Isolasi dan karakterisasi anoxyphototropic non-sulfur ungu

bakteri dari dua mikroekosistem: tikar mikroba tropis hipersalin

dan bromeliad phytotelmata

K. Soto-Feliciano, M. De Jesús, J. Vega- Sepúlveda dan C. Ríos-Velázquez

Laboratorium Bioteknologi dan Bioprospeksi Mikroba, Departemen Biologi,
Universitas Puerto Riko di Mayaguez,
Mayaguez, Puerto Riko

Bakteri anoxyphototrophic non-sulfur ungu (PNSAB) adalah kelompok gram negatif

yang beragam dan ada di mana-mana mikroorganisme anoxyphototroph dengan anggota
α dan β-Proteobacteria. Grup ini diakui oleh kemampuannya tumbuh di lingkungan
yang beragam, dan diakui oleh fleksibilitas fisiologisnya, dan kepentingan ekologisnya.
Penelitian ini menyajikan laporan pertama PNSAB dalam dua lingkungan mikro yang
kontras: Tropical Micersial Mats Hypersaline di Cabo Rojo Salterns dan phytotelmata
dari bromeliad dari hutan subtropis Puerto Rico. Koloni dengan pigmen kemerahan
karakteristik diisolasi dan dikarakterisasi menggunakan metode mikroskopis, biokimia
dan molekuler. SEBUAH total 49 PNSAB dikarakterisasi: 23 dari tikar mikroba dan 26
dari bromeliad phytotelmata. Sementara mikroba anggota genus Rhodopseudomonas
dan Rhodospirillum hadir di kedua lingkungan mikro, anggota Gen Rhodobacter,
Rhodothalassium dan Rhodovulum hanya ditemukan di tikar mikroba dan
Rhodomicrobium di bromeliads phytotelmata.
Kata kunci: ungu bakteri non-sulfur anoxyphototropic, tikar mikroba, phytotelmata

I. Pendahuluan

Bakteri anoxyphototrophic non-sulfur ungu (PNSAB) memiliki berbagai mode

pertumbuhan dan dapat tumbuh di bawah photoautotrophic, photoheterotrophic dan
chemoheterotrophic kondisi [1]. Kelompok-kelompok mikroba ini adalah kelompok
kosmopolitan yang terletak di badan air di bawah lapisan organisme fotosintesis oksigen
seperti: alga, tanaman air dan cyanobacteria [2]. Mereka juga dapat ditemukan di habitat
seperti: kolam air limbah, sedimen, lembab tanah, kolam air laut, lingkungan hipersalin
[3]. Di habitat ini, PNSAB adalah peserta aktif dalam karbon, siklus nitrogen dan sulfur
[4, 5]. Gen yang terlibat dalam fotosintesis diatur dalam kelompok dan telah
diidentifikasi dan ditandai [6]. Cluster gen ini sebagian besar terdiri dari gen yang
disandikan untuk bacteriochlorophyll, karotenoid, kompleks pemanenan ringan dan
pusat reaksi. Pusat reaksi semua PNSAB disusun oleh struktur protein yang disebut
PUH dan PUF (pigmen binding protein) [7]. Teknik molekuler untuk identifikasi
PNSAB adalah berkembang menggunakan gen pufM; berdasarkan desain dan aplikasi
set primer PCR untuk menilai keanekaragaman hayati, metabolisme aktivitas dan
ekologi dari fototrof ini [8].

