Bioteknologi Kemajuan 37 (2019) 519–529

Daftar isi tersedia di ScienceDirect

Kemajuan Bioteknologi

beranda jurnal: www.elsevier.com/locate/biotechadv

Makalah review penelitian

Rekayasa jamur berfilamen untuk konversi lignoselulosa yang efisien: Alat, kemajuan dan
prospek terkini

Guodong Liu Sebuah , b , Yinbo Qu Sebuah , c , •

Sebuah Laboratorium Kunci Negara Teknologi Mikroba, Universitas Shandong, Qingdao 266237, Cina
b Shandong Key Laboratory of Water Pollution Control and Resource Reuse, School of Environmental Science and Engineering, Shandong University, Qingdao 266237, China

c Pusat Penelitian Glycoengineering Nasional, Universitas Shandong, Qingdao 266237, Cina

ARTICLEINFO ABSTRAK

Kata kunci: Jamur berfilamen, sebagai penghasil utama enzim lignoselulolitik dalam industri, perlu direkayasa untuk meningkatkan ekonomi konversi
Lignoselulosa lignoselulosa skala besar. Investigasi proses seluler yang terlibat dalam produksi enzim lignoselulolitik, serta optimalisasi campuran enzim
Selulase untuk efisiensi hidrolisis yang lebih tinggi, telah memberikan target yang efektif untuk rekayasa jamur lignoselulolitik. Baru-baru ini,
Jamur
pengembangan sistem manipulasi genetik yang efisien pada beberapa jamur lignoselulolitik membuka kemungkinan sistem rekayasa strain ini.
Rekayasa genetika
Di sini, kami meninjau kemajuan terbaru yang dibuat dalam rekayasa jamur lignoselulolitik dan menyoroti kesenjangan penelitian di bidang ini.
Bioprocessing terkonsolidasi

1. Perkenalan
Pengembangan jalur teknis untuk produksi bahan bakar dan bahan kimia dari bioresources yang
dapat diperbarui telah menarik banyak perhatian. Lignoselulosa sebagai sumber daya organik
terbarukan yang paling melimpah di Bumi merupakan bahan baku potensial untuk tujuan ini ( Lynd
dkk., 2008 ). Namun, konversi lignoselulosa skala besar menjadi produk masih menantang karena
heterogenitas dan rekalsitensi bahan lignoselulosa dan oleh karena itu biaya pemrosesan yang tinggi
( Balan, 2014 ).
ruang terbatas untuk lebih meningkatkan tingkat produksi dari strain perusahaan pemasok enzim
(puluhan gram per liter, Gusakov, 2011 ), produksi enzim lignoselulolitik di tempat untuk meningkatkan
ekonomi ( Barta et al., 2010 ) biasanya membutuhkan pembangunan galur sendiri dengan
produktivitas tinggi dan biaya fermentasi rendah. Untuk mencapai tujuan ini, proses seluler termasuk
regulasi transkripsi gen enzim lignoselulolitik, serta pelipatan, glikosilasi, sekresi dan penurunan
enzim dalam jamur berfilamen dipelajari dan direkayasa dalam beberapa dekade terakhir.

Salah satu pendekatan populer untuk mengubah lignoselulosa menjadi produk terutama
melibatkan tiga langkah ( Schubert, 2006 ). Pada langkah pertama, bahan lignoselulosa diolah
sebelumnya dengan metode fisik, kimiawi atau biologi untuk menghancurkan struktur lignoselulosa
dan untuk meningkatkan daya cerna enzimatik selulosa ( Gambar 1 Sebuah). Setelah pretreatment,
enzim lignoselulolitik digunakan untuk mendegradasi selulosa dan hemiselulosa menjadi gula
sederhana ( Gambar 1 c). Selain itu, bahan lignoselulosa yang telah diolah sebelumnya dapat
digunakan sebagai sumber karbon untuk produksi enzim sakarselulosa ( Gambar 1 b). Gula yang
diperoleh kemudian difermentasi menjadi produk yang diinginkan (misalnya etanol) oleh
mikroorganisme ( Gambar 1 d). Dalam beberapa jalur teknologi, langkah-langkah sakarifikasi enzimatik
dan fermentasi mikro mungkin dilakukan secara bersamaan.
Enzim lignoselulolitik yang saat ini digunakan dalam industri terutama diproduksi oleh jamur
berfilamen untuk tingkat produksi yang tinggi dan komposisi enzim yang lengkap. Meski sepertinya
hanya ada
Bahan lignoselulosa alami mengandung selulosa dalam bentuk kristal dan amorf dan
hemiselulosa dengan struktur kompleks dan komposisi gula ( Berlin, 2013 ). Jamur lignoselulolitik
umumnya mengeluarkan lebih dari 20 jenis enzim untuk degradasi substrat ini secara efektif ( van den
Brink dan de Vries, 2011 ). Namun, sekretom asli ini seringkali tidak cukup efektif untuk degradasi
bahan lignoselulosa yang telah diolah sebelumnya karena komposisi enzim yang tidak seimbang dan
kinerja enzim individu yang buruk. Laboratorium dan perusahaan akademis (misalnya Novozim) telah
membuat kemajuan besar dalam penambangan dan perekayasaan enzim yang lebih baik, dan
mengoptimalkan komposisi campuran enzim ( Harris et al., 2014 ; Liu et al., 2013a ;
Merino dan Cherry, 2007 ).
Di sini, kami meninjau kemajuan terbaru dalam rekayasa jamur filamen untuk biokonversi
lignoselulosa yang efisien. Selain penghasil selulase yang paling banyak digunakan Trichoderma
reesei ( lihat ulasan terbaru Bischof dkk., 2016 ; Druzhinina dan Kubicek, 2017 ), Penicillium

