Dhayanithy dkk.

Mikrobiologi BMC (2019) 19:22

https://doi.org/10.1186/s12866-019-1386-x

ARTIKEL PENELITIAN Akses terbuka

Keanekaragaman dan aktivitas biologis

berhubungan dengan jamur endofit
Catharanthus roseus
Geethanjali Dhayanithy, Kamalraj Subban dan Jayabaskaran Chelliah *

Abstrak

Latar Belakang: Penelitian ini melibatkan keanekaragaman dan bioaktivitas komunitas jamur endofit
Catharanthus roseus mendiami wilayah pesisir. Studi ini dilakukan dengan hipotesis bahwa komunitas mikroba di wilayah pesisir akan
mentolerir berbagai cekaman abiotik seperti salinitas, kelembaban, suhu dan komposisi tanah, serta dapat menghasilkan metabolit
baru, yang mungkin memiliki sifat bioaktif. Oleh karena itu dalam penelitian ini, sitotoksisitas dan potensi pembersihan radikal bebas
dari ekstrak organik jamur telah diselidiki. Selain itu, apoptosis dan potensi antioksidan dari jamur yang menunjukkan aktivitas terbaik
dalam penyaringan awal juga telah dibuktikan.

Hasil: Dua puluh isolat jamur endofit diperoleh dari berbagai bagian tanaman, dan diidentifikasi menggunakan analisis wilayah spacer yang
ditranskripsikan secara internal. Berdasarkan frekuensi kolonisasi ditemukan marga yang dominan Colletotrichum, Alternaria dan Chaetomium dengan
frekuensi kolonisasi% masing-masing sebesar 8,66, 7,00 dan 6,33.
Teramati bahwa keanekaragaman dan kekayaan spesies tertinggi pada kulit kayu diikuti oleh daerah daun dan batang tanaman. Pada skrining
ekstrak etil asetat jamur untuk sitotoksisitas terhadap sel HeLa, Chaetomium nigricolor Ekstrak menunjukkan aktivitas sitotoksik kuat 92,20%
pada 100 μ gmL - 1 konsentrasi. Perbandingan antara ekstrak organik yang berbeda (etil asetat, kloroform, diklorometana dan heksana) dari Chaetomium
nigricolor
miselium dan filtrat kultur, diamati bahwa miselium serta ekstrak etil asetat filtrat kultur dan ekstrak heksana filtrat kultur
menunjukkan potensi sitotoksik yang signifikan terhadap sel HeLa dan MCF-7. Potensi induksi apoptosis dan membran
mitokondria dari Chaetomium nigricolor Ekstrak etil asetat juga telah dibuktikan dalam penelitian ini. Selanjutnya penapisan
potensi antioksidan ekstrak jamur etil asetat menggunakan uji pemulungan DPPH menunjukkan bahwa Chaetomium nigricolor

ekstrak menunjukkan aktivitas potensial dengan EC yang signifikan 50 nilai 22 μ gmL - 1. Ekstrak etil asetat dari
Chaetomium nigricolor juga menunjukkan potensi pembersihan radikal superoksida.

Kesimpulan: Hasil ini menunjukkan bahwa terdapat beragam populasi jamur endofit yang menghuni Catharanthus roseus. Salah satu isolat jamur Chaetomium
nigricolor menunjukkan potensi sitotoksik, apoptosis dan antioksidan yang signifikan.

Kata kunci: Jamur endofit, Catharanthus roseus, Aktivitas sitotoksik, aktivitas apoptosis, Chaetomium nigricolor,
Kanker, Potensi antioksidan

* Korespondensi: cjb@biochem.iisc.ernet.in
FA-06, Departemen Biokimia, Institut Sains India, Bangalore, Karnataka 560 012, India

© Penulis. 2019 Akses terbuka Artikel ini didistribusikan di bawah persyaratan Lisensi Internasional Creative Commons Attribution 4.0 ( http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
), yang mengizinkan penggunaan, distribusi, dan reproduksi tidak terbatas dalam media apa pun, asalkan Anda memberikan kredit yang sesuai kepada penulis asli
dan sumbernya, memberikan tautan ke lisensi Creative Commons, dan menunjukkan apakah ada perubahan. Pengabaian Dedikasi Domain Publik Creative
Commons ( http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/ ) berlaku untuk data yang tersedia dalam artikel ini, kecuali dinyatakan lain.
Dhayanithy dkk. Mikrobiologi BMC (2019) 19:22
Latar Belakang
Endofit merupakan mikroorganisme yang umumnya berada di dalam
tumbuhan tanpa menimbulkan gejala penyakit apapun [ 1 ]. Mikroorganisme
ini berinteraksi dengan tanaman inang, dan pada gilirannya, tanaman
sampai batas tertentu memodulasi proses metabolisme endofit ini untuk
menghasilkan molekul yang dapat mewujudkan fungsi perlindungan
terhadap mikroba dan inang [ 2 ]. Mikroorganisme endofit juga menunjukkan
interaksi antarspesies melalui sinyal kimia [ 2 ] dan molekul pemberi sinyal ini
terkadang menjadi penting untuk inang ' kebugaran kelangsungan hidup.
Baru-baru ini, jamur endofit telah mendapatkan dorongan karena potensinya
yang sangat besar untuk menghasilkan banyak sekali metabolit yang
penting secara medis [ 3 - 7 ]. Oleh karena itu, mengeksplorasi jamur endofit
yang menghuni spesies tanaman dengan khasiat obat akan memberikan
banyak peluang untuk menemukan metabolit baru dengan potensi
bioaktivitas [ 8 - 10 ].
Catharanthus roseus (C. roseus), ramuan yang tersebar luas adalah
tanaman asli daerah subtropis dan termasuk dalam keluarga
Apocynaceae. Tanaman ini merupakan penghasil beberapa metabolit
sekunder dan sejauh ini sekitar 130 alkaloid saja telah diidentifikasi [ 11 ].
Tanaman ini dikenal dengan berbagai potensi obat mulai dari antikanker,
antidiabetik, antihipertensi, antibakteri, antijamur dan efek antioksidan [ 12 -
14 ]. Tanaman ini secara tradisional digunakan dalam pengobatan
demam, rematik dan kelelahan. Tanaman juga memiliki sifat pembekuan
darah [ 11 ]. Beberapa senyawa fenolik tanaman telah dicatat
menunjukkan potensi antioksidan in vitro [ 15 ]. Vincristine dan vinblastine
adalah dua alkaloid indol penting yang diisolasi dari tanaman ini dan
digunakan untuk mengobati leukemia dan Hodgkin. ' limfoma [ 16 ]. Laporan Isolasi jamur endofit dari C. roseus dilakukan dengan menggunakan protokol
sebelumnya telah menunjukkan bahwa endofit yang berada di dalam
tanaman ini berpotensi menghasilkan metabolit khusus inang, vincristine
dan vinblastine [ 17 - 19 ]. Baru-baru ini telah dilaporkan bahwa ekstrak
organik dari jamur endofit yang menghuni C. roseus tanaman
menunjukkan sitotoksisitas yang signifikan terhadap garis sel yang dipilih
[ 20 ]. Apalagi dari jamur endofit C. roseus
juga telah dilaporkan menghasilkan beberapa senyawa baru dengan
aktivitas sitotoksik potensial [ 21 ]. Aktinomisetes endofit yang menghuni C.
roseus tanaman juga telah terkenal karena aktivitas antioksidannya [ 22 ].
Sejauh ini, hanya ada satu laporan studi yang melibatkan
keanekaragaman populasi endofit dari C. roseus, di mana penulis telah
menjelajahi komunitas endofit
C. roseus mendiami wilayah utara India [ 23 ]. Jamur endofit adalah
sumber tak terbatas untuk metabolit baru dan endofit dari tanaman yang
tumbuh di relung ekologi khusus dapat memiliki kemampuan untuk
menghasilkan banyak sekali metabolit sekunder. Diduga jamur endofit
yang berada di dalam tanaman ini diperoleh dari daerah salinitas tinggi
akan mampu menghasilkan berbagai jenis metabolit sekunder bioaktif
untuk melindungi.
Halaman 2 dari 14
tanaman inang dari cekaman abiotik yang diinduksi salinitas [ 24 , 25 ] dan
metabolit ini mungkin memiliki khasiat obat. Oleh karena itu, dalam penelitian
ini, kami memilih untuk mengisolasi jamur endofit C. roseus ditanam di
Mahabalipuram, Chennai, yang merupakan lokasi geografis dengan salinitas
tinggi, pelajari keanekaragamannya dan saring mereka untuk produksi
antikanker baru dan metabolit sekunder antioksidan.
Metode
Komposisi media cair dan padat
Semua media disiapkan dalam air suling ganda dan diautoklaf pada 121 °
C selama 20 - 30 menit tergantung volume. PH media diatur menjadi 6,8 ±
2. Satu liter setiap media terdiri dari bahan berikut bersama dengan
streptomisin pada konsentrasi 250mg L - 1.
1) Kaldu medium-1 yang dimodifikasi (M-1D) B: 30 g sukrosa, 5 g
amonium tartrat, 0,5 g ekstrak ragi, 1 g soytone,
280 mg Ca 2 ( TIDAK) 3, 80mg KNO 3, 60mg KCL, 360 mg MgSO 4, 20mg NaH 2
PO 4, 1.4mg H. 3 BO 3, 5 mg MnSO 4,
2.5mg ZnSO 4, 0,7 mg KI; 2) Potato dextrose broth (PDB): 200 g infus
kentang dan 20 g dekstrosa;
3) Sabouraud broth (SDB): 40 g dekstrosa dan 10 g pepton; 4) Kaldu
hara (NtB): 5,0 g pepton, 2,0 g ekstrak ragi, 5,0 g NaCl. Komposisi ini
masing-masing media dengan
1,5% agar disajikan sebagai media padat.
Pengumpulan bahan tumbuhan dan isolasi jamur endofit dari C.
roseus
yang sama seperti yang disebutkan dalam laporan sebelumnya [ 26 ]. Dua
puluh daun, sepuluh sampel batang, enam sampel akar dan dua puluh sampel
kulit batang yang digunakan untuk isolasi jamur endofit diperoleh dari C.
roseus
tanaman ditemukan di daerah pesisir Mahabalipuram (12.6269 ° LU,
80.1927 ° BT), Tamil Nadu, India. Sampel yang terkumpul dicuci dengan
air, dan dipotong kecil-kecil berukuran 5 mm. Eksplan kemudian dicuci
selama 2 menit dalam setiap larutan sterilisasi yaitu, etanol 70%, dan
natrium hipoklorit 0,1% dan akhirnya dengan air suling ganda yang
diautoklaf selama 2 menit. Selanjutnya sampel diolesi dengan kertas
saring steril. Fragmen eksplan yang disterilkan permukaan ditempatkan di
cawan Petri (10 segmen di setiap cawan Petri) yang mengandung PDA
yang diubah dengan streptomisin pada konsentrasi 250 mg L - 1 untuk
mencegah kontaminasi bakteri. Setelah jamur endofit terlihat dari tepi
eksplan, ujung hifa dari jamur endofit yang baru muncul dipindahkan
menggunakan forsep ke pelat PDA baru dan dipertahankan lebih lanjut.
Identifikasi, frekuensi kolonisasi dan analisis filogenetik jamur endofit
Isolat jamur diidentifikasi dengan karakteristik morfologi dan juga dengan
sekuensing internal
Dhayanithy dkk. Mikrobiologi BMC (2019) 19:22 Halaman 3 dari 14