Bakteri non-sulfur ungu telah dipelajari dan diisolasi dari ekosistem yang berbeda
seperti perairan dan ekstrim lingkungan. Contoh mikroekosistem ekstrem adalah tikar
mikroba. Tikar dilaminasi sedimen-organo struktur dikelompokkan berdasarkan gradien
oksigen dan sulfida [9]. Komunitas multilayer mikroorganisme prokariotik telah
diturunkan dari komunitas biologis tertua dan paling luas di Bumi; bernama stromatolit
[10]. Tikar yang dibuat oleh organisme fotosintetik menciptakan stromatolit yang paling
banyak dipelajari dalam catatan fosil. Untuk alasan itu, tikar mikroba dapat ditemukan
di lingkungan yang bermusuhan seperti badan air hypersaline [11], mata air panas [12],
kering gurun beriklim sedang dan lingkungan kering yang dingin [13]. Biasanya,
beberapa lapisan diskrit dapat dikenali, diatur secara vertikal, di mana organisme
mendistribusikan diri sesuai dengan persyaratan fisiologis, seperti jumlah cahaya,
oksigen, nutrisi dan suhu. Lapisan atas adalah lapisan hijau berdenominasi, yang
didominasi oleh cyanobacteria dan bakteri organoheterotrophic [9]. Di bawah lapisan
ini, lapisan merah muda ditemukan, yang mengandung anoxyphototropic dan bakteri
surfaktan kemolitotrofik. Lapisan bawah tikar mikroba sering berwarna hitam karena
pengendapan sulfur besi oleh bakteri sulfat dan pereduksi disimilasi [14]. Beberapa tikar
mikroba dianggap sebagai lingkungan akuatik; mereka berdenominasi sementara atau
bentik.

Contoh lain dari lingkungan mikro akuatik adalah bromeliads phytotelmata. Bromeliad
adalah tanaman keluarga Bromeliaceae, disesuaikan dengan sejumlah iklim. Semua
bromeliad terdiri dari susunan spiral cuti kadang-kadang disebut "roset". Basis daun
dalam roset mungkin tumpang tindih dengan erat untuk membentuk mikrohabitat
akuatik yang menyediakan perlindungan bagi beragam organisme [15]. Lingkungan ini
disebut phytotelmata. Phytotelmatas adalah struktur yang dibentuk oleh tanaman non-
akuatik yang menyita air, seperti daun yang dimodifikasi, daun axils, bunga, lubang
batang atau depresi [16]. Air yang terakumulasi pada tanaman ini dapat berfungsi
sebagai substrat dari fauna yang terkait, dan seringkali fauna yang terkait dengan
phytotelmata adalah unik. Berbagai organisme hidup di lingkungan mikro ini seperti:
cyanobacteria, jamur, ganggang hijau, protozoa, ciliata, larva serangga, serangga
akuatik, amfibi dan fecal coliform bakteri [17]. Dalam studi, diwujudkan dalam
phytotelmata bromeliad dari Hutan Tropis El Yunque Puerto Rico, itu menunjukkan
adanya cyanobacteria dan bakteri coliform fecal [18].

Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi bakteri anoxyphototrophic ungu non-sulfur

dari dua lingkungan mikro yang berbeda, tikar dan bromeliads phytotelmata mikroba
tropis hipersalin; dan ciri mereka secara mikroskopis, biokimia dan secara molekuler.
Penelitian ini menunjukkan laporan pertama PNSAB di Tropical Micersial Mats Tropis
di Cabo Rojo Salterns, dan dalam bromeliad phytotelmata berbeda dari hutan subtropis
Puerto Riko.

2. Metode

2.1 Pengayaan dan isolasi bakteri anoksifototrofik non-sulfur ungu

Dua metode berbeda dirancang untuk mengisolasi calon PNSB dari dua ekosistem
mikro: tikar mikroba dan bromeliads phytotelmata. Sampel tikar mikroba dari Cabo
Rojo Salterns dikumpulkan dan dibedah dalam ketiganya lapisan berwarna.
Pengenceran serial dari 10-1 hingga 10-5 dilakukan pada lapisan merah muda dari tikar
mikroba yang disaring air (dikumpulkan dari situs pengambilan sampel). Lapisan merah
muda yang diencerkan disaring melalui Nalgene® Analytical Filter yang melekat pada a
membran nitroselulosa dengan ukuran pori 0,2μm. Membran nitroselulosa ditempatkan
pada cawan Petri marine agar (Difco ™), dan diinkubasi dalam tabung anaerob dari
BBL® polikarbonat yang melekat pada Paket Gas (mengikuti spesifikasi pabrikan)
dengan adanya cahaya pada 28-32 ° C; sampai koloni kemerahan diamati. Koloni merah
(Kandidat PNSB diduga) ditanam dalam kaldu laut anaerob di bawah kondisi
fotosintesis, koloni merah digores ulang untuk pemurnian, kemudian pertumbuhan
dalam medium cair dan penyimpanan pada -80ºC, diikuti oleh karakterisasi lebih lanjut.
Cairan hadir dalam daun aksial bromeliads phytotelmata yang berbeda dikumpulkan
menggunakan pipet steril. Setelah pengumpulan sampel, mereka ditempatkan dalam
botol 4mL yang mengandung media selektif Sistrom 2X (Sistrom, 1960). Itu
sampel ditambahkan ke botol medium Sistrom 2X medium encer ke 1X. Sampel
diinkubasi di bawah kondisi fotosintesis pada 28-32 ° C, sampai sedang berubah merah,
fenomena ini lebih dikenal sebagai "efek mekar". Sampel "mekar" dilukis pada media
padat Sistrom, dan diinkubasi dalam tabung anaerob dengan Paket Gas dalam kondisi
anaerob dan fotosintesis. Koloni yang menunjukkan pigmentasi kemerahan dimurnikan
dan disimpan seperti yang dijelaskan sebelumnya.

