Diterjemahkan dari bahasa Inggris ke bahasa Indonesia - www.onlinedoctranslator.

com

Jurnal Bioteknologi 230 (2016) 63–71

Daftar isi tersedia diSains Langsung

Jurnal Bioteknologi
j ou r na l beranda:www. itu pernah. com/ l oc makan / jbiotec

RekayasaCorynebacterium glutamicumuntuk produksi xylitol dari

gula pentosa lignoselulosa
Kiran S.DharA, Volker F. WendischB, Kesavan Madhavan NampoothiriA,∗
ADivisi Bioteknologi, CSIR, Institut Nasional Sains dan Teknologi Interdisipliner, Trivandrum 695 019, Kerala, India
BGenetika Prokariota, Pusat Bioteknologi, Fakultas Biologi, Universitas Bielefeld, Bielefeld 33615, Jerman

info artikel abstrak

Sejarah artikel: Xylitol adalah gula alkohol yang tidak dapat difermentasi yang digunakan sebagai pemanis.Corynebacterium
Diterima 26 Februari 2016 Diterima dalam glutamicumATCC13032 direkayasa secara metabolik untuk produksi xylitol dari gula lignoselulosa pentosa xilosa
bentuk revisi 20 April 2016 Diterima 6 Mei dan arabinosa. Konversi langsung xilosa menjadi xylitol dicapai melalui ekspresi heterolog xilosa reduktase yang
2016
bergantung pada NAD(P)H (xr)gen dariRhodotorula mucilaginosa.Sintesis xylitol dari arabinosa dicapai melalui
Tersedia online 13 Mei 2016
ekspresi polisistronikaku-isomerase arabinosa (araA),D-psikose 3 epimerase (dpe)Danaku-xilulosa reduktase (lxr)gen
dariEscherichia coli, Agrobacterium tumefaciensDan Mycobacterium smegmatis,masing-masing. Ekspresi darixrdan
Kata kunci:
sintetisaraA-dpe-lxroperon di bawah kendali P. yang diinduksi IPTGtakpromotor memungkinkan produksi xylitol dari
Corynebacterium glutamicum
Rekayasa metabolisme
xilosa dan arabinosa dalam medium mineral (CGXII) dengan glukosa sebagai sumber karbon. Ekspresi tambahan
Lignoselulosa dari transporter pentosa (araTF)gen meningkatkan produksi xylitol sekitar empat kali lipat dibandingkan dengan
Gula pentosa strain induk. Regangan yang dibangunCg-ax3diproduksi 6.7±0,4 g/L xylitol dalam fermentasi batch dan 31±0,5 g/L
Xilosa xylitol dalam fermentasi fed-batch dengan produktivitas spesifik 0,28±0,05 g/g cdw/jam. KeteganganCg-ax3 juga
Arabinosa divalidasi untuk produksi xylitol dari minuman keras sorghum brangkasan (SAPL) yang kaya pentosa dan diolah
silitol dengan asam dan hasilnya sebanding pada kedua SAPL (27±0,3 g/L) dan media mineral (31±0,5 gram/L).
Kompor sorgum

© 2016 Elsevier BV Hak cipta dilindungi undang-undang.

1. Perkenalan Produksi xylitol secara mikroba menjanjikan keuntungan dibandingkan

Xylitol adalah poliol alami pentahidroksi yang terkenal sebagai
alternatif gula sehat dalam industri makanan. Menjadi gula alkohol
yang tidak dapat difermentasi dengan rasa sejuk dan menyegarkan,
telah menjadi pilihan rasa manis yang sangat baik tanpa karies gigi (
Granstrom dkk., 2007). Xylitol dapat digunakan sebagai neutraceutical
karena sifat antidiabetik, antioksidan, dan antikarsinogenik tambahan (
Mohammad dkk., 2015). Konsumsi xylitol, salah satu dari dua belas
bahan kimia dengan nilai tambah yang signifikan secara ekonomi dari
kilang biomassa (Werpy dkk., 2004), telah mencapai nilai global
tahunan sebesar $340 juta dan diperkirakan akan tumbuh hingga $540
juta per tahun (Ravella dkk., 2012). Produksi industri xylitol dengan
reduksi kimia xilosa, terutama berasal dari tongkol jagung, batang
kedelai, ampas tebu, dan kayu ringan. Kelemahan dari proses kimia
adalah proses hilirnya yang mahal (Granstrom dkk., 2007), kebutuhan
energi yang tinggi dan masalah lingkungan akibat produk sampingan
beracun seperti Ni+meningkatkan minat terhadap proses produksi
xylitol yang lebih ramah lingkungan (Su dkk., 2013).
∗Penulis yang sesuai.
Alamat email:madhavan85@hotmail.com (KM Nampoothiri).
proses kimia komersial, misalnya kebutuhan energinya jauh lebih kecil (
Canilha dkk., 2013), dan lebih sedikit persyaratan sehubungan dengan
kemurnian xilosa substrat. Dua jalur biosintetik untuk konversi xilosa
menjadi xylitol diketahui pada mikroorganisme: reduksi langsungD-xilosa
menjadi xylitol oleh xilosa reduktase yang bergantung pada NAD(P)H atau
isomerisasiD-xilosa menjadi xilulosa oleh xilosa isomerase diikuti dengan
reduksi menjadi xylitol oleh xylitol dehydrogenase (Akinterinwa dkk., 2008).
Beberapa ragi dikenal karena kemampuannya menghasilkan xylitol (
Granstrom dkk., 2007; Li dkk., 2015). Namun, penerapannya dalam industri
makanan harus dikurangi karena beberapa di antaranya bersifat patogen (
Fridkin dan Jarvis, 1996). Hanya beberapa spesies bakteri saja yang termasuk
CorynebacteriumDanmikobakterium spesies menghasilkan jumlah xylitol
yang sangat rendah secara alami (Yoshitake dkk., 1973; Izumori dan Tuzaki,
1988). Ekspresi gen xilosa reduktase yang heterogen dari berbagai sumber
ragi meningkatkan konversi langsung xilosa menjadi xylitol, misalnyaE.coli (
Cirino dkk., 2006; Hibi dkk., 2007). Ekspresi heterolog dari transporter xilosa (
XylE)gen dalam axylADanyhbCkurangE.colistrain memungkinkan
penyerapan xilosa dan produksi xylitol (Cirino dkk., 2006; Hibi dkk., 2007).
Inaktivasi sistem CRP yang bergantung pada cAMP meningkatkan produksi
xylitol pada strain yang mengekspresikan gen transporter xylosa XylE atau
XylFGH (Khankal dkk., 2008) dan ini

http://dx.doi.org/10.1016/j.jbiotec.2016.05.011 0168-1656/©
2016 Elsevier BV Hak cipta dilindungi undang-undang.
64 KS Dhar dkk. / Jurnal Bioteknologi 230 (2016) 63–71

Tabel 1
Strain mikroba dan plasmid yang digunakan dalam penelitian ini.

Strain mikroba & Karakteristik Referensi

plasmid

A E.coli
DH5- DH5a Fthi-1 endA1 hsdr17(r-, m-) supE44 lacU169 (f80lacZ M15) recA1 gyrA96 relA1 Hanahan, 1983

B C.glutamikum
ATCC13032 Tipe liar (WT) Abe dkk., 1967
Cg-xr1 SpesifikasiRC.glutamikumdenganpeKEx3-xruntuk konversi xilosa menjadi xylitol Pelajaran ini
Cg-xr2 SpesifikasiRC.glutamikumdenganpeKEx3-xrtuntuk transportasi pentosa dan sintesis xylitol dari xilosa Pelajaran ini

Cg-xr3 SpesifikasiRC.glutamikumdenganpeKEx3-xrtFuntuk transportasi pentosa dan sintesis xylitol dari Pelajaran ini
xilosa.
Cg-ab1 KanRC.glutamikumdenganpVWEx1-apxvektor konversi arabinosa menjadi xylitol KanR, Pelajaran ini
Cg-ax1 SpesifikasiRC.glutamikumdenganpVWEx1-apxDanpeKEx3-xrsintesis xylitol dari arabinosa Pelajaran ini
dan xilosa.
Cg-ax3 KanR, SpesifikasiRC.glutamikumdenganpVWEx1-apxDanpeKEx3-xrtFuntuk sintesis xylitol Pelajaran ini
transpor pentosa dari arabinosa dan xilosa

C vektor
pVWEx1 E.coli-C. glutamatvektor antar-jemput untuk ekspresi gen yang diatur (Ptak,lacIq, pCG1 Peters-Wendisch dkk., 2001
oriVCg)
pEKEx3 E.coli-C. glutamatvektor antar-jemput untuk ekspresi gen yang diatur (Ptak,lacIq, pBL1 Stansen dkk., 2005
oriVCg)
pEKEx3-xr Turunan daripeKEx3untuk ekspresi yang diaturxrgen Pelajaran ini
pEKEx3-xrt Turunan daripeKEx3untuk ekspresi yang diaturxrgen denganaraTturunan gen dari Pelajaran ini
pEKEx3-xrtF peKEx3untuk ekspresi yang diaturxrgen denganaraTFturunan gen daripVWEx1untuk Pelajaran ini
pVWEx1-apx ekspresi yang diaturaraA, dpe, lxrgen untuk sintesis xylitol dari arabinosa Pelajaran ini

(KanR) Resistensi Kanamisin, (SpesifikasiR) resistensi spektinomisin.