transcribed spacer (ITS) masing-masing isolat. DNA genom diisolasi
menggunakan protokol yang sama seperti yang disebutkan sebelumnya [ 27 Keragaman jamur endofit yang menghuni C. roseus
]. Amplifikasi PCR genom jamur wilayah ITS 1 dan 2 dilakukan
menggunakan primer berikut: ITS1- Forward primer
(TCCGTAGGTGAACCTGCGG) dan primer ITS4- Reverse
(TCCTCCGCTTATTGATATG
C) menggunakan campuran reaksi yang sama dan kondisi amplifikasi
seperti yang disebutkan sebelumnya [ 28 ]. Produk PCR secara langsung
diurutkan oleh Xceleris Corporation menggunakan primer yang sama.
Urutan wilayah ITS dibandingkan dengan urutan spesies yang ada di
GenBank menggunakan software BLASTN. Urutan dan nomenklatur
masing-masing spesies diserahkan ke GenBank (nomor aksesi
ditunjukkan pada Tabel 1 ). Frekuensi kolonisasi (CF)% tiap jamur endofit
yang diisolasi C. roseus
tanaman dihitung menggunakan rumus (Nf / Nt) × 100,
dimana N f adalah jumlah segmen yang dijajah oleh setiap isolat dan Nt
adalah jumlah total segmen [ 26 ].
Urutan ITS yang mirip dengan urutan isolat ITS yang digunakan dalam
penelitian diperoleh dari GenBank melalui analisis BLASTn. Urutan
menjadi sasaran beberapa perataan urutan dengan menggunakan
perangkat lunak CLUSTAL [ 29 ] dan selanjutnya celah dihapus dari
urutan. Urutan yang sangat relevan digunakan untuk pembangunan
pohon filogenetik menggunakan kesederhanaan maksimum melalui
MEGA 4 [ 30 ] perangkat lunak. Amanita muscaria dan
Sporendocladia bactrospora digunakan sebagai grup keluar.
Perhitungan keragaman jamur
dievaluasi menggunakan indeks yang berbeda seperti Simpson ' Dominasi
(D), Simpson ' Indeks keragaman (1- D), Shannon ' indeks keragaman,
Kemerataan, Menhinick ' Indeks s (Dmn), Margalef ' Kekayaan (Dmg),
Kesetaraan ' J, ' Dominasi Berger Parker dan Dominasi Berger Parker
terbalik [ 31 - 33 ].
Pertumbuhan jamur endofit dan ekstraksi metabolit sekunder
Jamur endofit diinokulasi dalam labu 500mL yang berisi 200 mL PDB dan
diinkubasi di tempat gelap pada suhu 30 ° C selama 21 hari. Empat
sumbat agar (diameter 9 mm) yang mengandung miselia digunakan
sebagai inokulum. Setelah 21 hari, biakan disaring melalui 2 lapis kain
katun tipis untuk memisahkan miselia dan filtrat kultur. Miselia yang
dipanen, dikeringkan pada suhu 50 ° C semalaman dan berat keringnya
ditentukan. Miselia yang telah dikeringkan kemudian diekstraksi dengan
menggunakan nitrogen cair dan diekstraksi dengan etil asetat volume 5X
sedangkan filtrat kultur diekstraksi menggunakan volume 2X etil asetat.
Fasa organik dipisahkan menggunakan corong pisah dan diuapkan
sampai kering menggunakan rotary evaporator vakum pada suhu 45 ° C.
Residu ditimbang dan dilarutkan
0,02% DMSO dan digunakan untuk eksperimen kultur sel lebih lanjut.
Untuk uji antioksidan, residu dilarutkan dalam metanol dan digunakan.