2.2 Karakterisasi kandidat PNSAB

2.2.1 Karakterisasi makroskopis dan mikroskopis

Kandidat PNSAB dianalisis secara makroskopik dengan mempertimbangkan fitur-fitur

berikut: pigmentasi koloni, margin, ukuran dan ketinggian koloni [19]. Pigmentasi
PNSAB berkisar dari coklat, merah ke merah-ungu (Munsell Color Chart®). Ukuran
dan bentuk PNSAB ditentukan menggunakan mikroskop cahaya dan Scanning Electron
Mikroskopi (SEM). Kehadiran struktur morfologi, seperti membran eksternal,
ditentukan oleh penegangan Gram [19] Analisis SEM membantu kami untuk memiliki
gagasan yang lebih baik tentang bentuk bakteri. Untuk SEM, bakteri itu diamati
menggunakan JEOL JSM-541 scanning electron microscope. Untuk menganalisis
secara mikroskopis PNSAB, yang terisolasi kandidat ditanam di media masing-masing
selama 48 jam pada 30-32ºC, di bawah anaerob dan fotosintesis kondisi. Kemudian,
sekitar 1,5 mL biakan dipindahkan ke mikrotube dan disentrifugasi selama 1 menit
0,8xg (3.000 rpm) untuk mendapatkan pelet sel. Larutan glutaraldehid [CH2
(CH2CHO) 2] 4% ditambahkan untuk memperbaiki sel pelet dan kemudian dibiarkan
istirahat selama 24 jam pada 4ºC. Pelet sel dicuci dengan 1X Phosphate Buffer Saline
(PBS) tiga kali. Untuk mendehidrasi pelet, persentase alkohol yang berbeda digunakan
(10% -100%). Setiap sepuluh menit itu pelet dipindahkan dari satu persentase alkohol
ke yang lain. Untuk benar-benar mengeringkan sampel, titik kritis menjadi kering
(Critical Point Drying Apparatus Polaron E3000) digunakan. Sputter coater digunakan
untuk menutupi sampel dengan lapisan paladium-emas untuk melindungi dan
meningkatkan konduktivitas sampel kandidat. Parameter yang digunakan untuk
analisis mikroskopis didirikan oleh Scanning Electron Microscopy Center di University
of Puerto Rico, Kampus Mayaguez. Mikrograf elektron diambil pada tegangan
percepatan 15 kV.

2.2.2 Analisis pigmen fotosintesis PNSAB

Untuk menentukan keberadaan pigmen fotosintesis, seperti bakterioklorofil α dan β, dan

pigmen karotenoid, kultur bakteri diencerkan dalam bovine serum albumin (BSA).
Kemudian, seluruh spektrum sel direkam menggunakan UV-Vis spektroskopi dalam
kisaran 380-1100 nm [6]. Spektrum direkam dalam Genesis 2 Thermospectronic®
spektrofotometer.