rekombinanE.colistrain menggunakan xilosa dan glukosa secara
bersamaan tanpa represi katabolit. Selain itu,Laktokokus laktis
dilengkapi dengan xilosa reduktase dariPichia stipitis (Nyyssola dkk.,
2005) DanBacillus subtilisdilengkapi denganD-xylitol fosfat
dehidrogenase dariClostridium sulitatauLactobacillus rhamnosus (
Povelainen dan Miasnikov, 2007) terbukti menghasilkan xylitol dari
xilosa. Produksi xylitol dariaku-arabinosa secara rekombinan
E.colistrain dilaporkan (Sakakibara dkk., 2009).
Suatu proses industri harus ramah lingkungan dan layak secara
ekonomi. Lignoselulosa dianggap sebagai sumber karbohidrat
terbarukan dan melimpah, terutama terdiri dari selulosa, hemiselulosa,
dan lignin. Perlakuan awal dengan asam encer (<2%, b/b) adalah
metode yang paling diterima untuk pelepasan selulosa dari
lignoselulosa. Cairan bekas heterogen yang diperoleh setelah hidrolisis
asam disebut cairan yang diolah dengan asam (APL). APL merupakan
campuran gula pentosa (xilosa dan arabinosa), glukosa, lignin dan
inhibitor (furfural, asam, senyawa fenolik, dll) dan komposisinya
bervariasi menurut sumber lignoselulosa (Pienkos dan Zhang, 2009).
Namun pemanfaatan langsung gula ini di APL terhambat oleh turunan
beracun yang terbentuk selama proses pra-perlakuan. Namun,
sebagian besar metode yang dikembangkan untuk mendetoksifikasi
APL kaya gula pentosa mahal atau tidak efisien (misalnya karena
hilangnya gula akibat adsorpsi non-spesifik). Konversi langsung APL
kaya gula pentosa oleh mikroba bandel akan mempunyai potensi yang
sangat besar. Penggunaan APL sebagai sumber karbon untuk produksi
xylitol jarang dipertimbangkan (Yoon dkk., 2011).
Actinomycete GRAS (Umumnya Diakui Sebagai Aman),C.glutamikum
tetap menjadi salah satu biokatalis terbaik untuk produksi industri
asam amino dan bahan kimia lainnya selama lebih dari 50 tahun (
Zahoor dkk., 2012). Di seluruh duniaaku-glutamat danaku-produksi lisin
melalui fermentasi berjumlah sekitar 3 juta dan 2 juta ton per tahun (
Heider dan Wendisch, 2015). Lapisan lipid luar yang kaya asam mikolat
pada dinding selnya meningkatkan integritas struktural membran luar
dan dengan demikian memberikan toleransi tekanan osmotik terhadap
gula dan inhibitor konsentrasi tinggi (Bayan dkk., 2003). C. glutamicum
menunjukkan toleransi yang tinggi terhadap asam organik, furan, dan
inhibitor fenolik yang terdapat dalam hidrolisat lignoselulosa dalam
kondisi kekurangan oksigen
(Sakai dkk., 2007). Peningkatan toleransi ini membantu memanfaatkan
campuran sumber karbon dan inhibitor yang ada dalam hidrolisat
biomassa (Akinterinwa dkk., 2008; Gopinath dkk., 2011). Genom yang
diurutkan sepenuhnya dengan sumber daya rekayasa metabolisme
sistem yang mapan, termasuk interferensi CRISPR (Cleto dkk., 2016)
memudahkan ruang lingkup manipulasi genetik bakteri ini (Kalinowski
dkk., 2003). Akibatnya, berbagai bahan kimia bernilai tambah termasuk
asam suksinat (Okino dkk., 2008), isobutanol (Smith dkk., 2010), 1,2-
propanediol (Niimi dkk., 2011) asam organik (Wieschalka dkk., 2013)
prekursor monomer untuk poliamida (Hadiati dkk., 2014) selain asam
amino (Becker dan Wittmann, 2012) menggunakan rekombinan
C.glutamikummencerahkan pentingnya dalam berbagai sektor
bioteknologi industri.C.glutamikumtelah direkayasa untuk
pemanfaatan arabinosa dan xilosa (Kawaguchi dkk., 2008; Kawaguchi
dkk., 2006) dan untuk produksi asam amino, suksinat dan diamina dari
hidrolisat lignoselulosa (Meiswinkel dkk., 2013; Gopinath dkk., 2011;
Buschke dkk., 2011).C.glutamikumtidak dapat memanfaatkan xylitol,
tetapi manitol dan arabitol (Laslo dkk., 2012; Peng dkk., 2011). Ekspresi
heterolog gen xilosa reduktase dariPichia stipitisdi dalamC.glutamikum
menyebabkan produksi xylitol dari xilosa murni dan glukosa (Kim dkk.,
2010). Demikian pula dengan xilosa reduktase dariCandida tenuis
dalam rekombinanC. glutamicum (-ldhA, -xylB, -ptsF)mengekspresikan
gen transporter pentosaaraEdariC.glutamikum ATCC31831
mengaktifkan produksi xylitol (Sasaki dkk., 2010). Namun, produksi
xylitol bebas arabitol (Yoon dkk., 2011) dari campuran substrat
kompleks menggunakan rekombinanC.glutamikumbelum dilaporkan.
Sejauh pengetahuan kami, ini adalah laporan pertama tentang konversi
simultan xilosa dan arabinosa yang ada di APL menjadi xylitol
menggunakan teknologi rekayasa.C.glutamikum.
2. Bahan-bahan dan metode-metode
2.1. Strain dan vektor mikroba
C.glutamikumATCC 13032 (Abe dkk., 1967) digunakan sebagai liar-
ketik regangan untuk percobaan kami. Semua strain dan vektor mikroba yang digunakan
dalam penelitian ini tercantum dalamTabel 1.
 KS Dhar dkk. / Jurnal Bioteknologi 230 (2016) 63–71 65

Meja 2
Daftar nukleotida oligo khusus yang digunakan dalam penelitian ini.

Tidak Nama Oligos Urutan

5'→3'

01 xr PstI F AATATACTGCAG TAAAGGAGATATACATATGTCGCAGCAGATCCCC

02 xr Bam HI R ATATTAGGATCC TTACTGGATTCTTGACCTGGTACTTGG
03 araT BL F ATGGTTAATGAAAAGAAAATCTCAA
04 ara T BL R TTACGCGCTTTTTCCGC
05 araT tanda F ATGGCAGGGCACATCATCCGCTCAGACAGCCGGCCAATCGAAGGAGTAATGATGACAGA-
GACTGTTCAACAAACCAAGAAAATCTCAAGTGGCTTCAT
06 araT Bam HI F TATTATGGATCC CTATACTACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGCAGGGCACATCATCCG
07 araT EcoRI R TAGTAATGAATTC TTACGCGCTTTTTCCGCCTAC ATTATCTAGA AGGAGGACACGATAATGACG
08 araA xbaI F ATATAGAATTC ACGCGTCAGCGTCGCAT TATACGAATTC AGGAGGGACACCCATGAAACAC
09 araA EcoRI R TCATACTCGAG GCCGAACCGGGCGAC
10 dpe EcoRI F
11 dpe XhoI R
12 lxr XhoI F GATATCTCGAG AGGAGGATCTAATGACCACCACCGACGAC TGTATGGTACC
13 lxr KpnI R GGAGCTCTACCCG GCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGA AGGAGGAACGATAATGACG
14 araA gba F GCCGTGTTTCATGGGTGTTCCTCCTGAATTCACGCGTCAGCGTCGCATC
16 araA gba R GATGCGACGCTGACGCGTGAATTCAGGAGGAACACCCATGAAACACGGC
17 dpe gba F CGGTGGTGGTCATTAGATATCCTCCTCTCGAG
18 dpe gba R GCCGAACCGGGCGACGGCGCCGTCGCCCGGTTCGGCCTCGAG
19 lxr gba F AGGAGATATCTAATGACCACCACCG
20 lxr gba R GACGGCCAGTGAATTCGAGCTCGGTAACCGGAGCTCTACCCGGCCAC

Wilayah yang digarisbawahi mewakili situs pembatasan.

2.2. Bahan kimia Tabel 3

Komposisi hidrolisat pekat dari brangkasan sorgum yang diolah dengan asam encer.