Tabel 1 Jamur endofit diisolasi dari berbagai bagian C. roseus menanam

Isolasikan nomor Isolasikan kode aksesi no Pertandingan terdekat % Identitas

1 KY659059 Lasiodiplodia theobromae 100

2 KY659064 Cophinforma mamane 99

3 KY659061 Fusarium decemcellulare 99

4 KY659060 Colletotrichum capsici 99

5 - Tidak teridentifikasi -

6 - Tidak teridentifikasi -

7 KY659069 Lasiodiplodia theobromae 99

8 - Tidak teridentifikasi -

9 KY659068 Fusarium solani 98

10 KY659067 Lasidiplodia theobromae 100

11 KY659054 Chaetomium nigricolor (Juga dikenal sebagai Amesia nigricolor) [ 46 ] 99

12 KY659066 Lasiodiplodia theobromae 99

13 KY659065 Lasiodiplodia theobromae 100

14 KY659058 Colletotrichum sp. 99

15 KY659063 Strain Phoma putamium 99

16 KY659057 Lasiodiplodia theobromae 100

17 KY659062 Lasiodiplodia theobromae 99

18 KY659056 Alternaria longipes 100

19 KY659055 Colletotrichum 99

20 - Tidak teridentifikasi -
Dhayanithy dkk. Mikrobiologi BMC (2019) 19:22
Optimasi pelarut untuk ekstraksi metabolit sekunder
Empat sumbat agar (diameter 9 mm) Chaetomium nigricolor (C. nigricolor) diinokulasi
X 10 5 sel) per sumur ditanam per sumur di piring 24 sumur untuk semalaman.
dalam 200 mL media M-1 dB (media pertumbuhan di mana C. nigricolor menghasilkan
Sel HeLa kemudian dirawat dengan 10 μ gmL - 1, 25 μ gmL - 1 dan 50 μ gmL - 1 dari
metabolit dengan sitotoksisitas terbaik - lihat File tambahan 1; Tabel S1)
diinkubasi dalam gelap pada suhu 30 ° C dalam kondisi statis dan
difermentasi selama 21 hari. Setelah 21 hari kultur yang difermentasi
dipanen dan diekstraksi menggunakan protokol yang sama seperti yang
disebutkan di atas, menggunakan empat pelarut berbeda yaitu etil asetat
(EA), kloroform, heksana dan diklorometana. Ekstrak dikeringkan
sepenuhnya dan dilarutkan dalam 0,02% DMSO untuk digunakan lebih
lanjut dalam percobaan kultur sel.
Garis dan pemeliharaan sel kanker manusia
Garis sel HeLa (Human cervical adenocarcinoma), MCF-7 (Human breast
adenocarcinoma) dan HEK 293 T (sel ginjal embrio manusia non kanker)
dibeli dari National Center for Cell Sciences (NCCS), Pune, India. Kedua
jalur sel tersebut ditumbuhkan menggunakan Dulbecco ' s dimodifikasi
Eagle ' s medium (DMEM) ditambah dengan 10% fetal bovine serum
(FBS). Media dilengkapi dengan penisilin (100 IUmL - 1) dan streptomisin
(100 IUmL - 1). Garis sel dipertahankan dalam hu-
midifikasi 5% CO 2 atmosfer pada 37 ° C.
Uji sitotoksisitas
Ekstrak jamur dievaluasi sitotoksisitasnya dengan uji MTT [ 34 ]. Sel
kanker dipertahankan dalam media DMEM. Kira-kira 4000 sel / sumur
disemai ke dalam setiap sumur dari 96-lubang sumur dan dibiarkan
menyesuaikan diri semalaman. Sel kanker kemudian dirawat dengan
ekstrak kasar jamur (100 μ gmL - 1 ekstrak EA digunakan untuk skrining
awal dari semua isolat untuk mengevaluasi sitotoksisitas mereka dan
untuk menguji sitotoksisitas ekstrak pelarut organik yang berbeda dari C.
nigricolor 5,
10, 15, 25, 50 dan 100 μ gmL - 1 konsentrasi ekstrak digunakan) selama 24 jam.
Durasi pasca perawatan, 20 μ L dari 5mgmL - 1 larutan MTT (disiapkan dalam
PBS) ditambahkan ke masing-masing sumur dan selanjutnya diinkubasi selama
2 jam. 100 μ L DMSO ditambahkan ke masing-masing sumur untuk melarutkan
kristal formazan ungu dan densitas optik (OD) diukur pada 595 nm
menggunakan pembaca pelat mikro (Molecular devises, USA). Persentase
penghambatan pertumbuhan yang ditunjukkan oleh sel kanker pada
pengobatan dengan ekstrak kasar dievaluasi menggunakan rumus,
penghambatan pertumbuhan (%) = [1- [OD dari sel yang diobati / OD dari sel
yang tidak diobati] × 100]. Vincristine (2 μ gmL - 1) digunakan sebagai kontrol
positif.
Pengukuran potensi membran mitokondria menggunakan pewarnaan JC-1
Perubahan potensial membran mitokondria adalah
ditentukan oleh JC-1 (5,5 ′, 6,6 ′ - tetrakloro-
Halaman 4 dari 14
1,1 ′, 3,3 ′ - tetraethylbenzimidazolcarbocyanine iodide) pewarnaan mengikuti
prosedur seperti yang dijelaskan dalam laporan sebelumnya [ 35 ]. Sel HeLa (1
ekstrak EA C. nigricolor selama 24 jam. Pasca perawatan,
0.2 μ Pewarna M JC-1 ditambahkan ke sel yang tidak diberi perlakuan dan sel yang
diberi perlakuan, diinkubasi dalam gelap selama sekitar 37 ° C selama 15 menit. Sel-sel
tersebut kemudian dipanen, dicuci dua kali dengan PBS dan dianalisis menggunakan
instrumen FACS (VERSE). Data diplot menggunakan software FACS DIVA. 2,4 DNP
digunakan sebagai kontrol positif.
Annexin V FITC / PI flow cytometry
Sitometri aliran Annexin V FITC / PI dilakukan untuk mengevaluasi apakah
ekstrak EA dari C. nigricolor menginduksi apoptosis dalam sel HeLa
menggunakan protokol yang disebutkan oleh Miller et al [ 36 ]. Sel HeLa
diunggulkan di piring 24-sumur dengan kepadatan 1 X 10 5 sel per sumur.
Sel-sel dibiarkan menyesuaikan diri semalaman, selanjutnya diperlakukan
dengan 10 sel μ g mL - 1 dan 25 μ g mL - 1 dari ekstrak EA C. nigricolor selama
24 jam. Sel-sel tersebut kemudian diwarnai dengan 1 μ L pewarnaan
Annexin V-FITC, dan
0,5 μ g mL - 1 pewarnaan propidium iodida (PI). Sel yang diwarnai selanjutnya
dianalisis menggunakan sitometer aliran FACS Verse (Becton Dickinson, USA)
menggunakan eksitasi ( λ ex) / emisi ( λ em) sebesar 488/520 nm untuk
AnnexinV-FITC dan 540/630 nm untuk propidium iodida dan dianalisis
menggunakan perangkat lunak FACS DIVA.
Uji pembersihan radikal bebas
Aktivitas pembersihan radikal bebas dari ekstrak organik jamur diukur
dengan uji DPPH [ 37 , 38 ]. Singkatnya, ke 200 μ L larutan DPPH 0,1mM
(dibuat dengan melarutkan DPPH dalam etanol) konsentrasi ekstrak EA
yang berbeda (0, 10, 25, 50, 100 dan 200 μ g mL - 1) ditambahkan, diaduk
dengan kuat dan diinkubasi selama 30 menit dalam gelap pada suhu
kamar. Pasca inkubasi, absorbansi diukur pada 517 nm menggunakan
microplate reader dengan etanol sebagai blanko. Persentase potensi
pemulungan radikal
tial dihitung menggunakan rumus = (1- (Abs ( 517 nm) dari
sampel / Abs ( 517 nm) dari kontrol)) × 100. Asam askorbat pada konsentrasi
5, 15, 25, 50 dan 100 μ gmL - 1
digunakan sebagai kontrol positif.
Aktivitas pembersihan anion superoksida
Untuk campuran 1 mL larutan Nitroblue Tetrazolium (150 μ M NBT) dan 1
ml NADH (468 μ M dalam 100 mM PBS), konsentrasi ekstrak EA berbeda
(0,10, 25,
50, 100 dan 200 μ g mL - 1) dari C. nigricolor ditambahkan, dan reaksi
dimulai dengan menambahkan 100 μ l larutan phenazine methosulphate
(PMS) (60mM PMS dalam 100 mM buffer fosfat, pH 7,4) dan selanjutnya
diinkubasi pada suhu 25 ° C selama 5 menit. Absorbansi pada 560 nm
tadi
Dhayanithy dkk. Mikrobiologi BMC (2019) 19:22
diukur terhadap larutan PBS yang digunakan sebagai blanko. Persentase
potensi pemulungan radikal anion superoksida
dihitung menggunakan rumus = (1- (Abs ( 560 nm) dari
sampel / Abs ( 560 nm) dari kontrol)) × 100 [ 39 ]. Asam askorbat pada
konsentrasi 50 μ g mL - 1 digunakan sebagai
kontrol positif.
Uji pembersihan radikal hidroksil
Untuk campuran 100 μ M FeCl 3, 100mM EDTA, 3,75mM
2-deoksiribosa, dan 1mM H. 2 HAI 2 konsentrasi yang berbeda (0, 10, 25, 50,
100 dan 200 μ gmL - 1) dari C. nigricolor EA
ekstrak ditambahkan. Campuran diinkubasi pada 37 ° C selama 1 jam.
Setelah inkubasi ditambahkan 1mL 2% TCA (Asam Trikloroasetat) dan
1% TBA (Asam Thiobarbiturat), dan selanjutnya diinkubasi dalam
penangas air mendidih selama 15 menit. Setelah pendinginan, campuran
disentrifugasi dan absorbansi diukur pada 535 nm. Persentase potensi
pembersihan radikal hidroksil dihitung dengan menggunakan
rumusnya = (1- (Abs ( 535 nm) dari sampel / Abs ( 535 nm)
dari kontrol)) × 100 [ 38 ]. Asam askorbat pada konsentrasi
jumlah 50 μ gmL - 1 digunakan sebagai kontrol positif.
Uji pembersihan oksida nitrat
Sampai 150 μ L natrium nitroprusside, konsentrasi berbeda (0, 10, 25, 50,
100 dan 200 μ gmL - 1) ekstrak EA dari
C. nigricolor telah ditambahkan. Campuran reaksi ini diinkubasi selama
150 menit. Masa pasca inkubasi, 200 μ L reagen Greiss ditambahkan dan
absorbansi terbaca pada 546 nm. Persentase potensi pemulung oksida
nitrat
tial dihitung menggunakan rumus = (1- (Abs ( 546 nm) dari
sampel / Abs ( 546 nm) dari kontrol)) × 100 [ 40 ]. Asam askorbat pada
konsentrasi 50 μ gmL - 1 digunakan sebagai
kontrol positif.
Analisis statistik
Data untuk uji sitotoksisitas dan antioksidan disajikan sebagai sarana ±
standar deviasi (SD) untuk setidaknya dua percobaan independen
(masing-masing dilakukan dalam rangkap tiga), dan cara yang diobati dan
tidak diobati dianalisis untuk perbedaan yang signifikan secara statistik
menggunakan Uji t Student menggunakan Grafik Pad Perangkat lunak Prism
7. P. nilai juga dihitung untuk hal yang sama. Data untuk pengukuran potensi
membran mitokondria menggunakan pewarnaan JC-1 dan percobaan
sitometri aliran lampiran V FITC / PI dinyatakan sebagai mean ± SD dari tiga
percobaan independen.
Hasil
Identifikasi dan frekuensi kolonisasi jamur endofit yang diisolasi dari C.
roseus
Dua puluh jamur endofit diisolasi dari empat jaringan (daun, batang, kulit
kayu dan akar) C. roseus, 40% jamur berasal dari kulit kayu, 30% dari
daun, 25% dari batang dan 5% dari akar. Isolat jamur diidentifikasi
menggunakan fitur morfologi serta urutan
Halaman 5 dari 14
analisis wilayah ITS. Sekuens ITS yang diperoleh dibandingkan dengan
sekuen di gudang GenBank untuk mengidentifikasi jamur. Isolat 5, 6, 8
dan 20 belum teridentifikasi karena tidak tersedianya sekuens serupa di
GenBank. Jamur yang teridentifikasi dengan kode masing-masing, nomor
aksesi GenBank dan persentase identitas diberikan pada Tabel 1 .
Selanjutnya, kami juga membangun pohon filogenetik menggunakan
urutan ITS 1 / 5.8S rDNA / ITS 2 menggunakan software MEGA 4. Pohon
filogenetik ini memberikan hubungan evolusioner antara berbagai jamur
endofit yang diteliti (Gbr. 1 ).
Frekuensi kolonisasi setiap jamur yang diisolasi telah diberikan pada
Tabel 2 . Semua isolat yang diidentifikasi termasuk dalam satu divisi,
Ascomycota; dua kelas, yaitu Dothideomycetes dan Sodariomycetes; dan
tujuh genera, yaitu, Lasiodiplodia, Fusarium, Colletotrichum, Phoma,
Cophinforma, Alternaria dan Chaetomium. Dari frekuensi kolonisasi
terlihat bahwa Colletotrichum
adalah genus yang paling umum dengan CF% 8,66, diikuti oleh Alternaria
dan Chaetomium dengan CF% dari
7.00 dan 6.33, masing-masing.
Keragaman jamur
Jumlah jenis jamur dari masing-masing jaringan tumbuhan seperti kulit
kayu, batang, daun dan akar berkisar antara 5 sampai 1. Indeks
keanekaragaman jenis jamur endofit pada jaringan tumbuhan yang
berbeda. C. roseus tercantum dalam Tabel 3 . Shannon dan Simpson ' Indeks
s adalah 1,47 dan 0,85 untuk kulit kayu, 1,04 dan 0,83 untuk daun dan
0,5623 dan 0,5 untuk batang. Indeks keanekaragaman ini tidak dapat
dihitung untuk endofit dari daerah akar, karena hanya ditemukan satu
spesies jamur di daerah akar tanaman. Selain itu, keanekaragaman
keseluruhan populasi jamur endofit yang menghuni jenis tumbuhan ini,
diwakili oleh indeks Shannon H. ′ dan Simpson ' Indeks s (1-D)
masing-masing adalah 1,83 dan 0,1833. Kekayaan spesies cendawan
endofit yang menempati sampel jaringan berbeda masing-masing adalah
1,89, 1,5 dan 1 untuk kulit kayu, daun dan batang. Pada perbandingan
nilai kemerataan antara kulit batang, batang dan daun, kemerataan
spesies tertinggi pada daun dan batang, dan terendah pada kulit batang.
Keragaman / keseragaman relatif (J) menunjukkan bahwa daun memiliki
yang tertinggi ' J ' nilai 0,9464, diikuti kulit batang dan batang dengan a ' J ' nilai
masing-masing 0,9 dan 0,81. Indeks dominansi Berger Parker terbalik
pada kulit kayu paling tinggi dibandingkan dengan jaringan daun dan
batang.
Aktivitas sitotoksik in vitro ekstrak kultur jamur endofit terhadap garis
sel HeLa dengan uji MTT
Ekstrak etil asetat dari semua isolat jamur yang diperoleh kemudian
dinilai aktivitas sitotoksiknya terhadap sel HeLa. Persentase aktivitas
sitotoksik yang ditunjukkan oleh ekstrak EA dari semua isolat diberikan
pada Tabel 4 . Di antara dua puluh ekstrak organik jamur yang disaring
Dhayanithy dkk. Mikrobiologi BMC (2019) 19:22 Halaman 6 dari 14

