Diterjemahkan dari bahasa Inggris ke bahasa Indonesia - www.onlinedoctranslator.

com

SEBUAHRTIKEL

Rekayasa Jalur Biosintetik Baru di

Escherichia coliuntuk Produksi Etilen Glikol
Terbarukan
Brian Pereira,1Haoran Zhang,1Marjan De Mey,1,2Chin Giaw Lim,1
Zheng-Jun Li,1,3Gregorius Stephanopoulos1
1Departemen Teknik Kimia, Institut Teknologi Massachusetts, Cambridge,
Massachusetts 02139; telepon:th1-617-253-4583; fax:th1-617-253-3122; email:
gregstep@mit.edu
2Pusat Bioteknologi dan Biokatalisis Industri, Departemen Teknologi Biokimia

dan Mikroba, Universitas Ghent, Ghent, Belgia

3Laboratorium Bioproses Utama Beijing, Sekolah Tinggi Ilmu dan Teknologi Hayati,
Universitas Teknologi Kimia Beijing, Beijing, PR China

dan aplikasi kecil lainnya memunculkan pasar global untuk EG sekitar 15

ABSTRAK:Etilen glikol (EG) adalah bahan kimia komoditas penting
dengan aplikasi industri yang luas. Saat ini diproduksi dari bahan
baku minyak bumi atau gas alam dalam proses yang
membutuhkan konsumsi sumber daya tak terbarukan dalam
jumlah yang signifikan. Di sini, kami melaporkan jalur baru untuk
biosintesis EG dari glukosa gula terbarukan dalam rekayasa
metabolik Escherichia coli.Konversi serin-ke-EG pertama kali
dicapai melalui jalur yang terdiri dari serin dekarboksilase,
etanolamin oksidase, dan glikolaldehida reduktase. Penyediaan
serin diE. colikemudian ditingkatkan dengan ekspresi berlebih
dari jalur biosintesis serin. Integrasi kedua bagian ini ke dalam
jalur biosintesis EG lengkap diE. colimemungkinkan untuk
produksi 4,1 g/L EG pada hasil kumulatif 0,14 g-EG/g-glukosa,
membangun fondasi untuk bioteknologi yang menjanjikan.
Bioteknologi. Bioeng. 2016;113: 376–383.
- 2015 Wiley Periodicals, Inc.
KATA KUNCI:etilen glikol; serin; terbarukan; rekayasa
metabolisme
juta ton senilai lebih dari $20 miliar per tahun. Produksi industri EG saat
ini sangat bergantung pada konversi sumber daya bahan bakar fosil,
yang tidak terbarukan dan tidak berkelanjutan; produksi EG terbarukan
demikian kepentingan ilmiah dan komersial yang besar. Sejalan dengan
itu, bahan yang berasal dari tumbuhan, termasuk gula, pati, dan
lignoselulosa, merupakan sumber daya terbarukan, berbasis bio, dan
produksi EG langsung dari bahan baku tersebut melalui katalisis kimia
telah dilaporkan (Ji et al., 2009; Pang et al., 2011; Sun dan Liu, 2011).
Selain itu, etanol, yang dihasilkan dari gula, dapat didehidrasi secara
kimia menjadi dari etilena berbasis bio, zat antara dalam sintesis
tradisional EG. Sementara teknologi ini dapat mencapai produksi EG
terbarukan, mereka mengandalkan proses kimia yang membutuhkan
modal dan biaya operasi yang relatif tinggi. Oleh karena itu, lanskap saat
ini merupakan kebutuhan mendesak serta peluang besar untuk
mengembangkan bioproses yang kuat untuk mencapai produksi EG
tingkat tinggi dari bahan baku biobased terbarukan.

Produksi biologis EG dari xilosa baru-baru ini ditunjukkan (Liu et

pengantar
Ethylene glycol (EG), juga dikenal sebagai ethane-1,2-diol, adalah
komoditas kimia penting dengan aplikasi utama sebagai agen anti-
beku dan sebagai molekul blok bangunan untuk berbagai poliester,
termasuk polietilen tereftalat (PET) di mana-mana. . Ini
al., 2013). Dalam studi tersebut, strainE. colidirekayasa untuk
mengubah dan membelah pentosa xilosa menjadi zat antara 2-
karbon dan 3-karbon; yang pertama diubah menjadi EG sedangkan
yang terakhir masuk ke metabolisme pusat. Meskipun hasilnya
signifikan untuk dua perlima karbon xilosa, tidak ada jalur
metabolisme untuk mengubah tiga perlima sisanya menjadi EG. Di
sini, kami merancang dan menerapkan jalur untuk biosintesis EG
yang berasal dari perantara metabolisme pusat 3-karbon; dengan

Alamat sekarang Chin Giaw Lim adalah Manus Biosintesis, Cambridge, MA 02138. Konflik
demikian, jalur ini dapat melengkapi jalur EG berbasis xilosa, tetapi
kepentingan: Para penulis menyatakan bahwa mereka tidak memiliki konflik kepentingan. juga memungkinkan penggunaan substrat lain, terutama glukosa.
Korespondensi dengan: G. Stephanopoulos
Sponsor hibah kontrak: Departemen Energi
Pada tahun 2001, Rontein dkk. menemukan bahwa tanaman mengandung
Nomor hibah kontrak: DE-SC0008744
Diterima 22 Juni 2015; Revisi diterima 14 Juli 2015; Diterima 20 Juli 2015 Naskah serin dekarboksilase (SDC), enzim yang mengubah serin menjadi etanolamin
diterima secara online 29 Juli 2015; (Rontein et al., 2001). SDC dariArabidopsis thaliana dan varian terpotongnya
Artikel pertama kali diterbitkan online 18 September 2015 di Perpustakaan Online
masing-masing diekspresikan secara berlebihan dalamE.coli, dan strain
Wiley (http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/bit.25717/abstract).
DOI 10.1002/bit.25717 menunjukkan aktivitas serin dekarboksilase (Rontein