Semua bahan kimia yang digunakan berkelas analitis, diperoleh dari Komponen Konsentrasi (g/L)
Sigma-Aldrich (Steinheim, Jerman), Merck (Darmstadt, Jerman) dan Glukosa 5.78±0,2
Fluka (Buchs, Swiss). Tripton, Ekstrak Ragi, Luria Bertani (LB), Infus Xilosa 29.36±0,1
Jantung Otak (BHI) dan Potato Dextrose Agar (PDA) dipasok oleh Merck, Arabinosa 5.64±0,2
India. Enzim dan kit yang digunakan untuk biologi molekuler diperoleh Mannose 0,82±0,1
Galaktosa 0,56±0,02
dari New England Biolabs (NEB, Ipswich, USA), Qiagen (GmbH, Hilden),
Asam asetat 0,06±0,01
Thermo saintifik (Lithuania) dan Sigma Aldrich (Steinem, Jerman). Asam folat 0,03±0,01
Oligonukleotida yang dibuat khusus diperoleh dari Genosys (Sigma- Furfural 0,58±0,02
Aldrich). 5-Hidroksimetilfurfural 0,25±0,01

2.3. Media
ItuE.colidipertahankan dalam medium Luria – Bertani (10 g/L tripton, 5 g/
L ekstrak ragi, dan 5 g/L natrium klorida). Ragi Rhodotorula mucilaginosa
isolat NBT11 dikultur dalam media nutrisi (medium YXP) yang mengandung
40 g/L xilosa, 10 g/L ekstrak ragi, 5 g/LK2HPO4, 5 gr/L KH2PO4dan 0,002 g/L
MgCl22untuk isolasi RNA. RekombinanC.glutamikumstrain ditanam pada
usia 30◦C dalam medium BHI yang mengandung 5 g/L infus jantung sapi,
12,5 g/L infus otak anak sapi, 2,5 g/L Na2HPO4,2 g/L glukosa, 10 g/L pepton
dan 5 g/L NaCl. Studi fermentasi dilakukan dengan menggunakan dua varian
gula medium yang mengandung garam CGXII (Keilhauer dkk., 1993) dengan
kombinasi glukosa, xilosa dan arabinosa sebagai sumber karbon, ditetapkan
sebagai media CGXII-AXG dan SAPL. Media SAPL mengandung APL pekat
dari brangkasan sorgum sebagai bahan dasar gula. Berdasarkan
perbandingan gula yang ada dalam medium, selanjutnya ditetapkan sebagai
medium CGXII-AXG1 dan medium SAPL1 yang mengandung 10 g/L glukosa,
15 g/L xilosa, dan 15 g/L arabinosa (1:1,5:1,5). Sedangkan medium CGXII-
AXG2 dan SAPL2 masing-masing mengandung 10 g/L gula (1:1:1). Media
fermentasi disterilkan dengan cara filtrasi (0,2 -M, Pall life Sciences, USA).
Variasi komposisi gula APL disesuaikan dengan gula murni untuk
pembuatan media SAPL.
2.4. Modifikasi genetik
Semua teknik biologi molekuler standar dilakukan sesuai protokol
yang dijelaskan olehSambrook dan Russell (2001). Isolasi DNA genom
dilakukan dengan kit isolasi DNA genom Gen Elute (Sigma, India).
Isolasi plasmid dilakukan menggunakan mini kit plasmid GeneJet
(Thermo Scientific, Lithuania) dan produk PCR-nya
dimurnikan dengan kit pemurnian PCR cepat QIA (Qiagen, Jerman)
sesuai instruksi yang diberikan oleh produsen.
2.5. Pembangunan pEKEx3-xrtFplasmid
Gen xilosa reduktase (xr) diisolasi dariR.mucilaginosamengisolasi
NBT11 (MTCC 12464) dengan sintesis cDNA (ProtoScript, NEB).
amplifikasi PCR darixrgen dari cDNA dilakukan dengan menggunakan
oligonukleotida spesifik 1 dan 2 (Meja 2) dengan situs pengikatan
ribosom di bagian hulu (−7 bp) dari kodon awal dengan mengacu pada
urutan yang dipublikasikan (nomor akses GenBankHM038240 ) (Xu
dkk., 2011). Amplikon 975 bp (nomor akses GenBank KT154803)
dikloning kepeKEx3di bawahPtaksetelah pencernaan dengan enzim
restriksi PstI dan BamHI (NEB, USA). Plasmid yang dihasilkan ditetapkan
sebagaipeKEx3-xrdan selanjutnya dimodifikasi dengan transporter
arabinosa/pentosa (AraT) untuk memfasilitasi transpor pentosa
melintasi membran.araTgen dari DNA genom
B. licheniformis (ATCC 14580) diamplifikasi dengan PCR menggunakan
oligonukleotida spesifik 3 dan 4 (Meja 2). ItuaraTdisesuaikan dengan
PCR (menggunakan oligonukleotida 4 dan 5,Meja 2) dengan tambahan
75 bp 5'segmen gen terminal yang diadopsi dariaraEgen dari
C.glutamicum ATCC 31831untuk memperoleharaTFgen fusi. Gen fusi
1478 bp (araTF)selanjutnya diamplifikasi dengan PCR menggunakan
oligonukleotida 6 dan 7 (Meja 2) dengan situs pengikatan ribosom di
bagian hulu (−7 bp) dari kodon awal. ItuaraTFgen kemudian dikloning
peKEx3-xrdi bawah xrgen setelah pencernaan dengan Bam HI dan
EcoRI. Plasmid yang direkayasa disebutpeKEx3-xrtdiubah menjadiE.coli
DH5- sel untuk pemeliharaan. Bantalan transformanpeKEx3turunannya
disaring dalam medium LB yang dilengkapi dengan spektinomisin (0,1
g/L).
66 KS Dhar dkk. / Jurnal Bioteknologi 230 (2016) 63–71
2.6. Konstruksi pVWEx1-apx plasmid
ItuaraA (NC 000913),dpe (NC 003063) Danlxr (NC 008596) gen
diamplifikasi dari DNA genomE.coli K12 (ATCC 47076),A. tumefaciens
strain C-58 (ATCC 33970) danM.smegmatis saring mc2155 (ATCC
700084) masing-masing menggunakan oligonukleotida 8–13 diikuti
oleh 14–20 yang tercantum dalamMeja 2. Gen-gen tersebut dirancang
bersama-sama secara bersamaan dengan situs pengikatan ribosom di
antaranya oleh perakitan Gibson (NEB, AS) sesuai instruksi pabrik.
Segmen gen linier diklon setelah diinduksi IPTG (Ptak) promotor dari
pVWEx1untuk mendapatkan transkrip polisistronik. Plasmid yang
dihasilkanpVWEx1-apxdiubah menjadiE.coliSel DH5- dan transforman
dipilih menggunakan media LB yang mengandung kanamisin (0,05 g/L).
2.7. Transformasi C. glutamicum dengan rekayasa plasmid untuk
sintesis xylitol
Sel kompeten elektro yang baru disiapkanC.glutamikumdigunakan
untuk transformasi (Van Der Rest dkk., 1999). Transforman daripVWEx1
turunannya disaring dalam pelat BHI yang dilengkapi dengan
kanamisin (0,05 g/L) dan BHI dengan spektinomisin (0,1 g/L) untuk
peKEx3turunan. Kedua antibiotik tersebut ditambahkan untuk
rekombinan yang mengandung kedua plasmid.
2.8. Pembuatan hidrolisat biomassa brangkasan sorgum dengan
pretreatment asam
Hidrolisat Sorghum Stover dibuat dengan hidrolisis asam encer
menggunakan asam sulfat 2% (b/v) pada suhu 121◦C selama 70 menit
dalam autoklaf dengan pembebanan padat 30% (b/v). Biomassa yang
dihasilkan dicuci dengan air deionisasi dan cairan pencuci (APL)
dinetralkan (pH≥6.5) dengan kalsium karbonat diikuti dengan NaOH.
APL yang diencerkan dipekatkan dalam konsentrator vakum untuk
mendapatkan konsentrasi pentosa (terutama xilosa) yang diperlukan
untuk formulasi medium (media SAPL) dan mengetahui komposisinya
dengan analisis HPLC (Tabel 3). Konsentrat APL dimurnikan dan
disterilkan dengan penyaringan melalui filter 0,2.
2.9. Fermentasi batch
50 mL medium CGXII, CGXII-AXG1 dan SAPL1 yang ditambah
dengan masing-masing antibiotik disalurkan dalam labu berbentuk
kerucut Erlynmeyer 250 mL dan diinokulasi dengan strain rekombinan
berumur 16 jam (2 g cdw/L). Ekspresi langsung gen rekombinan dicapai
dengan induksi IPTG (1 mM) bersamaan dengan inokulasi. Labu
diinkubasi pada 200 rpm selama 16 jam pada suhu 30◦C. Sampel
diambil setiap 2 jam dan dianalisis pemanfaatan gula dan produksi
xylitol.
2.10. Fermentasi batch yang diberi makan
Fermentasi fed batch dilakukan di fermentor paralel Infors HT
Multifor, dilengkapi dengan sistem kontrol terkalibrasi dan otomatis
untuk suhu, DO, pH, kecepatan impeler, dan laju aerasi. Kapasitas total
fermentor adalah 750 mL, dimana volume kerja diatur menjadi 200 mL
dengan media CGXII-AXG2 dan SAPL2. Setelah sterilisasi, media
diinokulasi dengan 16 jam Cg-ax3sel (10 g cdw/L). Induksi gen (1 mM
IPTG) dilakukan segera setelah inokulasi. Fermentasi dilakukan di
bawah aerasi 0,1vvm dengan kecepatan pengadukan yang bervariasi.
Dua impeler berbilah enam tipe rushton digunakan untuk memastikan
pencampuran media fermentasi yang tepat. Sistem kaskade
mengontrol oksigen terlarut (DO) sebesar 10% dengan memvariasikan
kecepatan pengaduk dalam batas 50–200 rpm. Suhu dipertahankan
pada 30◦C dengan penangas air yang bersirkulasi. PH dipertahankan
pada 6,5±0,2 menggunakan 1 N
HCl dan NaOH 1 N. Busa dikendalikan dengan menggunakan bahan
antibusa 10 ppm (Antifoam-O30, Sigma). DO dan pH diukur melalui
probe DO polarografi dan elektroda pH platinum (Mettler Toledo).
Fermentasi dilakukan selama 12 jam dengan penambahan 10 mL
campuran gula (untuk CGXII-AXG2) atau APL pekat (untuk media SAPL2)
yang mengandung glukosa, xilosa, dan arabinosa (masing-masing 10
g/L) setiap 4 jam. Pengambilan sampel dilakukan setiap interval 2 jam
untuk penentuan gula dan xylitol.
2.11. Analisis spektrofotometri
Kepadatan sel ditentukan secara spektrofotometri pada 610 nm
menggunakan spektrofotometer UV-vis (UVA-6150, Shimadzu, Jepang).
Pembaca lempeng mikro Tecan Infinite 200 digunakan untuk
mengukur konsentrasi NADPH pada 340 nm.
2.12. Analisis enzim
RekombinanC.glutamikumsel yang ditumbuhkan dalam 50 mL
medium CGXII-AXG1 dipanen setelah 6 jam induksi IPTG (24 jam setelah
inokulasi) dengan sentrifugasi pada 6000Gjam 4◦C selama 6 menit.
Pelet sel dicuci dua kali dengan buffer ekstraksi (50 mM Tris HCl pH 7,0)
dan disalurkan dalam 2,0 mL. Suspensi sel disonikasi menggunakan
homogenizer ultrasonik (sel Vibra, Sonics and material Inc, USA) dalam
penangas es selama 10 menit. Protein yang diekstraksi (filter 0,2 -m,
ilmu kehidupan Pall) yang dimurnikan diukur dengan metode Bradford
(Bradford, 1976) menggunakan Bovine Serum Albumin (BSA) sebagai
standar. Protein diselesaikan dalam elektroforesis gel Natrium dodesil
sulfat-poliakrilamida (SDS-PAGE, poliakrilamida 12%) dan dianalisis
setelah diwarnai dengan Coomassie-Brillian blue-R250 (Sambrook dan
Russell, 2001)
Aktivitas xilosa reduktase diperiksa untuk protein kasar yang
diisolasiCg-xr1,di mana oksidasi NADPH dipantau untuk aktivitas enzim
(Sasaki dkk., 2010). Aktivitas xilosa reduktase ditentukan dengan
memantau perubahan absorbansi pada 340 nm setelah oksidasi
NADPH pada 30◦C. Reaksi dilakukan dalam buffer yang mengandung 50
mM kalium fosfat (pH 6,0), 2 mM NADPH dan 200 mM xilosa.
Penurunan serapan setelah inkubasi pada suhu 30◦C diukur pada 340
nm dalam microplate reader (Infinite 200, Tecan). Aktivitas enzim
dinyatakan sebagai aktivitas spesifik (unit per mg protein), di mana satu
unit setara dengan konversi 1 mol NADPH per menit dalam kondisi
pengujian standar.
Protein intraseluler dariCg-ab1dianalisis untukaku- isomerase
arabinosa (AraA),D-psikose 3 epimerase (Dpe) dan aku-aktivitas xilulosa
reduktase (Lxr). Konversi dariaku-arabinosa keaku-ribulosa dipantau
aku-Aktivitas AraA, dan sintesis psicose dari fruktosa diukur untuk
aktivitas Dpe. Kedua pengujian enzim dilakukan dalam campuran reaksi
yang mengandung 100 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mMaku-arabinosa
untuk arabinosa isomerase sedangkan 100 mM fruktosa dan 1 mM
MnCl2untukD-psikose 3 epimerase pada 30◦C selama inkubasi 5 menit (
Sakakibara dkk., 2009). Reaksi dihentikan dengan menjaganya pada 100
◦C selama 5 menit. Penipisan arabinosa dan sintesis psikose diukur
dengan analisis HPLC. Aktivitas enzim ditentukan dalam, unit enzim (U),
didefinisikan sebagai jumlah enzim yang diperlukan untuk konversi 1
mol substrat per menit dalam kondisi pengujian standar dan
dinyatakan dalam satuan per mg protein.
Aktivitas xilulosa reduktase dilakukan dalam buffer yang mengandung
100 mM Tris-HCl (pH 9,0), 0,5 mM MgCl2, 2 mM NADP+, dan 100 mM xylitol.
Aktivitas enzim ditentukan berdasarkan peningkatan absorbansi pada 340
nm yang disebabkan oleh penurunan NADP+menjadi NADPH, hingga
oksidasi xylitol menjadi xilulosa dalam kondisi pengujian standar. Satu unit
(U) didefinisikan sebagai jumlah