Gambar 1 Pohon filogenetik dari jamur endofit yang diisolasi dari C. roseus pabrik berdasarkan wilayah ITS. Pohon filogenetik dibangun dengan menggunakan metode parsimoni maksimum.
Nilai bootstrap 100% menunjukkan setiap genera dibedakan oleh kelompok monofiletik pada subkelas yang berbeda dari kelompok luar. Nomenklatur jamur endofit dan nomor isolat
ditunjukkan
Dhayanithy dkk. Mikrobiologi BMC (2019) 19:22 Halaman 7 dari 14

Meja 2 Frekuensi kolonisasi jamur endofit yang berbeda diisolasi dari jaringan aktivitas sitotoksik. Ekstrak jamur lainnya tidak menunjukkan aktivitas
yang berbeda C. roseus menanam yang berarti terhadap garis sel kanker HeLa.
Isolasikan nomor Pisahkan nama Organ tumbuhan CF%

1 Lasiodiplodia theobromae Kulit 2.66

2 Cophinforma mamane Daun 2.00

Efek sitotoksik dari ekstrak organik C. nigricolor pada sel HeLa dan
MCF-7
3 Fusarium decemcellulare Kulit 1.33
Untuk mengevaluasi apakah filtrat kultur cair atau miselium C. nigricolor mengandung
4 Colletotrichum capsici Kulit 7.66
prinsip sitotoksik, dan juga untuk mengevaluasi pelarut yang paling cocok
5 0.66
Tidak teridentifikasi Daun
untuk mengekstrak metabolit sekunder sitotoksik, filtrat kultur dan miselia C.
6 Tidak teridentifikasi Kulit 1.00 nigricolor diekstraksi menggunakan pelarut organik dengan berbagai
7 Lasiodiplodia theobromae Batang 0.33 polaritas yaitu diklorometana, kloroform, etil asetat dan heksana. Ekstrak

8 Tidak teridentifikasi Daun 1.00

yang diperoleh dievaluasi untuk sitotoksisitas pada sel HeLa dan MCF-7
dengan uji MTT (Tabel 5 ). Filtrat kultur dan ekstrak miselium etil asetat
9 Fusarium solani Kulit 2.33
menunjukkan aktivitas sitotoksik terbaik pada sel HeLa dengan
10 Lasidiplodia theobromae Batang 1.33

11 Chaetomium nigricolor Batang 6.33

12 Lasiodiplodia theobromae Batang 3.00

13 Lasiodiplodia theobromae Kulit 0.33 sebuah IC 50 nilai 50 ± 0,02 dan 25 ± 0,4 μ g mL - 1 masing-masing,

14 Colletotrichum sp. Daun 6.00

dibandingkan dengan ekstrak lainnya. Sedangkan
Ekstrak heksana filtrat kultur C. nigricolor menunjukkan aktivitas
15 Strain Phoma putamium Kulit 0.66
antiproliferatif terbaik terhadap sel MCF-7
16 Lasiodiplodia theobromae Kulit 1.33
dengan IC 50 nilai 45 ± 0,04 μ g mL - 1. EA- filtrat potongan, - ekstrak
17 Lasiodiplodia theobromae Akar 2.00
miselium dan filtrat kultur heksana
18 Alternaria longipes Daun 7.00 Ekstrak juga dievaluasi untuk sitotoksisitas terhadap sel T HEK 293, dan
19 Colletotrichum Daun 8.66 diamati bahwa tidak ada ekstrak yang menunjukkan sitotoksisitas

20 Tidak teridentifikasi Batang 5.33

CF, frekuensi kolonisasi
sitotoksisitas terhadap garis sel HeLa, ekstrak isolat 11 ( Chaetomium
nigricolor jika tidak disebut Amesia nigricolor) menunjukkan sitotoksisitas
yang kuat sebesar 92,20%. Sejak
C. nigricolor Ekstrak EA menunjukkan sitotoksisitas terbaik sehingga dipilih
untuk penelitian lebih lanjut. Ekstrak EA dari
C. nigricolor juga dievaluasi untuk sitotoksisitasnya terhadap sel T HEK
293, data (lihat file tambahan 1 ; Gambar. S1) menunjukkan bahwa
ekstrak EA tidak menunjukkan sitotoksisitas yang signifikan terhadapnya.
Budaya dan morfologi spora C. nigricolor diberikan pada Gambar. 2 Isolat
6 dan 13 juga menunjukkan sedang
Tabel 3 Keragaman jamur endofit diisolasi dari jaringan yang berbeda C. roseus menanam
terhadapnya (lihat File tambahan 1 ; Gambar S1). Karena ekstrak EA
miselium dan kultur filtrat dari C. nigricolor menunjukkan sitotoksisitas
yang signifikan, dalam penelitian ini kami telah mengumpulkan filtrat
kultur dan ekstrak etil miselium darinya dan selanjutnya dievaluasi untuk
kemampuan depolarisasi membran mitokondria- dan menginduksi
apoptosis.
Efek dari C. nigricolor Ekstrak EA pada depolarisasi membran
mitokondria
Depolarisasi membran mitokondria merupakan kejadian awal apoptosis
dan dapat dideteksi dengan pewarna JC-1. Tentang pengobatan dengan
10, 25 dan 50 μ g mL - 1 dari ekstrak EA C. nigricolor selama 24 jam, 17,9 ±
2,0%, 49 ± 4,2% dan 62 ± 1,41% dari potensi kehilangan membran
mitokondria diamati, masing-masing. Ini diwakili pada Gambar. 3 .

Indeks keanekaragaman Batang Daun Kulit 2, 4 DNP digunakan sebagai kontrol positif. Hasilnya menunjukkan bahwa C.