376Bioteknologi dan Bioteknologi, Vol. 113, No. 2, Februari 2016 - 2015 Wiley Periodicals, Inc.
dkk., 2001,2003). Temuan ini kemudian diterapkan pada rekayasa
metabolisme mikroba untuk produksi etanolamin dari glukosa
(aplikasi paten PCT/EP2007/055762; Foti et al., 2013). Etanolamina
adalah amina primer berukuran kecil yang dapat dioksidasi menjadi
glikolaldehida oleh aktivitas etanolamina oksidase, yang telah
terdeteksi pada beberapa organisme (Foster et al., 2012; Kulkarni
dan Hodgson, 1973; Narrod dan Jakoby, 1964; Ota et al., 2008 ).
Selanjutnya, seperti yang ditunjukkan sebelumnya, glikolaldehida
dapat dengan mudah diubah menjadi EG (Liu et al., 2013). Dalam
kombinasi, pengamatan ini dapat diintegrasikan ke dalam jalur
metabolisme untuk produksi EG dari glukosa melalui serin dan
etanolamin (Gbr. 1). Jalur dari serin telah diusulkan sebelumnya
(Permohonan Paten AS no. 13/086.295) tetapi belum
didemonstrasikan secara eksperimental.
Dalam penelitian ini, kami memperkenalkan rute biosintesis baru
untuk produksi EG dari glukosa menjadi rekayasaE.coli.Secara khusus,
kami secara fungsional mengekspresikan dua enzim heterolog untuk
mengubah serin asam amino menjadi EG melalui etanolamin dan
glikolaldehida. Biosintesis serin diE. colijuga ditingkatkan untuk
meningkatkan fluks metabolisme yang mengarah dari metabolisme
pusat ke pembentukan EG. Kami menunjukkan bahwa, melalui
pendekatan rekayasa metabolisme, kami dapat dengan mulus merakit
yang berbedaE. colienzim endogen dan heterolog menjadi jalur
biosintesis lengkap dan mencapai produksi mikroba 4,1 g/L EG dari 30 g/
L glukosa. Studi ini membuka jalan bagi produksi mikroba EG tingkat
tinggi dari sumber daya terbarukan di masa depan.
Gambar 1.Jaringan metabolisme untuk produksi EG dari glukosa. Tiga set reaksi
dikelilingi oleh garis putus-putus: set 1 mencakup glikolisis; set 2 adalah biosintesis
serin; dan set 3 untuk produksi EG dari serin. Enzim yang terkait dengan reaksi
ditampilkan. Reaksi samping dan produk sampingan yang relevan juga ditampilkan;
reaksi diblokir oleh penghapusan gen ditandai dengan ''X.''
Bahan dan metode
Plasmid dan Strain
Gen serin dekarboksilasedi.sdcdariArabidopsis thaliana (Rontein et al.,
2001), gen serin dekarboksilaseVc.sdcdariVolvox carteri f. nagariensis (
Prochniket al., 2010), gen amina oksidaseaao dariArthrobactersp. FERM
P-06240 (Ota et al., 2008), dan gen amina oksidaseao1dariRhodococcus
opus (Foster et al., 2012) adalah kodon yang dioptimalkan dan kemudian
disintesis secara khusus dalam plasmid pUC57 oleh Genewiz (South
Plainfield, NJ); gen yang disintesis dirancang dengan situs restriksi
mengapit. Gen serin dekarboksilase dari
A. thalianadanV. carterimasing-masing dicerna oleh restriksi
endonuklease NcoI dan SalI dan diikat ke pET-28a (th)plasmid (Novagen,
Billerica, MA) diperlakukan dengan endonuklease yang sama,
menghasilkan pET28_T7-di.sdcdan pET28_T7-Vc.sdc,masing-masing. Gen
kemudian dipindahkan ke pCFDDuetTM-1 plasmid (Novagen, Billerica, MA)
melalui prosedur pencernaan dan ligasi yang sama, menghasilkan
pCFDDuet_T7-di.sdcdan pCFDDuet_T7-Vc.sdc.Varian terpotong dariSDC
gen dariA. thaliana (At.sdc.t),berdasarkan pengecualian dari 57 residu
pertama (Rontein et al., 2003), PCR diamplifikasi dari pUC57
(menggunakan primer At.sdc.t_fwandpUC57_rv) dan diklon ke dalam
CFDDuet, menghasilkan pCFDDuet_T7-Di.sdc.t.
Gen amina oksidase yang disintesis dipecah dari plasmid pUC57
oleh restriksi endonuklease NdeI dan SalI dan diligasi menjadi
pET-28a(th)diperlakukan dengan endonuklease yang sama. Gen-gen
ini kemudian dikloning dari pET-28a (th)ke dalam SDC-mengandung
plasmid pCFDDuet menggunakan situs restriksi NdeI dan XhoI.
Plasmid yang dihasilkan adalah pCFDDuet_T7-Di.sdc.tthT7-aa,
pCFDDuet_T7-Di.sdc.tthT7-ao1,dan pCFDDuet_T7-Vc.sdcthT7- aa.
Untuk ekspresi berlebih dari jalur biosintesis serin, kami
menggunakan plasmid salinan rendah dengan promotor T7, p10_T7
(Ajikumar et al., 2010). Panjang penuhserAgen PCR diamplifikasi
(menggunakan primer serA_fw dan serA_rv) dariE. coliDNA genom K-12
dan diklon ke p10_T7 menggunakan situs NcoI dan SalI; kami juga
mengkloning (menggunakan primer serA_fw dan serA:317_rv) varian
terpotong dari serA (Bell et al., 2002). Plasmid yang dihasilkan adalah
p10_T7-serA dan p10_T7-serA:317plasmid. Selanjutnya,serCgen PCR
diamplifikasi (menggunakan primer serC_fw1 dan serC_rv1) dariE. coli
DNA genomik, dicerna dengan FseI dan SacI, dan diikat ke masing-
masing p10_T7-serAdan p10_T7-serA:317dicerna dengan endonuklease
yang sama; setara dilakukan untukSerbiagen (menggunakan primer
serB_fw1 dan serB_rv1). Untuk menambahkan gen berikutnya ke operon,
SerbiaPCR diamplifikasi (menggunakan primer serB_fw2 dan serB_rv2),
dicerna dengan SacI dan NotI, dan diikat ke masing-masing p10_T7-serA-
serCdan p10_T7-serA:317-serC;secara paralel,serC (PCR diamplifikasi
dengan primer serC_fw2 dan serC_rv2) diklon ke p10_T7-serA-serBdan
p10_T7-serA:317-serBmelalui pencernaan dan ligasi SacI dan NotI.
Akhirnya,fucOadalah PCR diamplifikasi (menggunakan primer fucO_fw
dan fucO_rv), dicerna dengan NotI dan XhoI, dan diikat ke dalam empat
plasmid biosintesis serin yang dicerna dengan enzim yang sama,
menghasilkan empat plasmid baru yang mengandungserA, serB, serC,
danfucOgen dengan ordo yang bervariasi. Semua endonuklease restriksi
dan T4 DNA ligase dibeli dari NEB (Ipswich, MA). Tabel I berisi daftar
plasmid yang digunakan dalam penelitian ini; urutan primer tercantum
dalam Tabel Tambahan S1.
Pereira dkk.: Bioproduksi Etilen Glikol Terbarukan 377
Bioteknologi dan Bioteknologi
Tabel I.Plasmid yang digunakan dalam penelitian ini. dan 30 g/L glukosa. Emulsi silikon antibusa B (Sigma-Aldrich, St. Louis,
MO) digunakan untuk mencegah pembusaan. Untuk semua kultur,
Nama plasmid Keterangan
streptomisin, kloramfenikol, dan kanamisin ditambahkan sesuai
pFucO p10_T7-fucO kebutuhan.
pAt1 pCFDDuet_T7-Di.sdc.tthT7-aao Untuk menganalisis produksi EG dari serin, 50 mL kultur medium
pAt2 pCFDDuet_T7-Di.sdc.tthT7-ao1
minimal dengan 10 g/L glukosa dalam labu kocok 250 mL diinokulasikan
pVc pCFDDuet_T7-Vc.sdcthT7-aao
pSer1 p10_T7-serA-serC-serB-fucO
ke OD600- 0,05 dari pra-kultur LB. Ini ditanam pada 30 C pada pengocok
pSer2 p10_T7-serA-serB-serC-fucO orbital pada 250 rpm. IPTG dan 2 g/L L-serine ditambahkan pada fase
pSer3 p10_T7-serA:317-serC-serB-fucO mid-log, dan sampel dikumpulkan 24 jam dan 48 jam kemudian. Untuk
pSer4 p10_T7-serA:317-serB-serC-fucO menganalisis produksi EG dari glukosa, 50 mL kultur medium minimal
dengan 30 g/L glukosa dalam labu kocok 250 mL diinokulasikan ke OD600-
0,05 dari pra-kultur LB. Ini lagi ditumbuhkan pada 30 C pada pengocok
orbital pada 250 rpm dengan IPTG ditambahkan pada fase mid-log.
E. coliNEB 5-alpha digunakan untuk pemeliharaan plasmid, danE. coli
Pengambilan sampel dilakukan pada waktu yang berbeda. Eksperimen
K-12 MG1655(DE3)DrecADakhirAdigunakan sebagai tuan rumah
bioreaktor dilakukan dalam wadah kultur Bioflo 3 L (New Brunswick
produksi. Modifikasi genetik tambahan dari inang produksi termasuk
Scientific, Enfield, CT) dengan volume kerja 2 L. Bioreaktor diinokulasi
penghapusan gen dilakukan sesuai dengan metode yang dijelaskan
dari 50 mL LB pra-kultur tumbuh pada 37 C. PH dipertahankan pada 7,0
sebelumnya (Datsenko dan Wanner, 2000). Penghapusan aldAdilakukan
dengan 6 N NaOH, dan kondisi aerobik dipertahankan dengan sparging
dengan menggunakan primer KOaldA_P1 dan KOaldA_P2, sdaA
dengan udara pada 1 lpm. Agitasi diatur ke 400 rpm, dan suhu diatur ke
menggunakan primer KOsdaA_P1 dan KOsdaA_P2, daneutBdan eutC
22, 30, atau 37 C. Semua data dicatat dengan sistem New Brunswick
menggunakan primer KOeutBC_P1 dan KOeutBC_P2. Plasmid yang
(New Brunswick), dan sampel kultur dikumpulkan melalui pipa panen.
dijelaskan di atas diubah menjadi berbagai inang produksi ini untuk
Sampel dari semua percobaan dianalisis seperti yang dijelaskan di bawah
biosintesis EG, dan galur yang digunakan dalam penelitian ini diringkas
ini.
dalam Tabel II.