Gambar 1.Representasi skema jalur sintetik heterologus xylitol dalam rekombinan
C.glutamikumtekananCg-ax3.Kotak berarsir menunjukkan enzim rekombinan yang
terlibat dalam jalur tersebut. Keduanyaaku-arabinosa danD-xilosa diangkut melintasi sel
dengan bantuan pentose transporter fusion protein (AraTF).D-Xylose diubah menjadi
xylitol dengan bantuan xilosa reduktase (Xr) yang bergantung pada NAD(P)H.aku-
Arabinosa diubah menjadi xylitol melalui aksi gabungan arabinose isomerase (AraA),D-
psikose 3 epimerase (Dpe) danaku-xilulosa reduktase (Lxr). Setara pereduksi (NAD(P)H)
untuk reaksi yang dihasilkan oleh glukosa (Jalur Pentosa Fosfat). Xylitol yang diproduksi di
dalam sel dikeluarkan melalui transporter (?) yang tidak diketahui.
enzim yang dibutuhkan untuk mereduksi 1,0 -mol NADP+ke NADPH
dalam kondisi pengujian per menit (U/ mg total protein).
2.13. Analisis metabolisme
Gula, xylitol dan inhibitor dianalisis dengan sistem Kromatografi
Cair Kinerja Tinggi (HPLC) otomatis (Prominence UFLC, Shimadzu,
Jepang) yang dilengkapi dengan pompa pengiriman pelarut (LC 20AD),
auto sampler (SIL20AC-HT), dan oven kolom (CTO -20AC). Gula dan gula
alkohol diselesaikan dengan Phenomenex Razex RPM Pb2+kolom
monosakarida penukar kation (300×7,5 mm) dengan filter inline dan
kolom pelindung dioperasikan pada 80◦C menggunakan air deionisasi
(0,6 mL/menit) sebagai eluen. Gula dan xylitol terdeteksi di detektor RI
(RID-10A Shimadzu, Jepang). Inhibitor termasuk asam organik
diselesaikan dalam kolom HPX-87H (Bio-rad Aminex, USA)
menggunakan 5 mM H.2JADI4sebagai eluen dengan laju alir 0,5 mL/
menit pada suhu 50◦C dideteksi menggunakan detektor PDA
(SPDM-20A, Shimadzu, Jepang). 20–50 -L sampel yang disaring (filter 0,2
-M) digunakan untuk analisis dalam kedua kasus dan kuantifikasi
dilakukan berdasarkan kurva kalibrasi yang diperoleh dari
kromatogram standar yang diketahui.
3. Hasil
Tujuan dari pekerjaan ini adalah untuk merekayasaC.glutamikum
untuk konversi langsung gula lignoselulosa pentosa xilosa dan
arabinosa menjadi xylitol (Gambar 1).
3.1. Ekspresi dan analisis gen untuk konversi xylitol dari xilosa di C.
glutamicum
Gen xilosa reduktasexrdariR.mucilaginosaNBT11 diungkapkan dalam
C.glutamikumATCC13032 menghasilkan reganganCg-xr1. Ekstrak kasar dari
strainCg-xr1menunjukkan xilosa yang bergantung pada NADPH
teknologi 230 (2016) 63–71 67
aktivitas reduktase 6.4±0,1 U/mg protein. Dengan NADH sebagai
reduktor aktivitas xilosa reduktase sebesar 4,3±ditemukan 0,1 U/mg.
Ekstrak kasar dari strain induk tidak memiliki aktivitas xilosa yang
bergantung pada NADPH dan NADH.C.glutamikumATCC 13032 mampu
mengimpor arabinosa dan xilosa, namun konsumsi pentosa ini
ditingkatkan ketika gen yang mengkode sistem serapan heterolog
diekspresikan (Sasaki dkk., 2009). Peran transporter gula non spesifik
untuk sintesis xylitol diE.coliDanC.glutamikumsudah dipelajari (Khankal
dkk., 2008; Sasaki dkk., 2010). Dalam penelitian ini, AraT dariB.
licheniformisdigunakan. AraT asli digunakan dalam strainCg-xr2.Atau,
urutan sinyal AraE dariC.glutamikumATCC31831 digabungkan dengan
rangkaian protein matang AraT dariB. licheniformis.Strain rekombinan
Cg-xr3protein AraT yang diproduksi secara berlebihanFdan XR. Analisis
SDS-PAGE menunjukkan petunjuk ekspresi AraTF(52,7 kDa) dan Xr (35,4
kDa) dengan pewarnaan Coomassie-Brillian blue-R250. Ekspresi AraTF
peningkatan titer xylitol dari 1,2±0,2 g/L hingga 6,2±0,2 gram/L (Tabel 4).
3.2. Ekspresi dan analisis gen untuk sintesis xylitol dari
Arabinose
Arabinosa dapat diubah menjadi xylitol melalui 3 reaksi yang dikatalisis
oleh enzim yang berbeda asal (Sakakibara dkk., 2009). Setelah isomerisasi
aku-arabinosa keaku-ribulosa oleh arabinose isomerase (AraA) D-konversi
psikose 3-epimerase (Dpe).aku-ribulosa keaku-xilulosa. Terakhir, bergantung
pada NADPHaku-xilulosa reduktase (Lxr) berkurangaku- xilulosa menjadi
xylitol. Ekspresi genaraA, dpeDanlxrsebagai operon sintetik dan
dioperasikan di bawah inducible IPTG (Ptak) promotor plasmid pVWEx1 di
C.glutamikumregangan yang dihasilkanCg-ab1. Analisis SDS-PAGE
mengungkapkan pita protein pada 56 kDa, 31,5 kDa, dan 26,9 kDa masing-
masing mewakili AraA, Dpe, dan Lxr. Ekstrak kasar dari strainCg-ab1
menunjukkan aktivitas spesifik untuk AraA sebesar 4.3±0,1 U/mg, Dpe 5,6±
0,3 U/mg, dan Lxr 3,6±0,2 U/mg. Seperti yang diharapkan, aktivitas Lxr lebih
rendah (0,8 U/mg) ketika NADH digunakan sebagai pengganti NADPH untuk
pengujian enzim.
3.3. Fermentasi batch untuk produksi xylitol
Strain rekombinan dengan susunan genetik pengubah xilosa dan
arabinosa dipelajari untuk produksi xylitol dari gula pentosaD-xilosa
danaku-arabinosa. Strain dianalisis pemanfaatan gula dan produksi
xylitol dalam media CGXII dengan sumber karbon individu (Glukosa,
Xylose dan Arabinose) (masing-masing 20 g/L). Kondisi fisik fermentasi
sama seperti yang disebutkan pada bahan dan metode. Kehadiran
glukosa ditemukan sangat penting untuk produksi xylitol dari xilosa
dan arabinosa, dimana strain tersebut gagal menghasilkan xylitol tanpa
adanya glukosa bahkan setelah 72 jam inkubasi. Suplementasi glukosa
(10 g/L) telah memulai sintesis xylitol dari gula pentosa individu. Strain
rekombinan terakhirCg-ax3telah menghasilkan 6.3±0,4 g/L xylitol dari
6,5±0,3 g/L xilosa dan 4,4±0,3 g/L xylitol dari 6.1±0,3 g/L arabinosa yang
digunakan (Gambar 2A dan B). Produksi xylitol secara batch
menggunakan strain rekombinan selanjutnya divalidasi dalam medium
CGXII-AXG1. Media ini mengandung campuran 10 g/L glukosa, 15 g/L
xilosa dan 15 g/L arabinosa sebagai sumber karbon. Kondisi fisik sama
seperti yang dijelaskan pada bahan dan metode. KeteganganCg-ax3
telah sepenuhnya memanfaatkan glukosa dalam waktu 10 jam setelah
inkubasi dan menunjukkan produksi xylitol yang lebih baik (Gambar 3A)
dari kedua gula pentosa (xilosa dan arabinosa) yang ada dalam
medium CGXII-AXG1 dibandingkan dengan strain rekombinan lainnya (
Tabel 4). Kompetensi penghasil xylitolCg-ax3 diverifikasi lebih lanjut
dengan menggunakan dalam medium SAPL1 (berdasarkan cairan
rebusan sorgum yang telah diolah sebelumnya dengan konsentrasi
gula 10 g/L glukosa, 15 g/L xilosa, dan 15 g/L arabinosa) dan
menunjukkan hasil yang sebanding yang diperoleh di CGXII- media
AXG1. Produksi xylitol adalah 6,7±0,4 g/L dengan produktivitas 0,28±
0,03 gram/g
68