2.2.3 Analisis molekuler

DNA genom kandidat PNSAB yang diisolasi diekstraksi menggunakan metode yang
dijelaskan oleh Chen dan Kuo (1993) [20]. Secara singkat, kultur bakteri ditanam di
media masing-masing dan diinkubasi selama 48 jam, di bawah anaerob dan kondisi
fotosintesis. Kultur dipindahkan ke mikrotube 1,5 mL dan centrifuge pada 15,7xg
(13.000 rpm) ke dapatkan pelet sel. Lisis sel dilakukan dengan menggunakan buffer lisis
(40mM Tris-asetat pH 7,8, 20mM natrium asetat.

pH 8.0, 1.0mM EDTA pH 8.0 dan 1% SDS) dan 5M natrium klorida, kemudian diolah
dengan RNAse (20 μg / μl) selama 30 menit pada 37ºC. Ekstraksi organik dilakukan
dengan menggunakan satu volume kloroform dan centrifuge pada 15,7xg(13.000 rpm);
langkah ini diulang dua kali. Sampel diendapkan dengan etanol absolut pada -20ºC.
Yang terisolasi genomik DNA diresuspensi dalam 50μL buffer 1X TE (10mM Tris-Cl
pH 8.0 dan 1.0mM EDTA pH 8.0). Setelah semua kandidat DNA diisolasi, amplifikasi
Polymerase Chain Reaction (PCR) dari gen 16S rDNA adalah dilakukan. Amplifikasi
dilakukan menggunakan Green Taq Master Mix (Promega) dan primer bakteri universal
oligos 14-F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ') dan 1492-R
(5'GGTTACCTTGTTACTACGACTT3 ’). Pengikut parameter digunakan untuk reaksi
PCR: denaturalisasi awal pada 95ºC selama 3 menit; kemudian 30 siklus yang termasuk
denaturisasi pada 95ºC selama 1 menit, anil pada 52ºC selama 30 detik dan ekstensi
pada 72ºC selama 1 menit. Final ekstensi dilakukan pada 72ºC selama 10 menit. Juga,
kandidat PNSAB dianalisis dengan amplifikasi PCR gen pufM menggunakan set primer
spesifik: 557-F (5'-CGCACCTGGACTGGAC-3 ') dan 750-R (5'-
CCCATGGTCCAGCGCCAGAA-3 ') [8]. Amplifikasi dimurnikan menggunakan kit
purifikasi PCR (Qiagene). Itu Produk PCR diurutkan berdasarkan fasilitas Macrogen
(New York, AS). Analisis in silico dilakukan dengan menggunakan online basis data
seperti GenBank dan BLAST dari NCBI. Urutan 16S rDNA kandidat PNSAB yang
terisolasi diedit menggunakan alat bioinformatika seperti Chromas Lite 2.0 dan
kemudian diselaraskan dan diedit dengan BioEdit 7.0. Analisis filogenetik dilakukan
menggunakan perangkat lunak MEGA 3.1. Itu model jarak yang digunakan adalah p-
distance dan uji bootstrap filogeni dihitung untuk 2000 ulangan. Itu pohon filogenetik
dibangun dengan metode Neighbor Joining.

3. Hasil

3.1 Isolasi dan karakterisasi PNSAB dari dua lingkungan mikro yang berbeda
Prosedur pengayaan yang digunakan untuk sampel tikar mikroba dari Cabo Rojo
Salterns menghasilkan isolasi 23 Kandidat PNSAB dan metode pengayaan lainnya yang
digunakan untuk phytotelmata menghasilkan isolasi 26 kandidat. PNSAB yang
terisolasi masing-masing ditanam dalam media spesifik cair dan padat, dan
menunjukkan karakteristik kemerahan mekar (Gambar 1 dan Gambar 2). Koloni
menunjukkan bentuk melingkar dan elevasi cembung, seluruh margin dan berbeda
intensitas merah dalam skala warna (Gambar 1 dan 2). Pewarnaan Gram menunjukkan
bahwa semua yang terisolasi adalah gram batang negatif ukuran yang berkisar antara
1,5-3,0μm dan 0,48-0,90μm untuk kedua lingkungan mikro.

Gambar 1. PNSAB terisolasi dari tikar mikroba tropis hipersalin. Setelah menyaring
tikar mikroba yang diencerkan merah berpigmen koloni pada filter nitroselulosa (A).
Dipetik dan diinokulasi dalam media cair hingga menunjukkan karakteristik kemerahan
kemerahan (B). Sampel mekar bergaris-garis, dan koloni dianalisis secara makroskopis
dan mikroskopis (C). Bar di koloni mewakili 1mm, sedangkan di gambar SEM
mewakili 1μm.