Metode analitis
Kondisi Media dan Budidaya
Kepadatan sel kultur ditentukan dengan mengukur kepadatan
Untuk konstruksi strain dan pra-kultur fermentasi, kami
optik pada 600 nm (Ultrospec 2100 pro, Amersham (GE
menggunakan kaldu lisogen (LB) yang disiapkan sesuai instruksi
kesehatan, Piscataway, NJ). Sampel kepadatan sel diencerkan
(Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ). Medium
seperlunya sehingga berada dalam kisaran linier. Konsentrasi
minimal untuk kultur labu mengandung 2,0 g/L NH4Cl, 5.0 g/L (NH4)2
glukosa, etilen glikol, asetat, dan metabolit lainnya ditentukan
JADI4, 3,0 g/L KH2PO4, 7,3 g/LK2HPO4, 8,4 g/L MOPS, 0,50 g/L NaCl,
dalam sistem HPLC seri Agilent 1200 Infinity (Agilent, Santa
0,24 g/L MgSO4, 0,08mg/L Na2Melenguh4, 10mL/L larutan mineral,
Clara, CA), digabungkan dengan kolom Aminex HPX-87H (Bio-
dan konsentrasi glukosa tertentu. Larutan mineral terdiri dari 3,6 g/
Rad, Hercules, CA) yang dipanaskan pada 50 C dan 1 cm
L FeCl2- 4H2O, 5 g/L CaCl2- 2H2O, 1,3 g/L MnCl2- 2H2O, 0,38 g/L CuCl2-
precolumn Fase gerak 14 mM H2JADI4dijalankan pada 0,7 mL /
2H2O, 0,5 g/L CoCl2- 6H2O, 0,94 g/L ZnCl2, 0,0311 g/LH3BO3, 0,4 g/L
menit. Detektor indeks bias diferensial (Agilent, Santa Clara, CA)
Na2EDTA-2H2O, dan 1,01 g/L tiamin-HCl. Untuk fermentasi
digunakan untuk deteksi dan kuantifikasi analit. Hasil dihitung
bioreaktor, media terdiri dari 2,0 g/L NH34Cl, 5.0 g/L (NH4)2JADI4, 2,0
antara dua titik waktu, sedangkan hasil kumulatif dihitung
g/L KH2PO4, 0,5 g/L NaCl, 0,24 g/L MgSO4, 0,08 mg/L Na2Melenguh4,
antara pengukuran awal dan akhir.
10mL/L larutan mineral,