Gambar 2.Fermentasi
(10 g/L) sebagai gula
karbon dan xylitol con
(-)xylitol. Datanya

Gambar 3.Profil fermentasi strain rekombinan akhirCg-ax3 (pVWEx1-apxDanpeKEx3-xrtF)memiliki jalur biokonversi xilosa dan arabinosa untuk produksi xylitol. (A) Profil fermentasi batch
dalam media CGXII-AXG1. (B) Profil fermentasi batch dalam medium SAPL1. (C) Profil fermentasi Fed batch dalam medium CGXII-AXG2 (D) Profil fermentasi Fed batch dalam medium
SAPL2. Grafik menunjukkan kurva konsentrasi biomassa, gula dan xylitol selama 12 jam inkubasi. Buka pengawal (-) glukosa; segitiga terbuka (-) xilosa; berlian terbuka (♦)arabinosa;
bintang ( ) biomassa dan lingkaran terisi (-) xylitol. Panah ke bawah (↓)menunjukkan interval waktu penambahan gula. Data yang ditampilkan adalah rata-rata percobaan rangkap tiga
yang dilakukan dan standar deviasi yang dihitung kurang dari 10%.
 KS Dhar dkk. / Jurnal Bioteknologi 230 (2016) 63–71 69

Tabel 4
Pemanfaatan gula dan produksi xylitol oleh strain rekombinanC.glutamikumdengan fermentasi batch menggunakan media CGXII-AXG1.

Tidak Strain Modifikasi Pemanfaatan xilosa (g/L) Pemanfaatan Arabinosa (g/L) Produksi xylitol (g/L) Produktivitas (g/g cdw/jam)

1 Cg-xr1 xr 1.2±0,2 – 1.1±0,1 0,05±0,01

2 Cg-xr2 xr, araT 1.7±0,3 – 1.6±0,2 0,07±0,02
3 Cg-xr3 xr, araTF 6.4±0,3 – 6.2±0,2 0,26±0,02
3 Cg-ab1 araA,dpe,lxr – 1.1±0,2 0,8±0,1 0,04±0,01
4 Cg-ax1 xr, araA,dpe,lxr 1.1±0,1 0,9±0,1 1.8±0,2 0,08±0,01
6 Cg-ax3 xr, araTF,araA,dpe,lxr 4.4±0,1 3.4±0,2 6.7±0,4 0,28±0,03

Tabel 5
Perbandingan produksi dan produktivitas xylitol berdasarkan rekayasaC.glutamikumdalam kondisi fed batch.

RekombinanC. Gula digunakan untuk Biomassa yang digunakan (mis silitol volumetrik Spesifik Referensi
glutamat fermentasi DCW/L) konsentrasi produktivitas dari produktivitas dari
genotip (g/L) xylitol (g/L/jam) xylitolD(g/g cdw/jam)

xil 1 Glukosa + Xilosa 9.2 34A 0,9 0,09 Kim dkk., 2010
araE, -ldh, CtXR, -ptsF, -xylB xr, Glukosa + Xilosa 40 166B 7.9 0,20 Sasaki dkk., 2010
araTF,araA, dpe, lxr Glukosa + Xilosa + Arabinosa 10 31C 2.6 0,26 Pekerjaan ini
A
setelah 40 jam inkubasi.
B
setelah 21 jam inkubasi.
C
setelah 12 jam inkubasi.
D
dihitung berdasarkan biomassa awal yang digunakan untuk fermentasi.