• Penulis korespondensi di: State Key Laboratory of Microbial Technology, Shandong University, Qingdao 266237, China.

Alamat email: quyinbo@sdu.edu.cn (Y. Qu).

https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.12.004
Diterima 9 Oktober 2017; Diterima dalam bentuk revisi 13 Desember 2018; Diterima 14 Desember 2018 Tersedia online 18
Desember 2018
0734-9750 / © 2018 Elsevier Inc. Semua hak dilindungi undang-undang.
G. Liu, Y. Qu
Gambar 1. Seluruh proses biokonversi lignoselulosa. Agar dapat diintegrasikan secara efisien ke dalam proses, dua belas faktor yang perlu dipertimbangkan selama rekayasa jamur lignoselulolitik ditunjukkan
pada setiap langkah dan dihubungkan ke tabel tengah (dalam warna merah). (Untuk interpretasi referensi warna dalam legenda gambar ini, pembaca merujuk ke versi web artikel ini.)
oxalicum ( Liu et al., 2013b ) dan Myceliophthora thermophila ( Visser et al., 2011 ) yang juga
merupakan produsen selulase industri dan Neuro- spora crassa sebagai model jamur di daerah
penelitian ini ( Roche dkk., 2014b ) juga tercakup untuk kemajuan signifikan yang dibuat pada spesies
ini.
2. Rekayasa jamur lignoselulolitik untuk produksi enzim tingkat tinggi
Produksi enzim lignoselulolitik berbiaya rendah untuk sakarifikasi ( Gambar 1 b) membutuhkan
konstruksi galur jamur dengan kemampuan menghasilkan enzim yang tinggi. Seperti diringkas di
bawah ini, rekayasa transkripsi gen dan proses sekresi protein telah menjadi strategi utama untuk
meningkatkan produksi enzim lignoselulolitik dalam jamur. Selain itu, rekayasa morfologi miselium
untuk mengurangi viskositas dalam kultur terendam (mis gul-1 gen dalam N. crassa, Lin dkk., 2018 ),
dan rekayasa jalur pemanfaatan substrat untuk memungkinkan pertumbuhan media murah ( Ellilä
dkk., 2017 ), adalah keuntungan untuk produksi enzim berbiaya rendah.
2.1. Meningkatkan transkripsi gen pengkode enzim lignoselulolitik
Sintesis enzim lignoselulolitik pada jamur berfilamen terutama diatur pada tingkat transkripsi.
Umumnya, transkripsi diinduksi oleh oligosakarida yang diturunkan dari lignoselulosa (misalnya
selodekstrin) dan ditekan oleh sakarida yang digunakan secara istimewa (misalnya glukosa). Oleh
karena itu, eliminasi β-glukosidase (BGs) yang menghidrolisis selo-dekstrin menjadi glukosa mampu
meningkatkan ekspresi gen enzim lignoselulolitik ( Gambar 2 , proses a). Penghapusan gen yang
mengkode BG intraseluler utama, tetapi bukan BG ekstraseluler utama, meningkatkan produksi
selulase pada selulosa sekitar 3 kali lipat. P. oxalicum ( Chen et al., 2013 ). Efek peningkatan serupa
dilaporkan di M. thermophila ( Liu dkk., 2017 ). Sebaliknya, penghapusan gen BG berbahaya bagi
produksi selulase pada selulosa N. crassa ( Znameroski dkk., 2012 ) dan T.
520
Bioteknologi Kemajuan 37 (2019) 519–529
reesei ( Zhou et al., 2012 ), meskipun induksi selulase oleh cello- biose ditingkatkan pada strain yang
direkayasa. Menariknya, pengenalan mutasi titik ke BG intraseluler, bukan penghapusannya,
menghasilkan produksi selulase yang lebih tinggi secara signifikan pada selulosa. T. reesei ( Shida
dkk., 2015 ). Secara bersama-sama, modulasi aktivitas BG adalah strategi yang berlaku umum untuk
meningkatkan produksi enzim lignoselulolitik, meskipun metode manipulasi yang efektif
(penghapusan atau mutasi titik) berbeda antar spesies jamur.
Kontrol transkripsi dari gen enzim lignoselulolitik melibatkan aksi kombinatorial dari beberapa
aktivator dan penekan transkripsi. Keberadaan dan fungsi pengatur ini sebagian dikonservasi pada
jamur ascomycete (lihat tinjauan rinci oleh Benocci dkk. (2017) ). Pengaktifan transkripsi berlebih dan
gangguan penekan telah dilakukan untuk meningkatkan transkripsi gen enzim lignoselulolitik dan
tingkat produksi enzim berikutnya pada beberapa spesies jamur ( Li et al., 2015 ; Sun and Glass, 2011 ;
Wang et al., 2015b ; Wang et al., 2013 ). Faktor transkripsi yang dipilih sebagai target yang efisien
untuk meningkatkan produksi enzim lignoselulolitik di T. reesei, P. oxalicum dan M. thermophila terdaftar
di Gambar 2 (proses b). Secara mencolok, ekspresi XYR1 berlebih (aktivator transkripsi utama dari
(hemi) selulase) di T. reesei menyebabkan produksi selulase pada glukosa dan gliserol ke tingkat
yang mirip dengan pada selulosa ( Lv dkk., 2015 ). Hasil serupa dilaporkan di N. crassa, di mana
ekspresi konstitutif CLR-2 (aktivator transkripsi utama selulase) menghasilkan produksi selulase pada
sukrosa ( Coradetti dkk., 2013 ). Efek terakhir signifikan untuk produksi selulase industri, karena
glukosa dan sukrosa lebih mudah untuk pencampuran, pengumpanan dan operasi penyaringan
daripada bahan selulosa yang tidak larut. Sayangnya, produksi selulase bergantung pada induser
yang dipicu oleh ekspresi berlebih dari regulator transkripsi, bagaimanapun, tidak tercapai Aspergillus
nidulans
( Coradetti dkk., 2013 ) dan P. oxalicum ( Li et al., 2015 ).
Rekayasa aktivitas faktor transkripsi, selain kelimpahannya, merupakan strategi efektif lain untuk
meningkatkan ekspresi gen enzim lignoselulolitik. Mutasi titik atau pemotongan terminal-C
G. Liu, Y. Qu Bioteknologi Kemajuan 37 (2019) 519–529