Hasil
Tabel II.E. colistrain yang digunakan dalam penelitian ini.

Rekayasa Jalur untuk Konversi Serine-ke-EG

Nama regangan Keterangan
Untuk menetapkan biosintesis de novo EG seperti yang diusulkan pada
WT K-12 MG1655 (DE3)
Gambar 1, tujuan pertama adalah untuk menunjukkan jalur heterolog
EG-01 WT/pAt1
EG-02 WT/pAt1/pFucO yang mengubah serin menjadi EG. Kami mulai dengan memvalidasi
EG-03 WTDaldA produksi in vivo etanolamin dari serin (aplikasi paten PCT/EP2007/
EG-04 EG-03/pAt1 055762; Foti et al., 2013). Secara khusus, kami mengekspresikannya
EG-05 EG-03/pAt1/pFucO
secara berlebihan dalamE. coli K-12 MG1655(DE3) serin dekarboksilase
EG-06 EG-03/pSer1/pAt1
yang dioptimalkan kodon dariArabidopsis thaliana (At.sdc)dan juga versi
EG-07 EG-03/pSer2/pAt1
EG-08 EG-03/pSer3/pAt1 terpotong dari enzim ini untuk mencapai aktivitas yang lebih baik (
EG-09 EG-03/pSer4/pAt1 Di.sdc.t) (Rontein dkk., 2003). Ketika serin eksogen diumpankan ke galur
EG-10 EG-09DeutBC yang dihasilkan, pembentukan etanolamina dikonfirmasi oleh analisis
EG-11 EG-09DsdaA
GC-MS, dan SDC terpotong terbukti lebih efektif daripada enzim
EG-12 EG-03/pSer4/pAt2
fulllength (data tidak ditampilkan); untuk percobaan selanjutnya, kami
EG-13 EG-03/pSer4/pVc
melanjutkan dengan versi SDC yang terpotong. Selanjutnya, kita lanjut