Gambar 2. PNSAB yang terisolasi dari bromeliads phytotelmata dari hutan subtropis
Puerto Rico. Setelah menambahkan cairan dikumpulkan dari bromeliads phytotelmata
ke media selektif Sistrom, dan diinkubasi dalam kondisi fotosintesis (A), mekar sampel
dilesat dalam medium padat (B) dan koloni dianalisis secara makroskopis dan
mikroskopis (C). Bar di koloni mewakili 1mm, sedangkan di gambar SEM mewakili
1μm.

3.2 Analisis pigmen fotosintesis

Analisis pigmen fotosintetik menggunakan spektroskopi UV-Vis menunjukkan puncak

serapan sel keseluruhan dari 300 nm ke 1100 nm. Karakteristik sinyal bakterioklorofil
ditemukan pada puncak 805 nm dan 865 nm. Pigmen karotenoid dari seri spirilloxantin
ditemukan karena puncak absorbansi pada 492, 515 dan 549 (karakteristik ungu non-
sulfur bakteri).
Gambar 3. Spektrum serapan keseluruhan dari sampel bakteri non-sulfur
anoxyphototrophic ungu terisolasi dari lingkungan mikro diuji. Spektrum serapan
seluruh sel dilakukan dari 300nm hingga 1100nm. Empat bakteri yang terisolasi
menunjukkan puncak penyerapan karakteristik pigmen fotosintetik dalam 492, 515 dan
549nm (pigmen karotenoid) dan pada 805 dan 865nm untuk
bakterioklorofil a.

3.3 Analisis molekuler

Kehadiran gen pufM terdeteksi oleh PCR di semua sampel yang terisolasi di kedua
lingkungan mikro. Di Analisis silico yang dilakukan pada 16S rDNA menunjukkan
adanya bakteri non-sulfur ungu dari genus Rhodopseudomonas dan Rhodospirillum
untuk kedua lingkungan. Sebaliknya, genus Rhodobacter, Rhodothalassium dan
Rhodovulum hanya ada di tikar mikroba dan genus Rhodomicrobium hanya ada di
phytotelmata bromeliad. Sebuah pohon filogenetik dibangun dengan urutan 16S rDNA
(715pb) menunjukkan hubungan evolusi antara kandidat yang terisolasi dari tikar
mikroba dan phytotelmata ke kelompok bakteri lainnya. Pohon filogenetik yang
dihasilkan menunjukkan bahwa mayoritas yang terisolasi didasarkan pada lingkungan
mikro. Dalam kasus tikar mikroba, dua belas terisolasi mirip dengan Rhodothalassium
(MM19, MM14, MM21, MM13, MM4, MM11, MM16, MM22, MM10 dan MM20),
enam ke Rhodobacter (MM15, MM2 dan MM5) dan satu ke Rhodovulum. Untuk
bromeliads phytotelmata delapan terisolasi mirip dengan Rhodopseudomonas (BP2,
BP9, BP6, BP1, BP3, BP11, BP4 dan BP7). Sebanyak delapan sampel tidak
memungkinkan hubungan dengan PNSAB dikenal, menyarankan kemungkinan menjadi
genus baru.

Gambar 4. Analisis filogenetik dari bakteri anoxyphototrophic ungu non-sulfur.

Generasi pohon konsensus adalah dibuat dengan metode Neighbor-Joining dan pohon
terakhir dibangun dengan menggunakan MEGA 3 Tree Explorer. Pohon itu berdasarkan
715 posisi nukleotida gen 16S rDNA. Angka dalam node adalah nilai bootstrap. Bilah
skala menunjukkan jumlah substitusi per posisi nukleotida (0,05). Semua urutan dimulai
dengan MM mengacu pada tikar mikroba dan BP ke bromeliad
phytotelmata.