cdw/h dalam CGXII-AXG1 pada 12 jam fermentasi. Demikian pula produksi
xylitol pada medium SAPL1 adalah 5,6±0,2 g/L dengan produktivitas 0,23±
0,03 g/g cdw/jam dalam kondisi fermentasi yang sama (Gambar 3B)
3.4. Fermentasi fed batch menggunakan strain rekombinan Cg-ax3
Fermentasi batch dilakukan dalam CGXII-AXG2 (medium minimal
dengan 10 g/L glukosa, 10 g/L xilosa, dan 10 g/L arabinosa) dan SAPL2
(medium berdasarkan cairan asam yang telah diolah sebelumnya dari
tanaman sorgum dengan konsentrasi gula media 10 g/L glukosa, 10 g/L
xilosa dan 10 g/L arabinosa) menggunakan strain rekombinan Cg-ax3.
Berdasarkan studi fermentasi batch, konsentrasi inokulum 10 g cdw/L
digunakan untuk mengurangi fase lag. Secara berkala 4 jam, campuran
gula atau konsentrat gula APL diberikan. Produksi xylitol di CGXII-AXG2
mencapai 31,0±0,5 gram/L (Gambar 3C) dan produktivitas spesifik 0,26±
0,05 g/g cdw/jam pada 12 jam fermentasi fed batch. Demikian pula,
fermentasi fed batch berdasarkan media SAPL2 menghasilkan titer
xylitol sebesar 27,0±0,3 gram/L (Gambar 3D) dan produktivitas spesifik
0,22±0,1 g/g cdw/jam.
4. Diskusi
Pemanfaatan campuran gula yang efisien misalnya dari hidrolisat
lignoselulosa merupakan komponen penting dalam konsep biorefinery. Di
sini, kami menjelaskan bagaimana xilosa dan arabinosa yang ada dalam
hidrolisat kaya pentosa dapat diubah menjadi xylitol dalam satu bioproses
menggunakan metode rekayasa genetika.C.glutamikum.Sejauh
pengetahuan kami, ini adalah laporan pertama yang menunjukkan
biokonversi gula pentosa lignoselulosa yang efisien (baik xilosa maupun
arabinosa) dari medium mineral berbasis minuman keras yang telah diolah
dengan asam biomassa sorgum (medium SAPL) menjadi xylitol.
Dalam penelitian ini,R.mucilaginosa NBT11merupakan sumber gen xilosa
reduktase untuk produksi xylitol diC.glutamikum. Rhodotoruladiisolasi dari
APL sebagai kontaminan. Kemampuan alaminya untuk menghasilkan xylitol
dari APL yang mengandung xilosa dengan efisiensi 50% kemudian diketahui
(data tidak ditampilkan). Urutan asam amino menunjukkan 97% kemiripan
dengan urutan xilosa reduktase yang dilaporkanR.mucilaginosapada analisis
BLASTP. Sebagian besar xilosa reduktase dari ragi juga bekerja pada
arabinosa untuk menghasilkan arabitol. Strain rekombinan dengan
reduktase xilosa ini cenderung menghasilkan arabitol bersama dengan
xylitol ketika hidrolisat hemi selulosa digunakan sebagai substrat. Hal ini
menimbulkan masalah pada produksi xylitol karena arabitol tidak dapat
dipisahkan dengan mudah
xylitol selama pemrosesan hilir (Yoon dkk., 2011). Khususnya, xilosa
reduktase dariR.mucilaginosa NBT11yang digunakan di sini tidak
menunjukkan sintesis arabitol yang terdeteksi dari arabinosa (data tidak
ditampilkan). Dengan demikian, proses yang dikembangkan di sini
memastikan produksi xylitol bebas arabitol di media CGXII-AXG dan SAPL.
Ekspresi gen transporter arabinosa/pentosa yang heterogen di
C.glutamikumuntuk meningkatkan serapan arabinosa dan xilosa telah
dipelajari sebelumnya (Sasaki dkk., 2010). AraT dan AraE adalah sistem
simbol proton dengan afinitas rendah yang digerakkan oleh gaya gerak
proton yang biasanya tidak efisien untuk mengangkut gula pada konsentrasi
rendah pada pH basa (pada H rendah+konsentrasi) (Lam dkk., 1980).
KeteganganCg-xr2memproduksi AraT secara berlebihan dariB. licheniformis
tidak menunjukkan peningkatan produksi xylitol dibandingkan denganCg-
xr1.AraT memiliki 74% kemiripan asam amino dengan AraEC.glutamikum
ATCC 31831 kecuali di wilayah N-terminalnya. Jadi, kemungkinan besar
peptida sinyalnya tidak berfungsiC.glutamikum.Memang, fusi peptida sinyal
AraE dari yang terkaitC.glutamikumstrain ATCC 31831 hingga AraT
meningkatkan produksi xylitol peningkatan 5,3 kali lipat. Produktivitas
spesifik dariCg-xr1DanCg-xr3 (Tabel 4) lebih tinggi dari strain yang
dilaporkan sebelumnya untuk produksi xylitol (Tabel 5) meskipun
produktivitas volumetrik dan hasil akhir relatif rendah (Sasaki dkk., 2010).
KeteganganCg-xr3merupakan strain unggul untuk produktivitas xylitol
dibandingkan strain modifikasi yang dilaporkan sepertiLactococus laktis (
0,05 g/g cdw/jam) danSaccharomyces cervisiae (0,19 g/g cdw/jam) (Kim dkk.,
2010).
Meskipun xilosa merupakan gula utama yang terdapat dalam APL,
jumlah arabinosa yang terdapat dalam APL tidak dapat diabaikan untuk
berbagai biomassa lignoselulosa. Arabinosa ini harus dimanfaatkan baik
sebagai sumber karbon untuk bahan bakar pertumbuhan sel atau dapat
digunakan sebagai substrat untuk sintesis xylitol agar proses tersebut lebih
ekonomis. Sintesis xylitol dari arabinosa pertama kali dijelaskan melalui jalur
sintetik pada tahun 1977E.colikekurangan operon arabinosa (Sakakibara
dkk., 2009). Jalur ini lebih cocok untukC.glutamikumdibandingkan dengan
E.coli sedangkan tipe liarC.glutamikumtidak memiliki katabolisme arabinosa
alami dan persaingan gula alosterik. Strain rekombinanCg-ax3 menunjukkan
peningkatan 3 kali lipat produksi xylitol dari arabinosa bila dibandingkan
dengan strain lain (Cg-ab1DanCg-ax1) (Tabel 4). Efisiensi konversi lebih
rendah (73%) dibandingkan rekayasaE.coli (92%) (Sakakibara dkk., 2009).
Kehadiran xylulokinase XylB fungsional diC.glutamikummungkin menjadi
alasan penurunan efisiensi konversi arabinosa menjadi xylitol. XylB dapat
mengkatalisis fosforilasi L-xilulosa, suatu perantara jalur konversi arabinosa
menjadi xylitol. Xilulosa 5 fosfat terbentuk
70 KS Dhar dkk. / Jurnal Bioteknologi 230 (2016) 63–71
mungkin dimanfaatkan oleh bakteri melalui jalur pentosa fosfat.
Konversi bio bebas limbah dari berbagai gula (xilosa dan arabinosa) yang
ada dalam APL menjadi xylitol dapat meningkatkan keekonomian proses
secara signifikan. Yang dimodifikasi secara genetikC. glutamicum (Cg-ax3)
dengan metabolisme xilosa dan arabinosa untuk sintesis xylitol telah
berhasil divalidasi dalam media fermentasi yang mengandung gula tersebut.
Efisiensi produksi xylitolCg-ax3 sehubungan dengan konsentrasi gula yang
digunakan, masing-masing adalah 97% dan 73% untuk xilosa dan arabinosa
(Gambar 2). Menariknya, sejumlah kecil (2,2 g/L) xylitol diproduksi olehCg-
ax3pada 48 jam menggunakan glukosa sebagai satu-satunya sumber karbon
(20 g/L) denganCg-ax3.Hal ini mungkin disebabkan oleh zat antara xilulosa
yang terbentuk karena aksi xylB selama metabolisme glukosa yang didorong
menuju sintesis xylitol oleh xilulosa reduktase yang ada dalam strain. Hasil
molar xylitol adalah 1 mol per 10,8 mol glukosa yang digunakan. Selain itu,
strain rekombinanCg-ax3tidak terdeteksi untuk pemanfaatan xylitol dalam
medium CGXII yang ditambah dengan xylitol (2%) sebagai satu-satunya
sumber karbon (data tidak ditampilkan). Meskipun sedikit sistem serapan
gula alkohol untuk inositol (IolT1 dan IolT2) (Krings dkk., 2006), arabitol
(RbtT) dan manitol (Laslo dkk., 2012; Peng dkk., 2011) telah dikarakterisasi
sebelumnya., tidak ada laporan yang tersedia tentang serapan xylitol khusus
atau sistem transportasi di dalamnyaC.glutamikum.
Media CGXII-AXG mengandung kombinasi gula yang mirip dengan
yang ada di SAPL untuk mengesampingkan kontribusi pembentukan
xylitol dari komponen SAPL lainnya. Produktivitas xylitol dariCg-ax3
strain dalam fermentasi batch dengan media SAPL1 (0,23±0,03 g/gdcw/
h) dan medium CGXII-AXG1 (0,28±0,03 g/gdcw/jam) sebanding. Media
berbasis hidrolisat yang mengandung berbagai gula dan inhibitor juga
cocok untuk fermentasi fed batchCg-ax3 (Gambar 3d) media.
Produktivitas diperoleh maksimum pada 6 jam fermentasi fed batch,
baik pada media CGXII-AXG2 maupun SAPL2. Ada juga kesamaan dalam
