam. Setelah itu
ditambahkan 10 tetes larutan KOH
40% dan 15 tetes larutan α-naftol,
dikocok dan dibiarkan 30 menit. Uji
methil red dilakukan dengan cara
biakan bakteri umur 24 jam
diinokulasikan ke dalam kaldu MR-
VP, diinkubasi pada suhu 37oC
selama 48 jam. Hari berikutnya
ditambahkan reagen metil merah. Uji
fermentasi karbohidrat yang
dilakukan yaitu uji glukosa, uji
laktosa, uji manitol, uji maltosa dan
uji sakarosa. Satu ose isolat bakteri
endofit diinokulasikan pada media
uji fermentasi karbohidrat, kemudian
diinkubasi pada suhu 37°C selama 24
jam. Uji oksidase menggunakan
Oxidase test stick (Liofilchem
Diagnostic). Koloni diambil
sebanyak satu ose dan dioleskan
pada ujung oxidase test stick.
Perubahan warna selama 30 detik
diamati. Uji katalase menggunakan
katalase test stick. Biakan bakteri
umur 24 jam diambil dengan ose dan
diratakan di atas katalase test stick,
 lalu diteteskan sebanyak 2-3 tetes
H2O2 3% di atasnya.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Purifikasi isolat bakteri
diperoleh sebanyak 287 isolat yang
mampu tumbuh dan membentuk
koloni tunggal pada medium nutrien
agar (NA) dengan waktu inkubasi
sekitar 24-48 jam. Adapun asal isolat
yang dipurifikasi berasal dari tanah
gambut hutan primer dengan
kedalaman 5 cm. Gambar 4.1. Dari
287 isolat bakteri ada 3 isolat
berdasarkan ukuran koloni dan
dipilih 1 isolat bakteri untuk
karakterisasi morfologi dan biokimia
yaitu isolat bakteri kode C.
B
C bulat. Berdasarkan uji motilitas
A berbentuk basil ditandai dengan
Gambar 1. Isolasi bakteri dari tanah
gambut.
Pada penelitian ini, tanah
gambut dilarutkan dalam air steril
dengan tujuan agar air yang
digunakan tidak terkontaminasi
senyawa atau bakteri dari luar.
Bakteri dari sampel tanah gambut
diinokulasi dengan metode cawan
sebar (spread plate). Ekstrak tanah
Page 5
gambut diteteskan dalam medium
NA yang mengandung ampisilin (25
mg.L-1) dan ekstrak tanah diratakan
dengan menggunakan batang L.
Inkubasi dilakukan selama 24-48 jam
yang merupakan waktu optimal
pertumbuhan bakteri. Bakteri yang
tumbuh diinokulasi pada medium
NA dengan variasi konsentrasi
ampisilin (50 mg.L-1, 75 mg.L-1, 100
mg.L-1) dengan metode cawan gores
kuadran (streak plate). Bakteri
disubkulturkan pada medium NA
yang baru untuk memperoleh koloni
tunggal bakteri tanah gambut.
Morfologi koloni bakteri
diamati pada medium NA dengan
waktu inkubasi selama 24-48 jam
pada suhu 37 oC. Dari hasil
pengamatan, isolate bakteri memiliki
warna koloni putih krem, tepian
koloni licin, elevasi datar, dan bentuk
bakteri bersifat motil, ditandai
dengan adanya penyebaran garis
pada daerah inokulasi. Hasil
karakterisasi morfologi dapat dilihat
pada Tabel 1. Seluruh isolat bakteri
merupakan bakteri Gram negatif
warna sel menjadi merah muda hasil
dari pewarnaan gram Gambar 2
Analisis biokimia pada isolat
bakteri meliputi uji Voges Proskauer,
uji methyl red, fermentasi
karbohidrat, oksidase, dan katalase
dilakukan di Laboratorium
Kesehatan dan Lingkungan Provinsi
Riau. Hasil analisis disajikan pada
Gambar 3 dan Tabel 2.
Tabel 1. Karakter morfologi koloni Tabel 2 Hasil uji biokimia bakteri
dan sel tanah gambut
N Uji biokimia Isolat bakteri
Karakter Isolat
koloni bakteri o C
Warna koloni Putih 1 Uji MR-VP -
krem
2 Uji methyl -
Tepian Licin
Elevasi Datar red
Bentuk Bulat 3 Uji katalase +
Perwarnaan Gram 4 Uji oksidase +
gram negatif
Bentuk sel Basil 5 Uji glukosa -
Uji motilitas + 6 Uji laktosa -
7 Uji maltosa -
8 Uji sakarosa -
9 Uji manitol -