4. Diskusi

Tujuan utama dari penelitian ini adalah untuk mengisolasi dan mengkarakterisasi
bakteri anoksifototrofik non-sulfur ungu dua lingkungan mikro yang berbeda. Dua
teknik pengayaan yang berbeda digunakan untuk mengisolasi kelompok bakteri. Ini
tekniknya mirip dengan teknik isolasi yang digunakan oleh Imhoff dan Caumette pada
2004 [21]. Kedua teknik itu efisien, karena mereka menyediakan sumber karbon non-
fermentasi seperti CO2 (photoautotroph) malat dan suksinat (photoheterotroph), penting
untuk fisiologi bakteri dan donor elektron yang dibutuhkan kelompok bakteri ini
untuk menjalani fotosintesis anoksigenik. Sebanyak 23 dan 26 kandidat PNSAB
diisolasi dari tikar mikroba dan phytotelmata, masing-masing. Jika dibandingkan pada
tingkat keanekaragaman, MM menunjukkan empat filogen dan BP setidaknya enam
filotipe. Perbedaan ini disebabkan oleh jumlah genera bromeliad yang berbeda dan
jumlah sampel hutan. Secara morfologis, salah satu karakteristik penting PNSAB adalah
pigmentasi kemerahan yang mengindikasikan adanya dari pigmen fotosintesis
(karotenoid dan bacteriochlorophyll) [22]. Pigmen ini dapat dideteksi spektrofotometri
(Gambar 4) karena struktur kimianya yang khas. Pigmen fotosintesis hadir di PNSAB
bisa berupa bakterioklorofil a, b atau keduanya. Bakteri yang diisolasi dalam penelitian
ini menunjukkan karakteristik kemerahan mekar dalam kondisi anoksi-fotosintesis dan
keberadaan hanya bakteriichophoph a (805-1040nm) dan pigmen karotenoid (435-
590nm), khususnya seri spirilloxantin [23, 24]. Peralatan fotosintesis di ini organisme
dikendalikan melalui suatu kluster gen yang pada dasarnya menyusun gen yang
disandikan untuk bakterioklorofil, pigmen karotenoid, kompleks pemanenan ringan dan
pusat reaksi (puh, puf, dan puc) [25].

Secara molekuler, teknik yang sering digunakan untuk menentukan apakah bakteri
memiliki alat fotosintesis anoksigenik kehadiran gen yang dikodekan protein pengikat
pigmen, yang dikenal sebagai pufM [7]. Kehadiran gen pufM adalah ditentukan oleh
PCR menggunakan desain spesifik primer pufM oleh Achenbach [8]. Di kedua
lingkungan mikro, keberadaan gen pufM terdeteksi mengindikasikan bahwa komponen
mesin fotosintesis anoksigenik ini ada. Analisis molekuler diselesaikan dengan analisis
in silico dan filogenetik menggunakan urutan 16S rDNA dari isolat. Analisis in silico
menunjukkan keberadaan anggota genera Rhodopseudomonas dan Rhodospirillum
untuk kedua lingkungan mikro; tetapi hanya genus Rhodobacter, Rhodothalassium dan
Rhodovulum hadir dalam MM. Dalam kasus Rhodomicrobium genus ini hanya
ditemukan di BP. Pohon filogenetik menunjukkan suatu hubungan evolusi antara
PNSAB yang terisolasi dan bakteri non-sulfur ungu lainnya yang telah ada dijelaskan.
Seperti yang ditunjukkan dalam analisis filogenetik ada tiga cabang utama; cabang
pertama didominasi oleh PNSAB diisolasi dari MM, yang kedua dengan isolat dari BP
dan yang ketiga kombinasi keduanya. Sementara sebagian besar anggota bakteri yang
ada di cabang pertama telah menjelaskan untuk lingkungan hipersalin [1, 26]. Itu
anggota cabang kedua adalah mikroorganisme yang lebih banyak ditemukan di mana-
mana, juga ditemukan di lingkungan perairan [27].

Pohon filogenetik telah dihasilkan menggunakan hampir memiliki urutan urutan 16S
rDNA (715bp), 23% dari yang diisolasi dari BP dapat mewakili genus baru. Sebagian
besar penelitian dilakukan ke bromeliad phytotelmata bersifat ekologis dan pada tingkat
makroskopis. Sebaliknya, ada studi mikrobiologis (bakteri) yang langka. Selama
penelitian ini, bakteri ungu non sulfur anoxyphototrophic telah diisolasi dan
diidentifikasi dari dua lingkungan mikro yang kontras: tikar mikroba dan bromeliad
phytotelmata tropis hipersalin. Biasa juga PNSAB khas untuk setiap lingkungan mikro
juga ditemukan. Meskipun ini adalah laporan pertama PNSAB di tikar di Puerto Riko,
setahu kami tidak ada laporan taksonomi sebelumnya dalam literatur PNSAB di
bromeliad phytotelmata.