produktivitas yang diamati pada CGXII-AXG1 (Gambar 3a) dan SAPL1 (
Gambar 3b) medium pada 6 jam dalam fermentasi batch. Ini adalah
produktivitas spesifik tertinggi yang dilaporkan bagi produsen xylitol (
Tabel 5). Secara teoritis, satu molekul glukosa dapat menghasilkan dua
molekul NADPH melalui jalur pentosa fosfat. Molekul tunggal NADPH
dan xilosa atau arabinosa bersama-sama dapat menghasilkan satu
molekul xylitol (yaitu,) hasil teoritis maksimum xylitol sehubungan
dengan NADPH yang dihasilkan oleh satu molekul glukosa adalah dua.
Dari hasil fermentasi fed batch yang diperoleh rata-rata hasil molar
xylitol adalah sekitar 1,6 mol per mol glukosa yang digunakan saat
pertumbuhan sel berada pada fase diam. Hasil ini menunjukkan bahwa
strain yang dikembangkan hanya memerlukan sekitar 3/4 konsentrasi
glukosa yang dibutuhkan dibandingkan dengan konsentrasi xilosa atau
arabinosa untuk sintesis xylitol. Produktivitas xylitol dari strainCg-ax3
dalam medium yang mengandung xilosa dan arabinosa tidak
bergantung pada proporsi gula pentosa. Hal ini menunjukkan
penerapan langsungnya untuk transformasi APL mentah menjadi
xylitol tanpa menyesuaikan konsentrasi gula pada kondisi fed batch.
Kemajuan terkini dalam strategi proses terdiri dari persiapan substrat,
rekayasa proses, dan rekayasa metabolik meningkatkan jangkauan
produksi xylitol. Produktivitas volumetrik xylitol dapat ditingkatkan
lebih lanjut dengan meningkatkan beban inokulum seperti yang telah
ditunjukkan pada produksi xylitol oleh spesies ragi termasukCandida
tropisis (3,86 g/L/jam) (Choi dkk., 2000),Debaryomyces hanseniiDBX 12
(2,24 g/L/jam) (Sobat dkk., 2013),S. cerevisiaeD-10-BT (1,5 g/L/jam) (Oh
dkk., 2013) DanKluyveromyces marxianusYZJ015 (4,43 g/L/jam) (Zhang
dkk., 2014). Efisiensi konversi xylitol dariK.marxianusYZJ015 dibatasi
hingga 89%. Sejauh menyangkut produktivitas spesifik, dimodifikasi
E.coli (0,29 g/g cdw/jam) (Cirino dkk., 2006) dan ragiSaccharomyces
cerevisiae (0,34 g/g cdw/jam) (Oh dkk., 2007) menunjukkan nilai terbaik
yang dilaporkan. Namun eksploitasiS. cerevisiae untuk transformasi
langsung APL tidak efektif karena adanya inhibitor dalam hidrolisat (
Iwaki dkk., 2013). Demikian pula, penerapan-
tion dimodifikasi secara genetikL.laktis (Nyyssola dkk., 2005) DanE.coli (
Khankal dkk., 2008) juga dibatasi pada substrat murni (xilosa dan glukosa).
Selain itu, tidak ada data yang tersedia mengenai pembentukan xylitol ketika
gula campuran (hidrolisat) digunakan sebagai substrat. Dibandingkan
dengan laporan sebelumnya,C.glutamikumtekananCgax3menunjukkan
produktivitas spesifik yang unggul dengan efisiensi konversi xylitol
berdasarkan konsentrasi gula pentosa yang digunakan. Inaktivasi impor
xylitol, penjelasan dan peningkatan sistem sekretaris xylitol yang tidak
diketahui dan sistem transporter pentosa adalah kemungkinan masa depan
untuk perbaikan strain lebih lanjut.
5. Kesimpulan
RekombinanC.glutamikumstrain yang dibangun dalam penelitian ini
memungkinkan produksi xylitol dari xilosa, arabinosa dan campuran pentosa ini
tanpa pembentukan arabitol secara bersamaan sebagai produk sampingan. Selain
itu, produksi xylitol bebas arabitol dicapai dengan menggunakan asam hidrolisat
hemiselulosa kaya pentosa, minuman keras sorgum brangkasan yang telah diolah
sebelumnya dengan fermentasi langsung.
Ucapan Terima Kasih
KSD berterima kasih kepada Council of Scientific and Industrial
Research (CSIR), NewDelhi atas Senior Research Fellowship (SRF) dan
VFW serta KMN mengapresiasi dukungan program pertukaran bilateral
Indo-Jerman (DST-DAAD) untuk dikerjakanC.glutamikum.
Referensi
Abe, S., Takayama, KI, Kinoshita, S., 1967.Studi taksonomi tentang glutamat
bakteri penghasil asam. J.Jenderal Aplikasi. Mikrobiol. 13 (3), 279–301.
Akinterinwa, O., Khankal, R., Cirino, PC, 2008.Rekayasa metabolisme untuk
bioproduksi gula alkohol. Saat ini. Pendapat. Bioteknologi. 19 (5), 461–467. Bayan,
N., Houssin, C., Chami, M., Leblon, G., 2003.Mikomembran dan lapisan S:
dua struktur penting dariCorynebacterium glutamicumselubung sel dengan
aplikasi bioteknologi yang menjanjikan. J. Bioteknologi. 104 (1), 55–67.
Becker, J., Wittmann, C., 2012.Sistem dan rekayasa metabolisme sintetik untuk
produksi asam amino—detak jantung perkembangan strain industri. Saat ini.
Pendapat. Bioteknologi. 23 (5), 718–726.
Bradford, MM, 1976.Sebuah metode yang cepat dan sensitif untuk kuantisasi
sejumlah mikrogram protein memanfaatkan prinsip pengikatan protein-pewarna.
Dubur. Biokimia. 72 (1–2), 248–254.
Buschke, N., Schröder, H., Wittmann, C., 2011.Rekayasa metabolisme
Corynebacterium glutamicumuntuk produksi 1,5-diaminopentana dari
hemiselulosa. Bioteknologi. J.6 (3), 306–317.
Canilha, L., Rodrigues, R., Antunes, F.a. F., Chandel, AK, Milessi, T., Felipe, MDGA,
Silva, S., 2013.Biokonversi hemiselulosa dari biomassa tebu menjadi produk
berkelanjutan. Degradasi Berkelanjutan. Teknologi Biomassa Lignoselulosa.
Aplikasi. Komersialisasi, 15–45.
Choi, J.-H., Moon, K.-H., Ryu, Y.-W., Seo, J.-H., 2000.Produksi xylitol dalam sel
mendaur ulang fermentasiCandida tropisis.Bioteknologi. Biarkan. 22 (20), 1625–
1628.
Cirino, PC, Chin, JW, Ingram, LO, 2006.RekayasaEscherichia coliuntuk xylitol
produksi campuran glukosa-xilosa. Bioteknologi. Bioeng. 95 (6), 1167–
1176.
Cleto, S., Jensen, JK, Wendisch, VF, Lu, TK, 2016.Corynebacterium glutamicum
rekayasa metabolik dengan gangguan CRISPR (CRISPRi). Sintesis ACS. biologi. 5 (5),
375–385.
Fridkin, SK, Jarvis, WR, 1996.Epidemiologi infeksi jamur nosokomial. Klinik.
Mikrobiol. Wahyu 9 (4), 499–511.
Gopinath, V., Meiswinkel, TM, Wendisch, VF, Nampoothiri, KM, 2011.amino
produksi asam dari hidrolisat jerami padi dan dedak gandum dengan pemanfaatan pentosa
rekombinanCorynebacterium glutamicum.Aplikasi. Mikrobiol. Bioteknologi. 92 (5), 985–996.
Granstrom, TB, Izumori, K., Leisola, M., 2007.Xylitol gula yang langka. Bagian II:
produksi bioteknologi dan aplikasi xylitol di masa depan. Aplikasi. Mikrobiol.
Bioteknologi. 74 (2), 273–276.
Hadiati, A., Krahn, I., Lindner, SN, Wendisch, VF, 2014.Rekayasa
Corynebacterium glutamicumuntuk pertumbuhan dan produksiaku-ornitin,
aku-lisin, dan likopen dari asam heksuronat. sumber daya hayati. Bioproses. 1 (1), 1–
10. Hanahan, D., 1983.Studi tentang transformasiEscherichia colidengan plasmid. J.
mol. biologi. 166 (4), 557–580.
Heider, SA, Wendisch, VF, 2015.Rekayasa pabrik sel mikroba: metabolisme
rekayasaCorynebacterium glutamicumdengan fokus pada produk non-alami.
Bioteknologi. J.10 (8), 1170–1184.
 KS Dhar dkk. / Jurnal Bioteknologi 230 (2016) 63–71
Hibi, M., Yukitomo, H., Ito, M., Mori, H., 2007.Peningkatan ketergantungan NADPH
biokonversi dengan pemuliaan molekuler berbasis transkriptome. Aplikasi.
Mengepung. Mikrobiol. 73 (23), 7657–7663.
Iwaki, A., Kawai, T., Yamamoto, Y., Izawa, S., 2013.Penghambat konversi biomassa
furfural dan 5-hydroxymethylfurfural menginduksi pembentukan butiran RNP messenger
dan melemahkan aktivitas translasi dalamSaccharomyces cerevisiae.Aplikasi. Mengepung.
Mikrobiol. 79 (5), 1661–1667.
Izumori, K., Tuzaki, K., 1988.Produksi xylitol dariD-xilulosa oleh
Mycobacterium smegmatis.J.Fermentasi. Teknologi. 66 (1), 33–36. Kalinowski, J.,
Bathe, B., Bartels, D., Bischoff, N., Bott, M., Burkovski, A., Dusch, N.,
Eggeling, L., Eikmanns, BJ, Gaigalat, L., 2003.LengkapCorynebacterium glutamicum
Urutan genom ATCC 13032 dan dampaknya terhadap produksi aku-asam amino dan
vitamin yang berasal dari aspartat. J. Bioteknologi. 104 (1), 5–25. Kawaguchi, H.,
Vertès, AA, Okino, S., Inui, M., Yukawa, H., 2006.Rekayasa a