Gambar 2. Proses seluler sebagai target rekayasa untuk meningkatkan produksi enzim lignoselulolitik. BG, β-glukosidase; TR, penekan transkripsi; TA, aktivator transkripsi; AA, aktivator transkripsi buatan;
LCE, enzim lignoselulolitik. Contoh gen target yang efektif untuk rekayasa tiga jamur lignoselulolitik ditunjukkan di sisi kanan.

urutan XYR1 (ortolog bernama XlnR di Aspergilli) dilaporkan memungkinkan tidak hanya peningkatan oxalicum ( Li et al., 2016 ). Untuk tujuan aplikasi, ekspresi berlebih
ekspresi di bawah kondisi induksi tetapi juga ekspresi gen target yang tidak tergantung induser ( Derntl lae1 secara signifikan meningkatkan produksi selulase di T. reesei ( Seiboth dkk., 2012 ), sedangkan
et al., 2013 ; efeknya dapat diabaikan di P. oxalicum ( data yang tidak dipublikasikan). Menariknya, produksi
Hasper et al., 2004 ). Pengenalan mutasi homolog menghasilkan peningkatan serupa pada N. crassa ( Craigβ-xylosidase secara luar biasa ditingkatkan saat digabungkan lae1 penghapusan dan ekspresi
dkk., 2015 ) dan P. oxalicum berlebih dari xlnR di
( Gao et al., 2017a ). Untuk penekan selulase CRE1 yang dikonservasi, mutan yang dipotong dengan asam P. oxalicum ( Li et al., 2016 ). Selain itu, ekspresi berlebih dari hepA memasukkan protein
amino 95 dengan kemampuan pengikatan DNA yang dipertahankan lebih bermanfaat untuk ekspresi heterokromatin 1 menyebabkan peningkatan produksi selase yang luar biasa di P. oxalicum, meskipun
selulase daripada penghapusan penuh cre1 ( Mello-De- Sousa dkk., 2014 ). mekanismenya masih belum diketahui ( Zhang et al., 2016d ).