378 Bioteknologi dan Bioteknologi, Vol. 113, No. 2, Februari 2016

memasukkan etanolamin oksidase AAO dariArthrobactersp. FERM
P-06240 menjadiE.coli (Ota dkk., 2008); kombinasi serin
dekarboksilase heterolog dan etanolamin oksidase membentuk
jalur yang layak yang mengarah dari serin ke glikolaldehida, yang
kemudian dapat direduksi menjadi EG oleh aktivitas reduktase
glikolaldehida endogen. Ini direkayasaE.coli,strain EG-01,
ditumbuhkan pada suhu 30 C dalam labu kocok yang mengandung
media minimal dengan 10 g/L glukosa; ketika kultur mencapai fase
log, 2 g/L serin eksogen ditambahkan, dan 25 mg/L EG diproduksi
setelah 24 jam budidaya, mengkonfirmasi fungsionalitas jalur dari
serin ke EG (Gbr. 2).
Dalam upaya untuk meningkatkan biosintesis EG, kami menggunakan dua
strategi rekayasa metabolik untuk meningkatkan konversi serin di
E.coli.Pertama, kami mengekspresikanE.coli fucOgen untuk
meningkatkan konversi glikolaldehida menjadi EG. Kedua, kami
menghapus jalur persaingan oksidasi glikolaldehida menjadi glikolat
dengan menghapusaldAgen dariE. colikromosom. Untuk mengevaluasi
efek dari perubahan ini, galur ini juga ditumbuhkan dalam medium
minimal dan dilengkapi dengan serin eksogen, seperti dijelaskan di atas.
Ditemukan bahwa ekspresi berlebihan darifucOgen meningkatkan
produksi EG pada kedua titik waktu dan untuk kedua host (strain EG-02
dan EG-05 pada Gambar. 2). Sebagai perbandingan, penghapusanaldA
gen tidak memiliki pengaruh yang signifikan pada produksi (strain EG-04
dan EG-05 relatif terhadap EG-01 dan EG-02, masing-masing). Pada galur
terbaik, produksi EG-05, 100mg/L EG dicapai setelah 48 jam. Hasil ini
dengan jelas menunjukkan bahwa, dibandingkan dengan pesaingaldA
penghapusan gen, peningkatan pengurangan glikolaldehida memainkan
peran kunci untuk peningkatan biosintesis EG.
Ekspresi berlebih dari Enzim Serin-Biosintesis untuk
Meningkatkan Penyediaan Serin
Kami selanjutnya mulai merekayasa jalur biosintesis serin hulu
untuk menghubungkan jalur EG heterolog keE. coliwarga asli
Gambar 2.Konversi serin ke EG. DirekayasaE. colistrain dengan SDC dan AAO
over-ekspresi dikultur dalam medium minimal dengan glukosa, dan 2 g/L serin
eksogen ditambahkan pada fase mid-log. Konsentrasi EG dalam supernatan diukur
24 dan 48 jam setelah penambahan serin. Kolom adalah rata-rata eksperimen
duplikat; bilah kesalahan mewakili kesalahan standar.
metabolisme. Untuk tujuan ini, kami mengekspresikannya secara
berlebihanE. coliwarga asliserA, serC,danSerbiagen untuk memperkuat
fluks yang mengarah dari metabolisme pusat ke serin; gen ini
digabungkan denganfucO, At.sdc, danaa,diE. coliEG-06. Budidaya strain
EG-06 pada suhu 30 C dalam labu kocok yang mengandung media
minimal dengan 30 g/L glukosa memungkinkan produksi 130 mg/L EG
langsung dari glukosa, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 3A.
Penyesuaian dariSerbiadanserCpengaturan gen dalam operon ekspresi,
menghasilkan urutan ekspresi baru dariserA-serB-serC (strain EG-07),
tidak meningkatkan titer akhir. Dalam upaya untuk lebih meningkatkan
produksi EG, kami menggunakan enzim SerA yang direkayasa yang
memiliki pemotongan terminal-C yang menghalangi penghambatan
umpan balik oleh serin (Bell et al., 2002). Ditemukan bahwa penggunaan
enzim SerA (SerA:317) baru ini memang sangat meningkatkan produksi
EG. Sistem ekspresi yang terdiri dari SerA:317 dan SerC dan SerB utuh
(regangan EG-08) meningkatkan titer EG menjadi 2,2 g/L, yang
menunjukkan bahwa langkah komitmen pertama untuk biosintesis serin,
dehidrogenasi 3-fosfogliserat, adalah langkah pembatas utama untuk
Jalur biosintesis EG. Selanjutnya, dalam hal ini, penataan ulangSerbiadan
serCdalam operon memang mempengaruhi peningkatan produksi yang
signifikan; yang direkayasa secara metabolikE. coliEG-09 dengan
serA:317-serB-serC-fucOoperon mencapai titer akhir 2,8 g/L EG (Gbr. 3A).
Hasil EG memuncak pada 0,24 g-EG/g-glukosa antara 36 dan 48 jam (Gbr.
3C); meskipun periode yang sangat produktif ini berumur pendek, strain
masih mencapai hasil kumulatif 0,12 g-EG/g-glukosa (17% dari jalur
teoritis maksimum 0,69 g/g) setelah 96 jam.
Menguji Knockout Tambahan dan Gen Alternatif
Untuk mengoptimalkan sistem bioproduksi, kami memodifikasi lebih lanjut
yang direkayasaE. colidengan fokus pada dua jalur yang bersaing; secara
khusus, eutBC (berurutaneutBdaneutCgen) yang mengkode ethanolamine
amonia-lyase dansdaApengkodean deaminase serin masing-masing secara
terpisah dihapus dariE. colikromosom. PenghapusaneutBC memiliki sedikit
efek pada produksi EG, menghasilkan titer 2,54 g/L dan hasil kumulatif 0,114
g/g (Tabel III, strain EG-10); penghapusansdaA (regangan EG-11), namun,
secara signifikan mengurangi kinerja, hanya menghasilkan 0,59 g/L EG dengan
hasil kumulatif 0,037 g/g.
Selain upaya melemahkan reaksi samping ini, kami juga menyelidiki
alternatif untuk gen jalur. Ituao1gen dari Rhodococcus opacus
mengkodekan amina oksidase lain yang telah menunjukkan aktivitas
pada etanolamin (Foster et al., 2012), dan kami menguji kinerjanya dalam
strain EG-12. EG-12 memang menunjukkan produksi EG, membenarkan
bahwaao1produk gen aktif sebagai etanolamin oksidase in vivo, tetapi
titer 1,35 g/L EG (Tabel III) secara signifikan lebih rendah dari hasil
sebelumnya denganaa.Kami selanjutnya berusaha meningkatkan
efisiensi biosintesis dengan memanfaatkan SDC alternatif. Untuk tujuan
ini, kami menyelidiki SDC dari ganggang Volvox carteriyang telah
digunakan untuk memproduksi etanolamin dalam
P.putida (Foti et al., 2013). Seperti diungkapkan pada Gambar 4A, strain EG-13
denganV. carteriSDC mencapai titer yang lebih besar (4,1 g/L) daripada yang
diamati dengan terpotongA. thalianaSDC. Hasil maksimum serupa, memuncak
pada 0,22 g/g antara 48 dan 72 jam (Gbr. 4A), tetapi galur EG-13 mencapai
hasil kumulatif yang sedikit lebih besar, 0,14 g-EG/g-glukosa (20% dari hasil
teoretis). ). Glukosa dikonsumsi secara bertahap dalam 100 jam, disertai
dengan kepadatan sel yang stabil
Pereira dkk.: Bioproduksi Etilen Glikol Terbarukan 379
Bioteknologi dan Bioteknologi
Gambar 3.Produksi EG dari glukosa. DirekayasaE. colistrain dikultur dalam labu kocok yang mengandung medium minimal dengan 30 g/L glukosa pada 30 C. OD dan pengukuran metabolit
supernatan diambil pada berbagai titik waktu. (SEBUAH)konsentrasi EG; (B)pertumbuhan sel (OD600); (C)hasil EG; (D)konsentrasi glukosa. Titik data adalah rata-rata dari n3; bilah kesalahan
mewakili kesalahan standar.