jalur metabolisme xilosa diCorynebacterium glutamicum.Aplikasi. Mengepung.
Mikrobiol. 72 (5), 3418–3428.
Kawaguchi, H., Sasaki, M., Vertès, AA, Inui, M., Yukawa, H., 2008.Rekayasa sebuah
aku-jalur metabolisme arabinosa diCorynebacterium glutamicum.Aplikasi.
Mikrobiol. Bioteknologi. 77 (5), 1053–1062.
Keilhauer, C., Eggeling, L., Sahm, H., 1993.Sintesis isoleusin diCorynebacterium
glutamat:analisis molekuler dari operon ilvB-ilvN-ilvC. J. Bakteriol. 175 (17), 5595–
5603.
Khankal, R., Chin, JW, Cirino, PC, 2008.Peran transporter xilosa dalam xylitol
produksi dari rekayasaEscherichia coli.J. Bioteknologi. 134 (3), 246–252. Kim, S.-H.,
Yun, J.-Y., Kim, S.-G., Seo, J.-H., Park, J.-B., 2010.Produksi xylitol
dariD-xilosa dan glukosa dengan rekombinanCorynebacterium glutamicum.
Mikroba Enzim. Teknologi. 46 (5), 366–371.
Krings, E., Krumbach, K., Bathe, B., Kelle, R., Wendisch, VF, Sahm, H., Eggeling, L.,
2006.Karakterisasi pemanfaatan myo-inositol oleh Corynebacterium
glutamicum: stimulon, identifikasi transporter, dan pengaruhnya terhadap aku-
pembentukan lisin. J. Bakteriol. 188 (23), 8054–8061.
Lam, V., Daruwalla, K., Henderson, P., Jones-Mortimer, M., 1980.Terkait dengan proton
D-transportasi xilosa masukEscherichia coli.J. Bakteriol. 143 (1), 396–402.
Laslo, T., Von Zaluskowski, P., Gabris, C., Lodd, E., Rückert, C., Dangel, P., Kalinowski,
J., Auchter, M., Seibold, G., Eikmanns, BJ, 2012.Metabolisme arabitol dari
Corynebacterium glutamicumdan regulasinya oleh AtlR. J. Bakteriol. 194 (5), 941–
955.
Li, Z., Guo, X., Feng, X., Li, C., 2015.Proses yang ramah lingkungan dan efisien
untuk biokonversi xylitol dari hidrolisat tongkol jagung enzimatik dengan diadaptasi
Candida tropisis.kimia. bahasa Inggris J.263, 249–256.
Meiswinkel, TM, Gopinath, V., Lindner, SN, Nampoothiri, KM, Wendisch, VF,
2013.Pemanfaatan pentosa yang dipercepat olehCorynebacterium glutamicum
untuk mempercepat produksi lisin, glutamat, ornitin, dan putresin.
Bioteknologi Mikroba. 6 (2), 131–140.
Mohammad, N., Mustapa Kamal, S., Mokhtar, M., 2015.Xylitol biologis
produksi: tinjauan studi terbaru. Makanan Rev.Int. 31 (1), 74–89. Niimi, S.,
Suzuki, N., Inui, M., Yukawa, H., 2011.Rekayasa metabolisme
jalur 1,2-propanediol masukCorynebacterium glutamicum.Aplikasi. Mikrobiol.
Bioteknologi. 90 (5), 1721–1729.
Nyyssola, A., Pihlajaniemi, A., Palva, A., Von Weymarn, N., Leisola, M., 2005.
Produksi xylitol dariD-xilosa secara rekombinanLaktokokus laktis.J.
Bioteknologi. 118 (1), 55–66.
Oh, Y.-J., Lee, T.-H., Lee, S.-H., Oh, E.-J., Ryu, Y.-W., Kim, M.-D., Seo, J.-H., 2007.Ganda
modulasi metabolisme glukosa 6-fosfat untuk meningkatkan produksi xylitol
yang bergantung pada NADPH dalam rekombinanSaccharomyces cerevisiae.
J.Mol. Katal. B: Enzim. 47 (1), 37–42.
Oh, EJ, Ha, S.-J., Kim, SR, Lee, W.-H., Galazka, JM, Cate, JH, Jin, Y.-S., 2013.
Peningkatan produksi xylitol melalui pemanfaatan bersama selobiosa dan xilosa
secara simultan melalui rekayasaSaccharomyces cerevisiae.Metab. bahasa Inggris
15, 226–234. Okino, S., Noburyu, R., Suda, M., Jojima, T., Inui, M., Yukawa, H., 2008.Efisien
proses produksi asam suksinat secara metabolik strain Corynebacterium
glutamicum.Aplikasi. Mikrobiol. Bioteknologi. 81 (3), 459–464.
Pal, S., Choudhary, V., Kumar, A., Biswas, D., Mondal, AK, Sahoo, DK, 2013.Studi
pada produksi xylitol melalui jalur metabolisme yang direkayasaDebaryomyces hansenii.
sumber daya hayati. Teknologi. 147, 449–455.
71
Peng, X., Okai, N., Vertès, AA, Inatomi, KI, Inui, M., Yukawa, H., 2011.
Karakterisasi operon katabolik manitolCorynebacterium glutamicum.Aplikasi.
Mikrobiol. Bioteknologi. 91 (5), 1375–1387. Peters-Wendisch, PG, Schiel, B.,
Wendisch, VF, Katsoulidis, E., Mockel, B., Sahm,
H., Eikmanns, BJ, 2001.Karboksilase piruvat merupakan penghambat utama
produksi glutamat dan lisinCorynebacterium glutamicum.J.Mol. Mikrobiol.
Bioteknologi. 3 (2), 295–300.
Pienkos, PT, Zhang, M., 2009.Peran proses pretreatment dan conditioning pada
toksisitas hidrolisat biomassa lignoselulosa. Selulosa 16 (4), 743–762.
Povelainen, M., Miasnikov, AN, 2007.Produksi xylitol secara metabolik
strain rekayasaBacillus subtilis.J. Bioteknologi. 128 (1), 24–31. Ravella, SR, Gallagher,
J., Ikan, S., Prakasham, RS, 2012.Ikhtisar komersial
produksi xylitol, analisis ekonomi dan tren pasar. Di dalam:D-silitol. Springer,
hal.291–306.
Sakai, S., Tsuchida, Y., Okino, S., Ichihashi, O., Kawaguchi, H., Watanabe, T., Inui, M.,
Yukawa, H., 2007.Pengaruh inhibitor turunan lignoselulosa terhadap pertumbuhan dan
produksi etanol dengan terhentinya pertumbuhanCorynebacterium glutamicumR. Aplikasi.
Mengepung. Mikrobiol. 73 (7), 2349–2353.
Sakakibara, Y., Saha, BC, Taylor, P., 2009.Produksi mikroba xylitol dari
aku-arabinosa dengan rekayasa metabolikEscherichia coli.J. Biosci. Bioeng. 107 (5),
506–511.
Sambrook, J., Russell, D., 2001.Kloning Molekuler: Manual Laboratorium. 2001. Dingin
Pers Laboratorium Spring Harbor, Cold Spring Harbor, New York. Sasaki, M.,
Jojima, T., Kawaguchi, H., Inui, M., Yukawa, H., 2009.Rekayasa
transportasi pentosa masukCorynebacterium glutamicumuntuk meningkatkan pemanfaatan
gula campuran secara simultan. Aplikasi. Mikrobiol. Bioteknologi. 85 (1), 105–115. Sasaki, M.,
Jojima, T., Inui, M., Yukawa, H., 2010.Produksi xylitol secara rekombinan
Corynebacterium glutamicumdalam kondisi kekurangan oksigen. Aplikasi. Mikrobiol.
Bioteknologi. 86 (4), 1057–1066.
Smith, KM, Cho, K.-M., Liao, JC, 2010.RekayasaCorynebacterium glutamicum
untuk produksi isobutanol. Aplikasi. Mikrobiol. Bioteknologi. 87 (3), 1045–1055.
Stansen, C., Uy, D., Delaunay, S., Eggeling, L., Goergen, J.-L., Wendisch, VF, 2005.
Karakterisasi aCorynebacterium glutamicumoperon pemanfaatan laktat diinduksi
selama produksi glutamat yang dipicu oleh suhu. Aplikasi. Mengepung. Mikrobiol.
71 (10), 5920–5928.
Su, B., Wu, M., Lin, J., Yang, L., 2013.Strategi rekayasa metabolik untuk ditingkatkan
produksi xylitol dari gula hemiselulosa. Bioteknologi. Biarkan. 35 (11), 1781–
1789.
Van Der Istirahat, M., Lange, C., Molenaar, D., 1999.Kejutan panas menyusul
elektroporasi menginduksi transformasi yang sangat efisienCorynebacterium
glutamicumdengan DNA plasmid xenogenik. Aplikasi. Mikrobiol. Bioteknologi. 52 (4),
541–545.
Werpy, T., Petersen, G., Aden, A., Bozell, J., Holladay, J., White, J., Manheim, A., Eliot,
D., Lasure, L., Jones, S. (2004) Bahan kimia bernilai tambah tertinggi dari biomassa.
Jilid 1-Hasil penapisan calon potensial dari gula dan gas sintesis. Dokumen DTIC.
Wieschalka, S., Blombach, B., Bott, M., Eikmanns, BJ, 2013.Produksi berbasis bio
asam organik denganCorynebacterium glutamicum.Mikroba. Bioteknologi. 6 (2),
87–102.
Xu, P., Bura, R., Doty, SL, 2011.Analisis genetik dariD-metabolisme xilosa oleh
strain ragi endofit dariRhodotorula graminisDanRhodotorula mucilaginosa. Genet.
mol. biologi. 34 (3), 471–478.
Yoon, BH, Jeon, WY, Shim, WY, Kim, JH, 2011.aku-Jalur Arabinosa
rekayasa produksi xylitol bebas arabitol diCandida tropisis. Bioteknologi.
Biarkan. 33 (4), 747–753.
Yoshitake, J., Shimamura, M., Imai, T., 1973.Produksi xylitol oleh a
Corynebacteriumjenis. Pertanian. biologi. kimia. 37 (10), 2251–2259.
Zahoor, A., Lindner, SN, Wendisch, VF, 2012.Rekayasa metabolisme
Corynebacterium glutamicumditujukan pada sumber karbon alternatif dan
produk baru. Hitung. Struktur. Bioteknologi. J.3 (4), 1–11.
Zhang, J., Zhang, B., Wang, D., Gao, X., Hong, J., 2014.Produksi xylitol tinggi
suhu dengan direkayasaKluyveromyces marxianus.sumber daya hayati. Teknologi. 152, 192–
201.