Selain mutan sekuens dari regulator transkripsi, aktivator transkripsi buatan dengan arsitektur
rekayasa domain fungsional dirancang atau disaring dari perpustakaan untuk meningkatkan ekspresi
2.2. Modifikasi jalur sekretori dan degradasi protein
enzim lignoselulolitik ( Gambar 2 , proses b). Regulator kimia ini dengan kombinasi baru pengikatan
DNA dan domain efektor dapat mengubah regulasi transkripsi gen selulase. Hasilnya, strain yang
Produk terjemahan dari gen enzim lignoselulolitik perlu menjalani pelipatan protein, modifikasi
direkayasa menunjukkan peningkatan produksi selulase dalam kondisi yang menginduksi dan / atau
pasca-translasi, dan perdagangan vesikuler untuk disekresikan ke luar ( Gambar 2 , proses d dan e).
ekspresi selulase yang tidak terkunci pada gula yang tidak menginduksi seperti glukosa dan sukrosa ( Tabel
Meskipun fungsi beberapa komponen dalam jalur sekretori telah dipelajari pada jamur berfilamen ( Kubicek
1 ).
dkk., 2014 ), beberapa di antaranya diidentifikasi sebagai target rekayasa untuk meningkatkan
produksi enzim lignoselulolitik yang mengganggu. Salah satu contoh rekayasa yang berhasil adalah
bahwa kelebihan protein disulfida isomerase PDI2 meningkatkan produksi selobiohidrolase di T.
Faktor remodeling kromatin memiliki peran penting dalam ekspresi gen enzim lignoselulolitik ( Gambar
reesei ( Wang et al., 2015a ). HAC-1, faktor transkripsi utama yang mengendalikan respon protein
2 , proses c). Penghapusan gen pengkodean histone acetyltransferase Gcn5 ( Xin et al., 2013 ) atau
yang tidak terlipat, telah terbukti penting untuk produksi selulase di N. crassa ( Fan dkk., 2015 ; Montenegro-Montero
putatif histone methyltransferase LAE1 ( Seiboth dkk., 2012 ) secara drastis meningkatkan ekspresi
dkk., 2015 ). Baru baru ini
selulase dalam T. reesei. Penghapusan laeA ( ortolog dari

lae1) juga menyebabkan berkurangnya ekspresi selulase dan xilanase di P.

Tabel 1
Aktivator transkripsi buatan untuk meningkatkan produksi enzim lignoselulolitik pada jamur berfilamen.

Spesies jamur Asal domain Prestasi Referensi

Domain pengikat DNA Domain efektor

T. reesei CRE1, ACEI ACEII Peningkatan produksi selulase dan xilanase pada selulosa Peningkatan Su et al., 2009
T. reesei Jari seng buatan Sebuah Saccharomyces cerevisiae Gal4 produksi β-glukosidase pada selulosa Produksi selulase pada glukosa Zhang et al., 2016a Zhang
T. reesei CRE1, XYR1 XYR1 et al., 2017 Zhang et al.,
T. reesei ACEII VP16 Peningkatan produksi selulase pada selulosa Produksi 2018b Zhang et al., 2018b
T. reesei CRE1 VP16 selulase pada glukosa Zhang et al., 2018a Zhang
T. reesei XYR1 VP16 Peningkatan produksi xilanase et al., 2018a Gao et al.,
T. reesei ACE1 VP16 Peningkatan produksi selulase dan xilanase pada selulosa 2017b
P. oxalicum ClrB XlnR A871V Produksi selulase pada xilan; peningkatan produksi selulase pada selulosa

Sebuah Urutan asam amino: QSNI-RSNR-QTHQ-VSNV.