Simpson ' s Dominasi 0,5 0.16 0.14

nigricolor Ekstrak EA mengganggu integritas membran mitokondria
dengan cara yang bergantung pada konsentrasi.
Simpson ' s (1-D) 0,5 0.83 0.85

Shannon H. ′ 0,5623 1.04 1.47

Eveness 1 0.32 0.28

Efek dari C. nigricolor Ekstrak EA pada eksternalisasi fosfatidilserin
Indeks kekayaan Meinhenich 1 1.5 1.89

Indeks kekayaan margeref 0.72 1.44 2.056 Apoptosis diinduksi oleh ekstrak EA dari C. nigricolor

Ekuilabilitas J 0.81 0,9464 0.91

dalam sel HeLa dinilai dengan analisis aliran cytometry menggunakan
pewarnaan ganda annexin V-FITC / PI. Diketahui bahwa sel-sel pada fase
Dominasi Berger Parker 0.75 0,5 0.42
apoptosis awal adalah positif untuk annexin V, sedangkan sel-sel yang
Dominasi Inverter Berger Parker 1.33 2 2.33
berada pada fase akhir
Dhayanithy dkk. Mikrobiologi BMC (2019) 19:22 Halaman 8 dari 14

Tabel 4 Sitotoksisitas ekstrak etil asetat (konsentrasi-100 μ gmL - 1) dari dua puluh jamur endofit yang diisolasi dari C. rosues pada sel HeLa

Isolasikan nomor Pisahkan nama Konsentrasi μ g mL - 1 Persentase pertumbuhan

penghambatan pada sel HeLa

1 Lasiodiplodia theobromae 100 37,10 ± 0,48

2 Cophinforma mamane 100 34,69 ± 0,31

3 Fusarium decemcellulare 100 9.29 ± 0.45

4 Colletotrichum capsici 100 35,22 ± 0,37

5 Tidak teridentifikasi 100 36,18 ± 0,31

6 Tidak teridentifikasi 100 46,72 ± 0,47

7 Lasiodiplodia theobromae 100 40,33 ± 1,34

8 Tidak teridentifikasi 100 26,80 ± 0,34

9 Fusarium solani 100 40,85 ± 0,60

10 Lasiodiplodia theobromae 100 40,33 ± 0,65

11 Chaetomium nigricolor 100 92,20 ± 0,42

12 Lasiodiplodia theobromae 100 36.29 ± 0.68

13 Lasiodiplodia theobromae 100 52.12 ± 1.2

14 Colletotrichum sp. 100 35,59 ± 0,85

15 Strain Phoma putamium 100 27.04 ± 1.84

16 Lasiodiplodia theobromae 100 20.40 ± 0.71

17 Lasiodiplodia theobromae 100 27,05 ± 0,42

18 Alternaria longipes 100 38,34 ± 0,64

19 Colletotrichum 100 44,65 ± 0,03

20 Tidak teridentifikasi 100 34,84 ± 0,05

+ ve kontrol Vincristine 2μM 90 ± 0,2

Viabilitas sel ditentukan dengan uji MTT menggunakan garis sel kanker serviks manusia, HeLa. Nilai penghambatan pertumbuhan adalah mean ± SD dihitung dari hasil yang diperoleh dari tiga kali percobaan
independen (n = 6)
Untuk ekstrak dari semua isolat, rerata berbeda secara signifikan dibandingkan dengan sel yang tidak diberi perlakuan di P < 0,0001

apoptosis positif untuk annexin V dan PI. Sel yang telah memasuki fase
nekrotik positif hanya untuk PI. Dari analisis FACS kami dapat
menyimpulkan bahwa sel HeLa diperlakukan dengan 10 μ g mL - 1 ekstrak
EA dari C. nigricolor selama 24 jam menjalani apoptosis, dengan 13,9 ±
1,95% sel pada apoptosis dini
fase dan 7,6 ± 2,9% sel pada apoptosis akhir, dan pada peningkatan
konsentrasi menjadi 25 μ g mL - 1, diamati bahwa 30,5 ± 5,30% sel berada
dalam fase apoptosis awal dan 48,8 ± 2,96% sel berada dalam fase
apoptosis akhir (Gambar. 4 ), yang menunjukkan induksi apoptosis
dengan cara yang bergantung pada konsentrasi.

Gambar 2 Pengamatan morfologi jamur C. nigricolor. Sebuah) Koloni setelah 7 hari pada suhu 30 ° C di piring PDA b) Gambar mikroskop cahaya dari
C. nigricolor spora (pembesaran 40 X)
Dhayanithy dkk. Mikrobiologi BMC (2019) 19:22 Halaman 9 dari 14

Tabel 5 IC sitotoksisitas 50 nilai ekstrak organik yang berbeda dari C. nigricolor pada sel HeLa dan MCF-7

Ekstrak dari C. nigricolor sedang dipelajari IC aktivitas sitotoksik 50 ( μ gmL - 1)

HeLa MCF-7

Ekstrak miselium EA 25 ± 0,4 > 100

Ekstrak filtrat kultur EA Ekstrak 50 ± 0,02 > 100

miselium kloroform > 100 > 100

Ekstrak filtrat kultur kloroform Ekstrak > 100 > 100

miselium diklorometana > 100 > 100

Ekstrak filtrat biakan diklorometana Ekstrak > 100 > 100

miselium heksana > 100 > 100

Ekstrak filtrat kultur heksana > 100 45 ± 0,04

+ ve kontrol Vincristine 1.2

EA, etil asetat

Viabilitas sel ditentukan dengan uji MTT menggunakan garis sel kanker serviks manusia, HeLa dan garis sel kanker payudara manusia, MCF-7. IC 50 nilai mean ± SD dihitung dari hasil yang diperoleh dari rangkap tiga dari
dua percobaan independen (n = 6)

Aktivitas pemulungan radikal bebas ekstrak EA jamur endofit mengisolasi 13 dan 19 diidentifikasi sebagai Lasiodiplodia theobromae

menggunakan uji DPPH dan Colletotrichum juga memamerkan pemulungan terkemuka

Ekstrak EA dari semua jamur yang diisolasi diuji aktivitas pembersihan
radikal bebasnya menggunakan uji DPPH. Dari 20 ekstrak jamur yang
dievaluasi untuk aktivitas pemulungan, C. nigricolor Ekstrak EA
menunjukkan
aktivitas pemulungan yang signifikan dengan EC 50 nilai 22 μ g mL - 1. Selain
ekstrak ini, ekstrak
aktivitas dengan EC 50 nilai 58 ± 0,3 μ g mL - 1 dan 66 ±
0.2 μ g mL - 1, masing-masing. Sejak C. nigricolor dipamerkan
aktivitas pemulungan terbaik dibandingkan dengan isolat lainnya,
selanjutnya dievaluasi sifat antioksidannya yang lain. Daftar isolat dan
potensi pemulungan DPPHnya dapat dilihat pada Tabel 6 .

Gambar 3 Pengaruh ekstrak EA C. nigricolor tentang hilangnya potensi membran mitokondria (MMP) dalam sel HeLa. Sel HeLa dirawat dengan konsentrasi ekstrak EA yang ditunjukkan,
diwarnai dengan JC-1 dan selanjutnya dianalisis dengan flow cytometry, angka di gerbang kanan bawah mewakili persentase sel dengan MMP rendah. B) Analisis statistik tentang hilangnya
MMP yang diperoleh dalam flow cytometer Percobaan diulang tiga kali dan hasilnya disajikan sebagai mean ± SD
Dhayanithy dkk. Mikrobiologi BMC (2019) 19:22 Halaman 10 dari 14

Gambar 4 Efek dari C. nigricolor- Perlakuan ekstrak EA pada apoptosis sel HeLa ditentukan dengan pewarnaan ganda annexin V / PI. Sel HeLa diobati dengan atau tanpa ekstrak selama
24 jam. Setelah inkubasi, sel diwarnai ganda dengan Annexin - V FITC dan PI, dan dianalisis dengan flow cytometry. Dot-plot merepresentasikan distribusi sel sebagai berikut: Kiri bawah
(PI - ve / FITC - ve) sel hidup, kanan bawah (PI - ve / FITC + ve) sel apoptosis, kanan atas (PI + ve / FITC + ve) sel apoptosis akhir, sel nekrotik mati kiri atas (PI + ve / FITC -ve). B) Diagram
batang menggambarkan distribusi sel apoptosis awal dan akhir. Data berasal dari setidaknya tiga eksperimen independen