meningkat dari waktu ke waktu, dan akumulasi asetat diamati pada
akhir budidaya (Gbr. 4).
Bioreaktor Produksi EG
Dalam upaya untuk meningkatkan proses biosintesis EG, direkayasa
E. coliEG-13 dibudidayakan dalam bioreaktor 2 L untuk lebih
meningkatkan produksi. Kami pertama menggunakan 30 C sebagai
suhu produksi yang konsisten dengan suhu yang digunakan dalam
percobaan labu kocok yang dijelaskan di atas. Tanpa diduga, kami
menemukan bahwa produksi EG hanya mencapai 1,6 g/L setelah 50
jam (Gbr. 5A), lebih rendah dari yang dicapai dalam labu, meskipun
hasil maksimum adalah 0,25 g/g (Gbr. 5C), sedikit lebih besar dari
percobaan labu. Hasil kemudian menurun secara dramatis, diikuti
oleh konsumsi glukosa yang cepat, pertumbuhan yang bersamaan,
dan produksi asetat (Gbr. 5 dan Gambar Tambahan S2). Meskipun
jalur biosintesis EG aktif dan efisien,
Tabel III. Titer EG dan hasil kumulatif setelah 96 jam budidaya dalam shake
labu pada suhu 30 C.
Regangan Titer EG (g/L)
EG-10 2.54 0.19
EG-11 0,59 0,05
EG-12 1,35 0,11
kinerja keseluruhan berkurang di bawah kondisi ini, sehingga
pendekatan rekayasa proses dieksplorasi untuk meningkatkan
produksi bioreaktor; kami kemudian menguji suhu budidaya 37 dan
22 C. Hasil untuk 37 C bahkan lebih buruk, tetapi kami menemukan
bahwa 22 C memang membantu produksi EG, meskipun waktu
produksi lebih lama. Seperti ditunjukkan pada Gambar 5A,
penggunaan 22 C sebagai suhu budidaya menghasilkan produksi EG
sebesar 3,1 g/L setelah 150 jam. Hasil memuncak pada 0,22 g/g,
diikuti oleh penurunan bertahap setelah 100 jam (Gbr. 5C);
sementara itu, kepadatan sel kultur terus meningkat setelah 100
jam (Gbr. 5C). Pengamatan ini menunjukkan bahwa efisiensi jalur
EGbiosintesis tidak tergantung pada pertumbuhan sel. Seperti yang
ditunjukkan pada Gambar 5D, akumulasi asetat ditekan pada 22 C,
Diskusi
Biosintesis EG dari substrat karbon terbarukan merupakan pendekatan
penting dan menjanjikan untuk mengatasi masalah saat ini terkait
dengan produksi EG dari bahan baku petrokimia. Studi kami bertujuan
untuk merekayasa bakteri secara metabolikE. coliuntuk mencapai
biosintesis EG dari glukosa gula terbarukan. SebagaiE. coli tidak secara
Hasil kumulatif
alami menghasilkan EG di bawah kondisi pertumbuhan yang khas,
(g-EG/g-glukosa)
penciptaan jalur fluks tinggi yang mengarah dari glukosa ke EG melalui
0,114 0,005 metabolisme sentral diperlukan. Ini dicapai dengan pembentukan jalur
0,037 0,002
biosintetik dua bagian termasuk produksi serin dari glukosa dan konversi
0,110 0,002
serin-ke-EG.