521
G. Liu, Y. Qu Bioteknologi Kemajuan 37 (2019) 519–529

laporan menunjukkan bahwa overekspresi Hac1 (HAC-1 ortholog) dapat secara signifikan
meningkatkan produksi selulase di T. reesei ( Gao dkk., 2018 ). Studi ini juga menemukan bahwa
ekspresi berlebih dari pendamping molekuler penghuni retikulum endoplasma Bip1 juga dapat
meningkatkan produksi selulase dengan T. reesei. Skrining sistematis dari mutan penghapusan gen di
N. crassa mengidentifikasi beberapa faktor negatif dalam sekresi enzim lignoselulolitik, termasuk
faktor transkripsi yang diinduksi stres retikulum endoplasma RES-1 ( Fan dkk., 2015 ) dan subunit
kompleks protein adaptor 3 yang terlibat dalam perdagangan vesikel ( Pei et al., 2015 ). Gangguan
homolog dari res-1 di M. thermophila juga meningkatkan produksi selulase ( Liu dkk., 2017 ).
Meskipun banyak laporan tentang peningkatan ekspresi protein heterolog pada strain yang
kekurangan protease ( Singh dkk., 2015 ;
Visser et al., 2011 ), efek protease pada produksi enzim lignoselulolitik yang kuat jarang dipelajari.
Gangguan
alp-1 pengkodean protease alkali ekstraseluler menyebabkan peningkatan produksi selulase dan
xilanase di M. thermophila ( Liu dkk., 2017 ), yang layak untuk diuji pada jamur lignoselulolitik lainnya ( Gambar
suplementasi LPMOs in vitro, ekspresi gen pengkode LPMO pada jamur penghasil enzim
2 , proses f).
2.3. Manipulasi kombinatorial dari beberapa proses seluler
karboksimetil selulase, selobiohidrolase 1, BG, xilanase dan β-xy- losidase dari produk aslinya ( Chylenski
dkk., 2017 ; Sun et al., 2015 ). Di sini, kami hanya merangkum secara singkat upaya optimasi sistem
enzim lignoselulolitik melalui rekayasa genetika in vivo dari strain penghasil enzim.
Ekspresi berlebih dari BG homolog atau heterolog telah banyak dilaporkan untuk meningkatkan
efisiensi hidrolisis dari campuran selulase dengan menghilangkan penghambatan umpan balik
selobiosa ( Dashtban dan Qin, 2012 ; Ma dkk., 2011 ; Yao dkk., 2016 ). Strategi ini sangat efektif untuk T.
reesei, yang memiliki aktivitas BG asli yang rendah. Juga, kelebihan selobiohidrolase secara
individual, endo- 1,4-β-glukanase, xilanase, β-xilosidase, asetil xilan esterase, endo-β-1,4-mannanase,
dan komponen lain dalam T. reesei, P. oxalicum atau Penicillium verrucu- losum semua preparat
enzim lignoselulolitik yang dihasilkan dengan efisiensi hidrolisis yang lebih tinggi ( Hu et al., 2015b ; Li
et al., 2017 ; Manavalan dkk., 2017 ; Sinitsyn et al., 2014 ; Ye et al., 2017 ). Selain itu, pengenalan
enzim yang dipilih dengan cermat dengan aktivitas spesifik tinggi atau toleransi stres tinggi, baik dari
jamur lain ( Xue dkk., 2016 ) atau bakteri ( Zou dkk., 2012 ), dapat mencapai peningkatan efisiensi
hidrolisis yang lebih tinggi daripada ekspresi enzim homolog. Dibandingkan dengan studi tentang
lignoselulolitik lebih sedikit dilaporkan. Selain ekspresi LPMO di industrinya T. reesei saring oleh
Novozim ( Merino dan Cherry, 2007 ), ekspresi a T. reesei LPMO masuk P. verruculosum juga
memberikan persiapan enzimnya kinerja yang lebih baik dalam degradasi lignoselulosa ( Bulakhov
dkk., 2017 ).

Strategi yang disebutkan di atas untuk meningkatkan produksi enzim lignoselulolitik diharapkan
memiliki efek aditif ketika digabungkan dalam satu regangan. Selain itu, manipulasi regulator yang
terlibat dalam transkripsi gen enzim lignoselulolitik bersifat sinergis mengenai tingkat produksi enzim ( Li
et al., 2015 ). Beberapa strategi teknik yang menargetkan banyak gen dan pencapaiannya dirangkum
dalam Meja 2 .
Idealnya, enzim dengan efek penguat pada konversi lignoselulosa harus diekspresikan pada
tingkat yang sesuai dalam inang jamur berdasarkan studi optimasi in vitro. Namun, sebagian besar
studi di atas hanya menggunakan satu promotor untuk ekspresi berlebih enzim, sedangkan tingkat
ekspresi optimal dari enzim target untuk efisiensi hidrolisis maksimal tidak diselidiki secara rinci.
3. Rekayasa kinerja campuran enzim lignoselulolitik