Pada uji Voges Proskauer dan

Gambar 2. Hasil pewarnaan Gram. uji methyl red, isolat bereaksi
Pembesaran 40x10 negatif. Reaksi negatif uji Voges
Proskauer ditandai dengan tidak
terjadinya perubahan warna pada
medium setelah penambahan larutan
KOH dan α-nafthol (Helmich et al.,
2001). Reaksi negatif uji methyl red
ditandai dengan tidak terjadinya
perubahan warna pada medium
setelah penambahan reagen methyl
red. Pada uji fermentasi kerbohidrat
A
isolat bakteri bereaksi negatif. Reaksi
negatif ditandai dengan tidak
terjadinya perubahan warna medium
pada uji glukosa, uji laktosa, uji
manitol, uji maltosa dan uji sakarosa.
Hal ini menunjukkan bahwa bakteri
yang diuji tidak mampu
B memfermentasi monosakarida pada
Gambar 3. Hasil uji katalase (A). medium tersebut (Tortora, 1998).
Hasil uji oksidase (B). Pada uji katalase dan uji oksidase,

Page 6
seluruh isolat bereaksi positif. Reaksi
positif uji katalase ini
mengindikasikan bahwa isolat-isolat
tersebut mampu mengkatalisis
penguraian hidrogen peroksida
menjadi air dan oksigen dengan
memperlihatkan pembentukan
gelembung udara disekitar koloni.
Reaksi positif pada uji oksidase
ditandai dengan terjadinya perubahan
warna ungu-biru pada Oxidase test
stick.
KESIMPULAN
Dari penelitian ini didapat
isolat LBKURCC87 diisolasi
menggunakan metode cawan sebar
(spread plate) yang merupakan
bakteri alami yang resisten terhadap
ampisilin dengan jenis bakteri Gram
negatif.
DAFTAR PUSTAKA
Allen, D.C., Macalady, K.A.,
Chenchouni, H., Bachelet, D.
2009. A global overview of
drought and heat-induced tree
mortality reveals emerging
climate change risks for
forests. Forest Ecology and
Management. 660–684. New
York: Elsevier B.V.
Budiyanto, M. 2004. Mikrobiologi
Terapan. Malang: UMM
Press.
Devita. 2009. Sinar mas forestry
(SMF) usulkan pembangunan
Cagar Biosfer di Riau.
http://suarakarya-online.com.
[Accessed date: 4 April
2010].
Page 7
Drajat, S. 2006. Konversi lahan
gambut dan perubahan iklim.
www.republika.-com[Tanggal
akses: 28 April 2011].
Pekanbaru.
Helmich, R.L., B.D. Siegfried, M.K.
Sears, D.E. Stanley-Horn,
M.J. Daniels, H. R. Mattila,
T. Spencer, K.G. Bidne, and
L.C. Lewis. 2001. Monarch
larvae sensitivity to Bacillus
thuringiensis purified
proteins and pollen.
Department of Entomology,
University of Nebraska. Vol.
98. No. 21. (11925–11930).
Jawetz, Melnick, & Adelbergs. 2001.
Mikrobiologi Kedokteran.
Jakarta: Salemba Medika.
Misriani, 2013. Pengkajian kualitas
penggunaan antibiotika pada
pasien bedah appendix di
RSUP fatmawati jakarta
tahun 2012. Skripsi. Jakarta:
Universitas Islam Negeri
Syarif Hidayatullah
Pengkajian.
Partomiharjo, T., Sutrisno, H.,
Sadeli, A., Dewanto, G.,
Mulyadi, dan Yitno. 2007.
Keanekaragam hayati Suaka
Marga Satwa Giam Siak
Kecil Blok Tasik Betung dan
Hutan Konversi PT. Arara
Abadi Blok Bukit Batu, Riau.
Laporan Penelitian kerjasama
antara Pusat Penelitian
Bioteknologi LIPI dengan
PT. Sinar Mas Asia Pulp and
Paper. Riau.
Puryantiningsih, R.A. 2009. Isolasi
Streptomyces dari rizosfer
familia poaceae yang
berpotensi menghasilkan
antibiotik terhadap
Escherichia coli. Skripsi.
Surakarta: Universitas
Muhammadiyah Surakarta

Sudarmono, P. 1993. Genetika dan

Resistensi, Buku Ajar
Mikrobiologi Kedokteran,
Edisi Revisi. Jakarta:
Binarupa Aksara.

Tortora, E.G., B. Funice and C.D

case. 1998. Microbiology an
introduction. New York:
Addison Westley Longman
Inc.
Waldrop, M.P. & Firestone, M.K.
2006. Seasonal dynamics of
microbial community
composition and function in
oak canopy and open
grassland soils. Microbial
Ecology. 52 (3): 470-479.

Widjajanti, N. 1989. Obat-obatan.

Yogyakarta: Kanisius.

Page 8