Aktivitas antioksidan ekstrak EA C. nigricolor
Ekstrak EA dari C. nigricolor dievaluasi sifat antioksidannya melalui
potensinya untuk mengais super oksida, oksida nitrat, dan radikal
hidroksil. Properti pemulungan dari ekstrak pada konsentrasi yang
berbeda telah diwakili pada Gambar. 5 . Ekstrak EA itu menunjukkan
berbagai tingkat aktivitas pemulungan untuk radikal yang berbeda.
Ekstrak EA dari C. nigricolor menunjukkan aktivitas penghambatan DPPH
terbaik dan tingkat rata-rata super-
aktivitas pembersihan radikal oksida dengan EC 50 nilai 22 μ g mL - 1 dan 65 μ
g mL - 1, masing-masing. Tapi ekstraknya
bukanlah pemulung yang baik dari radikal hidroksil atau radikal oksida nitrat.
Diskusi
Keragaman mikroba yang dimiliki tanaman ditambah dengan
keanekaragaman hayati yang dimiliki jamur endofit memberikan banyak
peluang untuk penemuan molekul timbal baru [ 7 ]. Terlepas dari
keanekaragaman mikroba dan kimiawi, interaksi tanaman inang endofit
juga memberikan potensi mikroba untuk menghasilkan segudang
senyawa baru yang berguna secara medis [ 2 ]. Tanaman obat selalu
menjadi ceruk bagi endofit dan
sang penyelenggara - interaksi mikroba selalu memicu produksi beberapa
metabolit baru [ 2 ] oleh mikroba selain senyawa asli tanaman
(produksinya difasilitasi melalui transfer gen horizontal). Selain
keanekaragaman hayati, penggunaan tradisional tanaman dan wilayah
tempat tanaman diperoleh merupakan kriteria penting untuk isolasi
endofit [ 41 ]. Kebutuhan akan senyawa baru dengan potensi antikanker
dan aktivitas antioksidan menjadi tak terelakkan. Oleh karena itu dalam
studi saat ini kami telah mempelajari populasi jamur endofit dari C. roseus tanaman
karena keanekaragaman, antikanker dan potensi antioksidannya.
Tujuh genera jamur endofit yang berbeda diisolasi dari berbagai
daerah tanaman. Berbeda dengan penelitian sebelumnya yang dilakukan
oleh Kharwar et al, dimana sebagian besar spesies jamur berasal C.
roseus milik Hyphomycetes [ 23 ], dalam penelitian ini sebagian besar
jamur endofit yang diisolasi termasuk dalam kelas Dothideomycetes dan
Sodariomycetes. Perbedaan wilayah tempat tanaman diisolasi dapat
menjadi salah satu kemungkinan penyebab perbedaan komunitas
mikroba yang diisolasi. Dalam penelitian ini, jamur endofit yang menghuni
tanaman menunjukkan keragaman sedang dan
Dhayanithy dkk. Mikrobiologi BMC (2019) 19:22 Halaman 11 dari 14

Tabel 6 Potensi antioksidan ekstrak etil asetat jamur endofit yang diisolasi dari C. roseus
Isolasikan nomor Isolasi diidentifikasi sebagai Pemulungan DPPH
EC potensial 50 ( μ gmL - 1)

1 Lasiodiplodia theobromae > 100

2 Cophinforma mamane > 100

3 Fusarium decemcellulare 100 ± 0,01

4 Colletotrichum capsici > 100

5 Tidak teridentifikasi > 100

6 Tidak teridentifikasi > 100

7 Lasiodiplodia theobromae > 100

8 Tidak teridentifikasi > 100

9 Fusarium solani > 100

10 Lasidiplodia theobromae > 100

11 Chaetomium nigricolor 22

12 Lasiodiplodia theobromae > 100

13 Lasiodiplodia theobromae 58 ± 0,3

14 Colletotrichum sp. > 100

15 Strain Phoma putamium > 100

16 Lasiodiplodia theobromae > 100

17 Lasiodiplodia theobromae > 100

18 Alternaria longipes > 100

19 Colletotrichum 66 ± 0,2

20 Tidak teridentifikasi > 100

+ ve kontrol Asam askorbat 18 ± 0,2

dan chaeotocin dengan potensi bioaktivitas [ 42 - 45 ]. Ekstrak organik jamur

jamur didistribusikan ke seluruh tanaman. Padahal berdasarkan CF%, Colletotrichum
adalah spesies yang paling umum dan Lasiodiplodia theobromanae adalah
spesies yang paling tidak lazim, Lasiodiplodia merupakan salah satu genus
yang terdapat pada hampir semua jaringan tumbuhan yang diteliti. Data
frekuensi kolonisasi menunjukkan bahwa jamur endofit yang berbeda
menghuni jaringan tanaman yang berbeda dengan tingkat yang berbeda pula.
Perbedaan dalam potensi penghuni jamur endofit ini menunjukkan bahwa,
setiap endofit menunjukkan derajat afinitas yang berbeda terhadap jaringan
tumbuhan yang berbeda. Sebagian besar jamur endofit yang diisolasi dalam
penelitian ini umumnya dilaporkan endofit dari berbagai tanaman obat.
Prosedur skrining berbasis aktivitas dipilih dalam penelitian ini, untuk
mencari endofit dengan potensi bioaktivitas. Potensi sitotoksik ekstrak EA
dari jamur endofit yang diisolasi diselidiki terhadap sel kanker serviks
manusia, HeLa. Telah diamati bahwa ekstrak EA jamur C. nigricolor menunjukkan
Peristiwa awal apoptosis termasuk depolarisasi membran mitokondria,
sitotoksisitas terbaik terhadap garis sel HeLa. Beberapa jamur tergolong Chaetomium
genus telah dicatat untuk menghasilkan banyak sekali metabolit sekunder
yang memiliki potensi bioaktif. Misalnya, jamur yang termasuk dalam
genus spesifik ini tercatat menghasilkan eksometabolit seperti
chaetopyranin, chaetoglobosins, sterigmatocystin, chaetracin A.
yang berbeda C. nigricolor dievaluasi lebih lanjut untuk aktivitas
sitotoksiknya terhadap sel HeLa dan MCF-7. Ekstrak EA jamur
menunjukkan potensi sitotoksisitas terhadap sel HeLa, sedangkan ekstrak
filtrat kultur heksana menunjukkan potensi sitotoksik yang signifikan
terhadap sel MCF-7. Dihipotesiskan bahwa ekstrak etil asetat memiliki
eksometabolit yang menunjukkan sitotoksisitas terhadap sel HeLa,
sedangkan ekstrak filtrat kultur heksana dapat memiliki eksometabolit
yang menunjukkan potensi sitotoksisitas terhadap garis sel kanker
payudara, MCF-7. Selanjutnya, pada penelitian ini juga telah dilakukan
evaluasi depolarisasi membran mitokondria dan potensi induksi apoptosis
dari ekstrak EA ekstrak EA. C. nigricolor, karena ekstrak organik jamur ini
menunjukkan aktivitas sitotoksik terbaik dan oleh karena itu dapat
digunakan di masa depan untuk isolasi metabolit antikanker baru.
yang pada gilirannya menyebabkan gangguan pada rantai pernapasan
dan pelepasan sitokrom C ke dalam sitosol. Pewarna JC-1 mendeteksi
depolarisasi mitokondria, penurunan rasio merah ke hijau dari pewarna
menunjukkan depolarisasi mitokondria. Ekstrak EA dari C. nigricolor menginduksi
depolarisasi membran mitokondria dan dinilai
Dhayanithy dkk. Mikrobiologi BMC (2019) 19:22 Halaman 12 dari 14

Gambar 5 Aktivitas antioksidan C. nigricolor- Ekstrak EA Sebuah) Kegiatan pemulungan DPPH b) Potensi pembersihan oksida nitrat c) Aktivitas pembersihan radikal hidroksil d) Aktivitas pembersihan
superoksida. Asam askorbat pada konsentrasi 50 μ gmL - 1 digunakan sebagai kontrol positif untuk semua uji antioksidan. Data diperoleh dari setidaknya dua percobaan independen yang masing-masing
dilakukan dalam rangkap tiga (n = 6). Nilai P dihitung dengan membandingkan mean ± SD dari% aktivitas scavening yang diamati dengan menambahkan dan tanpa menambahkan ekstrak ke dalam
campuran reaksi, menggunakan Student ' s Uji T dan signifikansi statistik disajikan sebagai berikut dalam grafik batang: ***, P. ≤ 0,001; ** P. ≤ 0,01; ns, P> 0,05

dengan analisis FACS. Hasil penelitian juga secara meyakinkan
menunjukkan bahwa ekstrak EA menginduksi apoptosis dalam sel HeLa
melalui eksternalisasi fosfatidil serin, ciri penting apoptosis.
Radikal bebas diketahui menyebabkan kerusakan oksidatif pada tubuh dan
pada gilirannya menyebabkan beberapa gangguan seperti kanker, gangguan
jantung, katarak, diabetes mellitus, artritis, dan penuaan. Beberapa kelompok
penelitian telah menunjukkan bahwa tanaman obat dan endofitnya dapat
menjadi sumber potensial untuk molekul dengan aktivitas antioksidan [ 22 , 44 ].
Penapisan ekstrak jamur untuk aktivitas pembersihan radikal bebas melalui uji
DPPH, menunjukkan hal itu C. nigricolor Ekstrak etil asetat menunjukkan
aktivitas terkuat diikuti oleh ekstrak Lasiodiplodia theobromae ( mengisolasi 13)
dan
jamur yang menghuni C. roseus Penanaman tanaman di wilayah pesisir
telah banyak dilakukan. Data yang diperoleh menunjukkan bahwa dari 20
ekstrak jamur endofit yang diskrining terhadap potensi sitotoksik dan
antioksidan, C. nigricolor Ekstrak etil asetat memiliki potensi sitotoksik,
antioksidan dan apoptosis yang signifikan. C. nigricolor telah dilaporkan
untuk aktivitas sitotoksiknya terhadap sel HeLa sebelumnya [ 45 ], untuk
pertama kalinya kami melaporkan ekstraknya untuk bioaktivitas seperti
antioksidan, apoptosis, dan potensi depolarisasi membran mitokondria.
Diduga dapat menyimpan metabolit yang dapat berfungsi sebagai agen
antikanker dan antioksidan yang menjanjikan.