Ekspresi berlebihan simultan dari beberapa enzim dalam satu strain inang jarang dilaporkan.
Optimasi komposisi sediaan selulase telah menjadi faktor kontribusi utama terhadap penurunan
Ekspresi BG, LPMO dan dua protein lainnya secara efisien meningkatkan kinerja T. reesei enzim ( Merino
biaya enzim untuk degradasi lignoselulosa ( Gambar 1 c) ( Harris et al., 2014 ; Merino dan Cherry, 2007 ;
dan Cherry, 2007 ). Namun demikian, ekspresi simultan dari empat enzim tidak melampaui efek
Sun et al., 2015 ). Optimasi in vitro dari campuran enzim lignoselulolitik, termasuk suplementasi
ekspresi berlebih enzim tunggal dalam P. verruculosum ( Sinitsyn dkk., 2016 ). Dalam studi terakhir,
komponen eksogen ke preparat selulase asli dan rekonstitusi campuran enzim secara de novo, telah
gen promotor selobiohidrolase cbh1 digunakan untuk ekspresi keempat enzim. Sekretom dari
dilakukan secara komprehensif yang ditujukan pada substrat yang berbeda ( Hu et al., 2015a ; Karnaouri
regangan pengekspresian berlebih enzim empat kali lipat memiliki komposisi yang tidak seimbang,
dkk., 2016 ; Du et al., 2018 ). Protein eksogen meningkatkan konversi lignoselulosa melalui
menunjukkan pentingnya menggunakan promotor dengan kekuatan yang sesuai selama optimasi
mekanisme yang berbeda. Secara khusus, lytic poly-saccharide monooxygenases (LPMOs) yang
komposisi enzim in vivo.
memecah selulosa menggunakan mekanisme oksidatif dapat bekerja secara sinergis dengan enzim
selulosa-hidrolitik untuk mendegradasi selulosa ( Eibinger et al., 2014 ; Hemsworth dkk., 2015 ).
Xilanase dapat meningkatkan aksesibilitas selulosa ke selulase ( Hu et al., 2011 ). Beberapa enzim
lain, seperti BG dan α-ga- lactosidase, dapat meringankan penghambatan gula yang berbeda pada
Sementara jamur ascomycete banyak digunakan untuk produksi enzim lignoselulolitik, mereka
selulase ( Kumar dan Wyman, 2014 ). Dengan demikian, preparat selulase generasi baru (misalnya
biasanya tidak memiliki enzim untuk degradasi lignin. Sebaliknya, beberapa jamur basidiomiset dapat
Cellic ® CTec3) dari Novozim mengandung lebih banyak LPMO dan aktivitas yang secara signifikan
mendegradasi atau memodifikasi lignin dengan memproduksi peroksidase dan lakase yang
lebih tinggi (unit per gram dari total protein)
mengandung heme kelas II ( Dashtban et al., 2010 ). Ekspresi berlebihan dari peroksidase manan
endogen dan peroksidase lignin, serta pengenalan peroksidase serba guna heterolog, secara
signifikan meningkatkan tingkat produksi enzim ini di Phanerochaete chrysosporium ( Coconi-

Meja 2
Manipulasi gen kombinatorial untuk meningkatkan produksi enzim lignoselulolitik pada jamur berfilamen.

Spesies jamur Strategi Efek pada produksi selulase Sebuah Referensi

T. reesei Ekspresi berlebih dari xyr1; Down-regulasi dari ace1 b Meningkat 1,35 kali lipat Wang et al., 2013 Ellilä
T. reesei Ekspresi berlebih dari xyr1 V821F dan ace2; Pengenalan Talaromyces emersonii cel3a dan Aspergillus
Produksi protein 34,1 g / L pada molase tanpa penambahan selulosa; et al., 2017
niger suc1 Peningkatan efisiensi hidrolisis
P. oxalicum Ekspresi berlebih dari clrB; Penghapusan creA dan bgl2 Meningkat 27 kali lipat Yao et al., 2015 Gao et
P. oxalicum Ekspresi berlebih dari clrB, xlnR A871V, cbh1–2 dan eg1; Penghapusan creA Meningkat 10,2 kali lipat; Peningkatan proporsi xilanase Produksi selulase al., 2017a
N. crassa Penghapusan gh1–1, gh3–3, gh3–4 dan cre-1 yang lebih tinggi pada selobiosa Znameroski dkk., 2012 Liu dkk.,
M. thermophila Penghapusan gh1–1, cre-1, res-1 dan alp-1 Meningkat 9,1 kali lipat 2017

Sebuah Data aktivitas kertas saring kecuali diklarifikasi secara khusus.

b Strain induk RUT-C30 sudah berisi mutasi terpotong cre1.