380 Bioteknologi dan Bioteknologi, Vol. 113, No. 2, Februari 2016


Gambar 4. Evaluasi dariV. carteriSDC. DirekayasaE. colistrain EG-13 adalah
dikultur dalam medium minimal dengan glukosa 30 g/L pada suhu 30 C. OD dan pengukuran
metabolit supernatan dilakukan pada berbagai titik waktu. (SEBUAH)Konsentrasi EG,
konsentrasi asetat, dan hasil EG dari waktu ke waktu; (B)pertumbuhan sel (OD600) dan
konsentrasi glukosa dari waktu ke waktu. Poin data adalah rata-rata eksperimen duplikat;
bilah kesalahan mewakili kesalahan standar.
Di bagian hilir, kami pertama kali merekayasa dekarboksilase serin
dariA. thalianadan etanolamin oksidase dariArthrobactersp. untuk
mengubah serin asam amino endogen menjadi EG melalui
glikolaldehida. Untuk tujuan ini, kami memilih dan memanfaatkan enzim
heterolog yang telah dikarakterisasi dalam penelitian sebelumnya (Ota et
al., 2008; Rontein et al., 2003). Meskipun kombinasi kedua enzim
heterolog ini menghasilkan pembentukan EG diE.coli,titer produksinya
rendah. Hasil ini menunjukkan bahwa optimasi serin dekarboksilase dari
A. thalianadan aktivitas etanolamin oksidase baik melalui rekayasa
protein atau penggunaan enzim heterolog yang diisolasi dari organisme
lain dapat menjadi cara penting untuk lebih meningkatkan efisiensi jalur.
Namun demikian, kami melanjutkan untuk memodifikasi metabolisme
latar belakang mikroorganisme tuan rumah untuk meningkatkan fluks
metabolisme pada jalur biosintetik EG yang diinginkan. Ditemukan
bahwa, dibandingkan dengan penghapusan pesaingaldAgen, ekspresi
berlebihan darifucOgen memiliki efek yang jauh lebih signifikan pada
produksi EG. Hal ini tampaknya disebabkan oleh fakta bahwa konversi
glikolaldehida menjadi EG terbatas pada sebagian besar jalur serin-ke-
EG.
Bagian hulu dari jalur EG melibatkan biosintesis asam amino
serin. Diketahui bahwa tipe liarE. colihanya memiliki relatif
fluks metabolisme yang lemah untuk mensintesis asam amino ini, yang
menghadirkan tantangan bagi biosintesis EG de novo dari glukosa.
Namun, produksi berlebih serin telah dilaporkan sebelumnya untuk
E.coli (Gu et al., 2014; Li et al., 2012) dan untukCorynebacterium
glutamicum (Peters-Wendisch dkk., 2005; Stolz et al., 2007). Oleh karena
itu, menggunakan studi ini sebagai pedoman, kami meningkatkan jalur
biosintetik serin dengan mengekspresikan gen yang diperlukan secara
berlebihan yang terlibat,serA, serC,danSerbia.Secara khusus, kami
menggunakan SerA tipe liar dan tahan umpan balik untuk meningkatkan
aktivitas enzim in vivo ini. Telah dikonfirmasi dalam penelitian ini bahwa
SerA:317 dengan pemotongan domain regulasi terminal-C (Bell et al.,
2002) lebih efektif dalam mengubah metabolit sentral 3-fosfogliserat
untuk mendukung pembentukan serin. Akibatnya, kombinasi SerA yang
direkayasa dan bentuk asli SerB dan SerC menghasilkan peningkatan
produksi EG di bidang rekayasa.E.coli. Selain itu, ketika gen SerA tahan-
umpan balik digunakan, kami menemukan bahwa menempatkanSerbia
gen sebelumserCgen dalam ekspresi operon menghasilkan produksi EG
yang lebih tinggi. sebagaiSerbia gen diekspresikan dengan kekuatan
yang lebih tinggi ketika ditempatkan lebih dekat ke promotor, hasil ini
menunjukkan bahwa konversi 3-fosfo-L-serin menjadi serin yang
dikatalisis oleh SerB adalah langkah pembatas untuk produksi serin.
Serin tidak hanya asam amino penting untuk sintesis protein, tetapi
juga memainkan peran sentral untuk beberapa jalur metabolisme
penting. Faktanya, serin adalah prekursor untuk asam amino glisin,
sistein, dan triptofan; itu juga terlibat dalam biosintesis fosfolipid dan
pembentukan unit 1-karbon. Selanjutnya, serin dapat dimetabolisme
menjadi piruvat oleh deaminase serin (Su, 1989; Su dan Newman, 1991).
Karena peran penting serin ini, sulit untuk mencegah pengalihan jalur
serin ke jalur non-produktif; oleh karena itu, kami hanya mengamati hasil
maksimum 0,25 g/g dalam rekayasa kami
E.coli.Salah satu solusi yang mungkin untuk mengimbangi jalur bersaing ini adalah dengan
menggunakan SDC dengan afinitas yang lebih besar untuk serin. Misalnya, Kmuntuk
A. thalianaSDC dilaporkan sebagai 12 mM (Rontein et al., 2001), yang
dapat berkontribusi pada kinerja reaksi dekarboksilasi serin yang kurang
optimal. Karena SDC ditemukan di banyak spesies tanaman dan alga,
penyelidikan dan penyaringan SDC skala besar dapat dilakukan untuk
mengidentifikasi SDC yang lebih baik untuk produksi EG. Perlu dicatat
bahwa upaya tersebut akan lebih rumit dengan memasukkan versi
terpotong dari setiap SDC.
Selain serin, jalur biosintetik EG kami juga bersaing dengan metabolisme sentral
untuk 3-fosfogliserat. Karena sel cenderung mengarahkan lebih banyak fluks
metabolik untuk pertumbuhan, maka sulit untuk mengalihkan aliran karbon yang
kuat ke arah pembentukan EG. Di sisi lain, tingkat pertumbuhan sel tertentu
diperlukan untuk produktivitas yang diinginkan. Oleh karena itu, menyeimbangkan
pertumbuhan dan produksi di bidang rekayasaE. coliadalah kunci untuk peningkatan
lebih lanjut dari hasil produksi EG. Untuk tujuan ini, penggunaan sirkuit genetik yang
merasakan kebutuhan metabolisme pertumbuhan dan produksi akan menjadi
pilihan untuk upaya penelitian di masa depan.
Perlu dicatat bahwa hasil produksi EG secara intrinsik dibatasi
oleh stoikiometri jalur. Karena hilangnya karbon melalui
dekarboksilasi serin, setiap molekul glukosa hanya dapat
menghasilkan dua molekul EG 2-karbon secara maksimal. Kecuali
ada jalur alternatif yang dapat melewati langkah dekarboksilasi dan
melestarikan karbon, produksi EG tidak dapat melebihi hasil
maksimum teoritis 0,69 g/g. Sepengetahuan kami, tidak ada jalur
seperti itu yang ditemukan dan dicirikan.
Pereira dkk.: Bioproduksi Etilen Glikol Terbarukan 381
Bioteknologi dan Bioteknologi