Colletotrichum ( mengisolasi 19). C. nigricolor Ekstrak juga menunjukkan potensi

pemulungan oksida super yang sedang-sedang saja. Jadi, diamati itu C.
File tambahan
nigricolor menunjukkan potensi sitotoksik, antikanker dan antioksidan yang
File tambahan 1: Tabel S1. IC sitotoksisitas 50 nilai ekstrak etil asetat dari C. nigricolor ditanam
signifikan.
menggunakan media yang berbeda pada sel HeLa. Itu
jamur C. nigricolor ditanam pada media tersebut di atas selama 21 hari, dipanen, diekstraksi

Kesimpulan
Studi ini memberikan wawasan tentang keragaman komunitas jamur
endofit yang diisolasi C. roseus tumbuh di wilayah pesisir Mahabalipuram.
menggunakan etil asetat dan dievaluasi aktivitas sitotoksiknya. Sitotoksisitas ditentukan dengan
uji MTT menggunakan manusia
garis sel kanker serviks, HeLa. IC 50 nilai rata-rata ± SD dihitung dari hasil yang diperoleh dari
rangkap tiga dari dua percobaan independen ( n = 6).

Ini adalah laporan pertama dimana studi tentang keanekaragaman endofit Gambar S1 Sitotoksisitas ekstrak EA dan heksana C. nigricolor ditumbuhkan menggunakan
media M-1D yang diuji pada HEK 293 T (Sel non kanker). Itu
Dhayanithy dkk. Mikrobiologi BMC (2019) 19:22
jamur C. nigricolor ditumbuhkan pada media yang disebutkan di atas sebagai kultur cair selama 21
hari, dipanen, diekstraksi menggunakan etil asetat atau heksana dan dievaluasi aktivitas
sitotoksiknya pada sel T HEK 293 menggunakan uji MTT. Persentase sel mati pada perlakuan
dengan berbagai konsentrasi ekstrak A) EA, B) Ekstrak miselium EA C) Ekstrak filtrat kultur EA D)
Ekstrak filtrat kultur heksana direpresentasikan sebagai grafik batang. Mean ± SD dihitung dari
hasil yang diperoleh dari rangkap tiga dari dua percobaan independen (n = 6). (DOCX 107 kb)
Singkatan
2,4 DNP: 2,4-Dinitrofenol; Abs: Absorbansi; CF: Frekuensi kolonisasi; DMEM: Dulbecco ' s
Modifikasi Eagle ' s Sedang; DMSO: Dimetil sulfoksida;
DPPH: 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil; EA: Etil asetat; EC 50: Konsentrasi efektif setengah
maksimal; FBS: Serum Sapi Janin; FITC: Fluorescein
isothiocyanate; h: jam; IC 50: Setengah konsentrasi hambat maksimal; ITS: Internal
Transcribed Spacer; MIDA: Media-1 agar yang dimodifikasi;
MIDB: Kaldu medium-1 yang dimodifikasi; menit: menit; MTT: 3- (4,5-dimethylthiazol2-yl)
-2,5-difeniltetrazolium bromida; NADH: nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) + hydrogen (H);
NtB: Kaldu Nutrisi; OD: Kepadatan optik; PDA: Agar dekstrosa kentang; PDB: Kaldu dekstrosa
kentang; PI: Propidium Iodida; PMS: Phenazine methosulfate; SDB: Kaldu Sabouraud; TBA: Asam
tiobarbiturat; TCA: Asam trikloroasetat
Ucapan Terima Kasih
Geethanjali. D berterima kasih kepada CSIR, India karena telah memberikan fellowship-nya. Terima kasih Dr
Kamalraj Subban ' UGC-Dr. Persekutuan Kothari ' skema untuk persekutuannya. Prof. Chellaih Jayabaskaran
berterima kasih kepada DST Pemerintah India, New Delhi atas hibahnya (SB / EMEQ-093/2013 dan SERB / EEQ
/ 2017/000068), program kemitraan DBT-IISC, DST-FIST dan program bantuan keuangan khusus UGC untuk
keuangan mendukung dan memberikan fasilitas. Semua penulis berterima kasih kepada fasilitas pusat dan fasilitas
FACS, IISc, Bangalore, India.
Pendanaan
Pekerjaan ini didukung oleh hibah (SB / EMEQ-093/2013) dari DST, Pemerintah India, New Delhi dan
hibah SERB / EEQ / 2017/000068 dari DST, GIO, New Delhi, India kepada Prof. Chellaih Jayabaskaran.
Kami juga berterima kasih kepada program kemitraan DBT-IISC, DST-FIST dan program bantuan
keuangan khusus UGC atas dukungan keuangan dan pemberian fasilitas.
Ketersediaan data dan bahan
Urutan yang diperoleh dalam penelitian ini disimpan dalam database NCBI GenBank
(Untuk nomor aksesi, lihat Tabel 1 dari naskah). Dataset lain yang digunakan dan / atau
dianalisis selama penelitian ini tersedia dari penulis terkait atas permintaan yang wajar.
Penulis ' s kontribusi
CJB, GD dan KS merancang percobaan. GD melakukan identifikasi molekuler dari endofit,
ekstraksi, antikanker dan eksperimen antioksidan. Isolasi endofit dilakukan KS dan dihitung
CF%. CJB dan GD menulis makalah penelitian. Semua penulis membaca dan menyetujui
naskah akhir.
Penulis ' s informasi
Dr. Geethanjali. D, FA-06, Departemen Biokimia, Institut Sains India, Bangalore 560.012,
Karnataka, India, Email: geethadhaya@gmail.com Dr. Kamalraj. S, FA-06, Departemen
Biokimia, Institut Sains India, Bangalore 560.012, Karnataka, India, Email:
mycolkamal@gmail.com Prof. C. Jayabaskaran [Penulis koresponden], Profesor dan Ketua,
FA-06, Departemen Biokimia , Institut Sains India, Bangalore-560.012, Nomor ponsel: + 91 - 80-22.932.482,
Eutypella spp - CrP14 diisolasi dari Catharanthus roseus menginduksi apoptosis pada garis
+ 91 - 80-23,600,118, Email: cjb@biochem.iisc.ernet.in
Persetujuan etika dan persetujuan untuk berpartisipasi
Tak dapat diterapkan.
Persetujuan untuk publikasi
Tak dapat diterapkan.
Minat yang bersaing
Para penulis menyatakan bahwa mereka tidak memiliki kepentingan yang bersaing.
Halaman 13 dari 14
Penerbit ' s Catatan
Springer Nature tetap netral sehubungan dengan klaim yurisdiksi dalam peta yang
diterbitkan dan afiliasi kelembagaan.
Diterima: 16 November 2017 Diterima: 2 Januari 2019
Referensi
1. Bacon CW, White J, editor. Endofit mikroba. CRC press, 2000. Kusari S, Hertweck
2. C, Spiteller M. Ekologi kimia jamur endofit: asal metabolit sekunder. Chem berbagai.
2012; 19: 792 - 8.
3. Eyberger AL, Dondapati R, Porter JR. Isolat jamur endofit dari
Podophyllum peltatum menghasilkan podophyllotoxin. J Nat Prod. 2006; 69: 1121 - 4.
4. Chakravarthi BV, Das P, Surendranath K, Karande AA, Jayabaskaran C.Produksi paclitaxel oleh
Fusarium solani diisolasi dari Taxus celebica. J Biosci. 2008; 33: 259 - 67.
5. Strobel GA. Endofit sebagai sumber produk bioaktif. Mikroba dan menginfeksi. 2003; 5: 535 - 44.
6. Kusari S, Zühlke S, Spiteller M. Jamur endofit dari Camptotheca acuminata yang
menghasilkan camptothecin dan analog. J Nat Prod. 2009; 72: 2. Strobel G, Daisy B, Castillo
7. U, Harper J. Produk alami dari mikroorganisme endofit. J Nat Prod. 2004; 67: 257 - 68.
8. Wiyakrutta S, Sriubolmas N, Panphut W, Thongon N, Danwisetkanjana K, Ruangrungsi N,
Meevootisom V. Jamur endofit dengan aktivitas antimikroba, antikanker dan antimalaria yang
diisolasi dari tanaman obat Thailand. Dunia J Microb Biot. 2004; 20: 265 - 72.
9. Huang WY, Cai YZ, Xing J, Corke H, Sun M. Sumber daya antioksidan potensial: jamur endofit
dari tanaman obat. Econ Bot. 2007; 61: 14 - 30.
10. Li H, Qing C, Zhang Y, Zhao Z. Skrining jamur endofit dengan aktivitas antitumor dan
antijamur dari tanaman obat Cina. Dunia J Microb Biot. 2005; 21: 1515 - 9.
11. Das S, Sharangi AB. Periwinkle Madagaskar ( Catharanthus roseus L.): beragam manfaat obat
dan terapeutik bagi umat manusia. J Pharmacogn. Fitokimia. 2017; 6: 1695 - 701.
12. Segelman AB, Farnsworth NR. Catharanthus alkaloid XXXI: isolasi ajmalicine, pericalline,
tetrahydroalstonine, vindolinine, dan asam ursolat dari
Catharanthus trichophyllus akar. J Pharm Sci. 1974; 63: 1419 - 22.
13. Singh SN, Vats P, Suri S, Shyam R, Kumria MM, Ranganathan S, Sridharan K.Efek ekstrak
antidiabetik dari Catharanthus roseus pada aktivitas enzimik pada tikus diabetes yang diinduksi
streptozotoci. J Ethnopharmacol. 2001; 76: 269 - 77. Gajalakshmi S, Vijayalakshmi S, Devi RV.
14. Kegiatan farmakologis
Catharanthus roseus: tinjauan perspektif. Int J Pharm dan Bio Sci. 2013; 4: 431 - 9.
15. Ferreres F, Pereira DM, Valentão P, Andrade PB, Seabra RM, Sottomayor M. Senyawa
fenolik baru dan potensi antioksidan Catharanthus roseus.
J Agric Food Chem. 2008; 56: 9967 - 74.
16. Neuss N, Gorman M, Hargrove W, Cone NJ, Biemann K, Buchi G, Manning RE. Alkaloid vinca.
XXI. 1 struktur dari alkaloid vinblastine oncolytic (VLB) dan vincristine (VCR) 2. J Am Chem
Soc. 1964; 86: 1440 - 2.
17. Kumar A, Patil D, Rajamohanan PR, Ahmad A. Isolasi, pemurnian dan karakterisasi
vinblastine dan vincristine dari jamur endofit
Fusarium oxysporum diisolasi dari Catharanthus roseus. PLoS One. 2013; 8: e71805.
18. Palem PP, Kuriakose GC, Jayabaskaran C. Jamur endofit, Talaromyces radicus, diisolasi dari Catharanthus
roseus, menghasilkan vincristine dan vinblastine, yang menyebabkan kematian sel apoptosis. PLoS
One. 2016; 10: e0144476. Kuriakose GC, Padmini PC, Jayabaskaran C. Jamur vincristine dari
19.
sel karsinoma skuamosa manusia -A431. BMC Melengkapi Pengobatan Alternatif. 2016; 16:
302.
20. Khiralla A, Mohamed IE, Tzanova T, Schohn H, Slezack-Deschaumes S, Hehn
A, André P, Carre G, Spina R, Lobstein A, Yagi S. Jamur endofit yang berasosiasi dengan tanaman
obat Sudan menunjukkan potensi sitotoksik dan antibiotik. FEMS Microbiol Lett. 2016; 363: fnw089.
21. Asai T, Luo D, Yamashita K, Oshima Y. Struktur dan sintesis biomimetik novel α- Poliketida
piron dari endofit Penicillium sp. di
Catharanthus roseus. Org Lett. 2013; 15: 1020 - 3. DJ Jasmine, Agastian P. In vitro aktivitas
22. antioksidan dan in vivo aktivitas alfa glukosidase dari aktinomiset endofit yang diisolasi
dari
Catharanthus roseus ( l.) G. Don. J Pharm Res. 2013; 6: 674 - 8.
Dhayanithy dkk. Mikrobiologi BMC (2019) 19:22 Halaman 14 dari 14