522
G. Liu, Y. Qu Bioteknologi Kemajuan 37 (2019) 519–529

Linares dkk., 2014 ). Namun demikian, karena efisiensi manipulasi genetik dari basidiomycetes
umumnya rendah, itu menarik untuk mengekspresikan secara heterogen enzim yang bertindak lignin

Dashtban et al., 2013

Tian dkk., 2016 Zhao

dalam jamur ascomycete. Ekspresi laccase dari Trametes sp. di T. reesei menghasilkan peningkatan

Roche et al., 2014a

Anasontzis et al.,
efisiensi hidrolisis enzim kasar pada sisa tongkol jagung ( Zhang et al., 2012 ). Dalam penelitian lain,

Ali et al., 2013

Lin dkk., 2017

Xu dkk., 2015
lakase diekspresikan ke tingkat yang tinggi

dkk., 2018
Referensi

2016
0,92 g / L masuk T. reesei ( Kiiskinen et al., 2004 ). Setidaknya satu peroksidase mangan dan satu
peroksidase serbaguna diekspresikan secara fungsional
Aspergillus spesies, yang membutuhkan penambahan hemoglobin atau hemin ke kultur ( Casado

Waktu budidaya
López dkk., 2016 ). Sejauh ini, hanya ada sedikit informasi tentang penggunaan gabungan dari enzim

16 hari

11 hari
lignolitik dan selulolitik dalam sakarifikasi bahan lignoselulosa.

139 jam
8 hari

7 hari

8 hari

4 hari

48 jam
0,318 g / g sedotan
4. Rekayasa jamur lignoselulolitik untuk produksi langsung bahan bakar dan bahan kimia

0,945mol / mol
Menghasilkan Sebuah

Tidak dilaporkan

37.9mg / g c

1,02mg / g
0,492 g / g
curah

0,33 g / g

0,30 g / g
Proses bioproses terkonsolidasi, yang menggabungkan produksi enzim, sakarifikasi
lignoselulosa dan fermentasi dalam satu langkah pemrosesan ( Gambar 1 b – d), dianggap sebagai

Tak dapat diterapkan b

strategi potensial untuk konversi ekonomi bahan lignoselulosa. Sementara tantangan ada dalam

13,22 g / L
rekayasa mikroorganisme non-selulolitik (mis Saccharomyces cerevisiae) untuk bioprocessing

5,34 g / L
1,27 g / L
~ 20 g / L

168 g / L
47.4mM

Asam itakonat 20.4mg / L.

terkonsolidasi ( den Haan dkk., 2015 ;

Titer
Yamada dkk., 2013 Jamur lignoselulolitik mempunyai keunggulan kapasitas lignoselulolitik yang kuat

Cellobionate

Asam malat
dan luas serta secara umum kemampuan memanfaatkan pentosa ( Gambar 3 ). Namun, upaya untuk

Produk

Etanol
Etanol

Etanol
Xylitol
menghasilkan bahan bakar dan bahan kimia dengan merekayasa jamur ini juga menghadapi banyak

Lipid
kesulitan, yang pada dasarnya terkait dengan pertumbuhan sel yang lambat dan titer produk yang
rendah ( Ali dkk., 2016 ; Xu dkk., 2009 ) ( Tabel 3 ).

Jerami barley dan xilosa yang telah diolah

Jerami gandum yang diolah dengan alkali

Asam encer diolah sebelumnya

4.1. Asam gula dan alkohol gula

Gula sederhana sebagai produk degradasi lignoselulosa dapat diubah menjadi lakton gula atau

Miscanthus
sebelumnya

alkohol yang sesuai dengan oksidasi / reduksi enzimatik satu langkah. Lakton gula kemudian
Selulosa

Selulosa
Selulosa
Substrat

Glukosa

dihidrolisis secara spontan atau secara enzimatis menjadi asam gula ( Peng et al., 2017 ). Karena itu, Glukosa

Ekspresi transporter C4-dikarboksilat dan rekayasa jalur metabolisme lainnya Ekspresi dekarboksilase asam
Penghapusan β-glukosidase, penekan transkripsi selulase dan fosforilase selobionat; ekspresi laccase

Ekspresi piruvat dekarboksilase dan alkohol dehidrogenase Penghapusan glikogen

Contoh jamur lignoselulolitik rekayasa untuk produksi bahan bakar dan bahan kimia.

Penghapusan xylitol dehydrogenase dan L-arabinitol-4-dehydrogenase

Ekspresi berlebih dari fosfoglukomutase dan transaldolase

Transporter heksosa berlebih

sintase dan asil-KoA sintase

Hasil produk pada substrat total.

Strategi rekayasa

cis-aconitic

Metil ester asam lemak.

Budidaya solid-state.

Gambar 3. Jalur metabolisme untuk produksi bahan bakar dan bahan kimia curah dari lignoselulosa
oleh jamur berfilamen. Produk akhir potensial diberi label merah. Beberapa langkah metabolisme
M. thermophila
Spesies jamur

F. oxysporum
F. oxysporum

ditunjukkan dengan panah putus-putus. (Untuk interpretasi referensi warna dalam legenda gambar
N. crassa

N. crassa

N. crassa
T. reesei

T. reesei
Tabel 3

ini, pembaca merujuk ke versi web artikel ini.)