Gambar 5.Efek meningkatkan produksi EG. DirekayasaE. colistrain EG-13 dikultur dalam medium minimal dengan 30 g/L glukosa dalam bioreaktor pada berbagai suhu. Pengukuran OD dan
metabolit supernatan dilakukan pada berbagai titik waktu. (SEBUAH)konsentrasi EG; (B)pertumbuhan sel (OD600); (C)hasil EG; (D)konsentrasi glukosa.
Untuk meningkatkan proses produksi EG, para insinyur
E. coliEG-13 dibudidayakan dalam bioreaktor, tetapi strain
tidak dapat mencapai titer yang dicapai dalam labu kocok
meskipun hasil maksimum kira-kira sama dalam kedua
kasus; variasi ini dapat dikaitkan dengan perbedaan durasi
fase produksi tingkat tinggi. Tidak jelas apa penyebab yang
mendasari efek akhir prematur dari fase produksi, tetapi
bioreaktor memiliki transfer oksigen yang lebih besar,
menunjukkan bahwa stres oksidatif mungkin berperan.
Ditemukan bahwa 22 C adalah suhu yang lebih baik untuk
mendukung produksi EG pada skala yang lebih tinggi
karena fase produksi diperpanjang. Temuan ini menyiratkan
bahwa pada suhu yang lebih rendah, pelipatan dan aktivitas
enzim jalur heterolog ditingkatkan atau stres oksidatif
berkurang.E. coliPlatform produksi EG.
Kami berterima kasih atas dukungan dari Departemen Energi Hibah nomor DE-
SC0008744. BP, MDM, dan GS adalah penemu bersama pada aplikasi paten PCT/
US2013/027351: "Mikroba rekayasa dan jalur metabolisme untuk produksi etilen
glikol." BP dan GS adalah salah satu pendiri Advanced Renewable Technologies yang
telah melisensikan teknologi yang dilaporkan. HZ dan CGL melaporkan tidak ada
konflik kepentingan.
Referensi
Ajikumar PK, Xiao WH, Tyo KEJ, Wang Y, Simeon F, Leonard E, Mucha O, Phon TH,
Pfeifer B, Stephanopoulos G. 2010. Optimalisasi jalur isoprenoid untuk kelebihan
produksi prekursor taksol diEscherichia coli.Sains 330:70–74.
382 Bioteknologi dan Bioteknologi, Vol. 113, No. 2, Februari 2016
Bell JK, Pease PJ, Bell JE, Grant GA, Banaszak LJ. 2002. Deregulasi D-3-
fosfogliserat dehidrogenase dengan penghapusan domain. Eur J Biochem 269:
4176–4184.
Datsenko KA, Wanner BL. 2000. Inaktivasi satu langkah gen kromosom di
Escherichia coliK-12 menggunakan produk PCR. Proc Natl Acad Sci USA
97(12):6640–6645.
Foster A, Barnes N, Speight R, Keane MA. 2012. Identifikasi, ekspresi fungsional
dan analisis kinetik dari dua oksidase amina primer dari Rhodococcus opacus. J
Mol Catal B-Enzym 74:73–82.
Foti M, M-edici R, Ruijssenaars HJ. 2013. Produksi biologis monoethanolamine
oleh rekayasaPseudomonas putidaS12. J Bioteknol 167:344–349.
Gu P, Yang F, Su T, Li F, Li Y, Qi Q. 2014. Konstruksi produksi seri-L
Escherichia colimelalui rekayasa metabolisme. J Ind Mikrobiol Bioteknol 41:
1443–1450.
Ji N, Zhang T, Zheng M, Wang A, Wang H, Wang X, Shu Y, Stottlemyer AL, Chen JG.
2009. Konversi katalitik selulosa menjadi etilen glikol melalui katalis karbida
yang didukung. Catal Hari Ini 147:77–85.
Kulkarni AP, Hodgson E. 1973. Etanolamin oksidase dari lalat,phormia
regina (Diptera: Serangga). Comp Biochem Physiol B 44:407–422.
Li Y, Chen GK, Tong XW, Zhang HT, Liu XG, Liu YH, Lu FP. 2012. Pembangunan
Escherichia colistrain yang memproduksi L-serin dari glukosa. Biotechnol Lett
34:1525–1530.
Liu H, Ramos KR, Valdehuesa KN, Nisola GM, Lee WK, Chung WJ. 2013.
Biosintesis etilen glikol diEscherichia coli.Aplikasi Mikrobiol Bioteknol
97:3409–3417.
Narrod SA, Jakoby WB. 1964. Metabolisme ethanolamine: Sebuah ethanolamine
oksidase. J Biol Chem 239:2189–2193.
Ota H, Tamezane H, Sasano Y, Hokazono E, Yasuda Y, Sakasegawa S, Imamura S,
Tamura T, Osawa S. 2008. Karakterisasi enzimatik dari amina oksidase dari
Arthrobactersp. digunakan untuk mengukur fosfatidiletanolamin. Biosci
Biotechnol Biochem 72:2732–2738.
Pang J, Zheng M, Wang A, Zhang T. 2011. Hidrogenasi katalitik batang jagung menjadi
etilen glikol dan 1,2-propilen glikol. Ind Eng Chem Res 50:6601–6608.
Peters-Wendisch P, Stolz M, Etterich H, Kennerknecht N, Sahm H, Eggeling L. 2005.
Rekayasa metabolismeCorynebacterium glutamicumuntuk produksi L-serin.
Mikrobiol Lingkungan Appl 71:7139–7144.
Prochnik SE, Umen J, Nedelcu AM, Hallmann A, Miller SM, Nishii I, Ferris P, Kuo A,
Mitros T, Fritz-Laylin LK, Hellsten U, Chapman J, Simakov O, Rensing SA, Terry A,
Pangilinan J, Kapitonov V, Jurka J, Salamov A, Shapiro H, Schmutz J, Grimwood J,
Lindquist E, Lucas S, Grigoriev IV, Schmitt R, Kirk D, Rokhsar DS. 2010. Analisis
genomik kompleksitas organisme dalam alga hijau multiseluler Volvox carteri.
Sains 329:223–226.
Rontein D, Nishida I, Tasahiro G, Yoshioka K, Wu WI, Voelker DR, Basset G,
Hanson AD. 2001. Tanaman mensintesis etanolamin dengan dekarboksilasi
langsung serin menggunakan enzim piridoksal fosfat. J Biol Chem 276:35523–
35529.
Rontein D, Rhodes D, Hanson AD. 2003. Bukti dari rekayasa bahwa
dekarboksilasi serin bebas adalah sumber utama bagian etanolamina pada
tanaman. Fisiol Sel Tumbuhan 44:1185-1191.
Stolz M, Peters-Wendisch P, Etterich H, Gerharz T, Faurie R, Sahm H, Fersterra H,
Eggeling L. 2007. Mengurangi pasokan folat sebagai kunci untuk meningkatkan produksi L-serin
denganCorynebacterium glutamicum.Mikrobiol Lingkungan Appl 73: 750–755.
Su H, Lang BF, Newman EB. 1989. Degradasi L-serin diEscherichia coliK-12:
Kloning dan pengurutan darisdaAgen. J Bakteriol 171:5095–5102. Su H,
Newman EB. 1991. Aktivitas deaminase L-serin baru diEscherichia coli
K-12. J Bakteriol 173:2473–2480.
Sun J, Liu H. 2011. Hidrogenolisis selektif dari xylitol yang diturunkan dari biomassa menjadi etilena
glikol dan propilen glikol pada katalis Ru yang didukung. Kimia Hijau 13:135-142.
informasi pendukung
Informasi pendukung tambahan dapat ditemukan dalam
versi online artikel ini di situs web penerbit.
Pereira dkk.: Bioproduksi Etilen Glikol Terbarukan 383
Bioteknologi dan Bioteknologi