23. Kharwar RN, Verma VC, Strobel G, Ezra D.Kompleks jamur endofit
Catharanthus roseus ( L.) G. Don. Curr Sci. 2008: 228 - 33.
24. Waqas M, Khan AL, Kamran M, Hamayun M, Kang SM, Kim YH, Lee IJ. Jamur endofit menghasilkan
giberelin dan asam indoleasetat dan mendorong pertumbuhan tanaman inang selama stres. Molekul.
2012; 17: 10754 - 73.
25. Ali S, Charles TC, Glick BR. Perbaikan kerusakan stres salinitas tinggi oleh endofit bakteri pemacu
pertumbuhan tanaman yang mengandung ACC deaminase. Fisiol Tumbuhan dan Biokem. 2014; 80:
160 - 7.
26. Jinu MV, Jayabaskaran C.Keanekaragaman dan aktivitas antikanker jamur endofit yang berhubungan
dengan tanaman obat Saraca asoca. Curr Res Lingkungan Appl Mycol. 2015; 5: 169 - 79.

27. Müller FMC, Werner KE, Kasai M. Ekstraksi cepat DNA genom dari khamir yang penting secara
medis dan jamur berfilamen dengan gangguan sel berkecepatan tinggi. J Clin Microbiol. 1998; 36:
1625 - 9.
28. White TJ, Bruns T, Lee SJWT, dkk. Amplifikasi dan sekuensing langsung dari gen RNA
ribosom jamur untuk filogenetik. Protokol PCR: panduan metode dan aplikasi. 1990; 18:
315 - 22.
29. Chenna R, Sugawara H, Koike T, Lopez R, Gibson TJ, Higgins DG, dan Thompson J D.
Penyelarasan urutan berganda dengan rangkaian program Clustal. 2003. Asam Nukleat
Res 31: 3497 - 3500.
30. Tamura K, Joel D, Nei M, Kumar S. MEGA4: perangkat lunak analisis genetika evolusi molekuler
(MEGA) versi 4.0. Mol berbagai Evol. 2007; 24: 1596 - 9. Kusari P, Kusari S, Spiteller M, Kayser O.
31. Jamur endofit yang terdapat di
Cannabis sativa L: keanekaragaman dan potensi sebagai agen biokontrol terhadap fitopatogen
spesifik tanaman inang. Penyelam Jamur. 2013; 60: 137 - 51. Suryanarayan dan TS, Kumaresan V.
32. Jamur endofit dari beberapa halofit dari hutan mangrove muara. Mycol Res. 2000; 104: 1465 - 7.
Katoch M, Phull S, Vaid S, Singh S. Keanekaragaman, filogeni, antikanker dan potensi antimikroba
33. dari endofit jamur yang terkait dengan Monarda citriodora L. BMC Microbiol. 2017; 17:44.

34. Mosmann T. Uji kolorimetri cepat untuk pertumbuhan dan kelangsungan hidup sel: aplikasi
untuk uji proliferasi dan sitotoksisitas. Metode J Immunol. 1983; 65: 55 - 63.

35. Cossarizza A, Salvioli S. Analisis sitometri aliran potensi membran mitokondria

menggunakan JC-1. Curr Protoc Cytom. 2001: 9 - 14.
36. Pengukuran Miller E. Apoptosis dengan pewarnaan annexin v. Metode Mol Med. 2004; 88: 191 - 202.

37. Blois MS. Penentuan antioksidan dengan menggunakan radikal bebas yang stabil. Alam. 1958; 181:
1199 - 200.
38. Singh N, Rajini PS. Aktivitas pembersihan radikal bebas dari ekstrak air dari kulit kentang. Kimia
Makanan. 2004; 85: 611 - 6.
39. Ganesan K, Kumar KS, Rao PS. Penilaian komparatif aktivitas antioksidan pada tiga spesies
rumput laut hijau yang dapat dimakan, Enteromorpha dari Okha, pantai barat laut India. Inovasi
makanan sci & emerg technol. 2011; 12: 73 - 8. Gupta P, Jain V, Pareek A, Kumari P, Singh R,
40. Agarwal P, Sharma V.Evaluasi efek ekstrak alkohol dari kayu teras Pterocarpus marsupium di in
vitro antioksidan, anti-glikasi, akumulasi sorbitol dan penghambatan aktivitas reduktase aldosa.
J Tradit Complement Med. 2017; 7: 307 - 14.

41. Verpoorte R. Eksplorasi kemodiversitas alam: peran metabolit sekunder sebagai petunjuk dalam
pengembangan obat. Drug Discov Today. 1998; 3: 232 - 8. Udagawa SI, Muroi T, Kurata H, Sekita
42. S, Yoshihira K, Natori S, Umeda M.Produksi chaetoglobosins, sterigmatocystin,
O-methylsterigmatocystin, dan chaetocin oleh Chaetomium spp. dan jamur terkait. Can J
Microbiol. 1979; 25: 170 - 7.

43. Wang S, Li XM, Teuscher F, Li DL, Diesel A, Ebel R, Proksch P, Wang BG. Chaetopyranin,
turunan benzaldehida, dan metabolit terkait lainnya dari Chaetomium globosum, jamur endofit
yang berasal dari alga merah laut Polysiphonia urceolata. J Nat Prod. 2006; 69: 1622 - 5. Huang
WY, Cai YZ, Hyde KD, Corke H, Jamur endofit Sun M. Nerium oleander L ( Apocynaceae):
44. konstituen utama dan aktivitas antioksidan. Dunia J Microb Biot. 2007; 23: 1253 - 63.

45. Saito T, Suzuki Y, Koyama K, Natori S, Iitaka Y, Kinosita T. Chetracin a dan Chaetocins B
dan C, tiga Epipolythiodioxo-piperazines baru dari Chaetomium spp. Chem Pharm Bul. 1988;
36: 1942 - 56.
46. Wang XW, Houbraken J, Groenewald JZ, Meijer M, Andersen B, Nielsen KF, Samson RA.
Keanekaragaman dan taksonomi jamur Chaetomium dan chaetomium dari lingkungan dalam
ruangan. Stud Mycol. 2016; 84: 145 - 224.