Sebuah

523
G. Liu, Y. Qu
produk ini memiliki hasil molar teoritis 100%. Memang, rekayasa N. crassa mencapai produksi hasil
tinggi (0,945mol / mol) selobionat dari selulosa ( Lin dkk., 2017 ). Meskipun produsen glukonat terkenal Aspergillus
oryzae memungkinkan produksi asam kojat pada selulosa, tetapi titernya lebih rendah dua kali lipat
niger dilaporkan untuk produksi glukonat titer tinggi dari lignoselulosa hidrolisat ( Zhang et al., 2016e ),
rekayasa jamur selulolitik untuk produksi glukonat langsung dari selulosa mungkin ditantang oleh
penghambatan BG oleh glukono-1,5-lakton dan glukonat ( Peng et al., 2017 ). Melalui ekspresi glukosa
oksidase dan katalase dari A. niger di P. oxalicum,
glukonat dapat diproduksi dari selulosa dengan strategi kontrol suhu dua tahap ( Han et al., 2018 ). Di
sisi lain, xylose reductase dan xylose dehydrogenase serta enzim metabolik hilir telah diidentifikasi
dalam beberapa jamur lignoselulolitik termasuk T. reesei ( Berghall et al., 2007 ; Seiboth dkk., 2007 ),
memberikan dasar untuk produksi xylitol dan xylonate melalui rekayasa metabolik ( Dashtban et al.,
2013 ).
4.2. Etanol
Banyak jamur berfilamen memiliki alkohol dehidrogenase dan dapat menghasilkan etanol dalam
kondisi yang membatasi oksigen ( Skory et al., 1997 ). Namun, tingkat produksi yang rendah dan
periode fermentasi yang lama membuatnya tidak cocok untuk aplikasi industri. Merekayasa
metabolisme karbon pusat Fusarium oxysporum menghasilkan produksi 20 g / L etanol dari glukosa
dengan hasil yang hampir teoritis ( Anasontzis dkk., 2016 ). Meskipun F. oxysporum dapat
mendegradasi lignoselulosa, strain yang direkayasa tidak diuji untuk produksi etanol dari bahan
lignoselulosa. Di T. reesei, enzim penghasil etanol yang berlebih dari S. cerevisiae hanya sedikit
meningkatkan titer etanol ( Xu dkk., 2015 ), menunjukkan jaringan metabolisme mungkin lebih
kompleks dari yang diharapkan. N. crassa juga dipelajari dalam banyak kasus untuk produksi
langsung etanol dari lignoselulosa dengan titer dan hasil yang relatif tinggi (lihat ulasan Dogaris dkk.,
2013 ). Namun, rekayasa metabolik belum dilaporkan untuk meningkatkan produksi etanol, sejauh
pengetahuan terbaik kami, di N. crassa, terlepas dari akumulasi pengetahuan tentang pemanfaatan
lignoselulosa dan fisiologi metabolik ( Zhang et al., 2008 ) serta kotak alat manipulasi genetik yang
berkembang dengan baik pada jamur ini. Rekayasa metabolik sistem mengenai efisiensi
lignoselulolitik, distribusi fluks karbon dan toleransi etanol diharapkan dapat dilakukan untuk
meningkatkan konversi lignoselulosa menjadi etanol dengan N. crassa.
4.3. Lipid
Beberapa jamur lignoselulolitik seperti T. reesei dapat mengakumulasi lipid lebih dari 15% berat
kering sel dalam kondisi yang sesuai ( Brown et al., 1990 ). Gangguan biosintesis glikogen sebagai
jalur persaingan dan / atau sintetase asil-KoA lemak untuk penurunan asam lemak di N. crassa menyebabkan
2016b ). Titik terang dari karya terakhir adalah ekspresi fungsional bagian standar dalam biologi
peningkatan 1,35 kali lipat produksi lipid pada perlakuan awal Miscanthus ( Roche et al., 2014a ).
Kandungan lipid pada strain yang direkayasa (~ 3 sampai 4% dari berat kering sel) masih jauh lebih
rendah dibandingkan pada jamur oleaginous seperti Yarrowia lipolytica ( hingga 90% konten lipid).
Strategi rekayasa metabolik yang digunakan dalam ragi, seperti meningkatkan pasokan prekursor
asetil-KoA dan NADPH, meningkatkan aktivitas diasilgliserol asiltransferase, dan melemahnya
biogenesis peroksisom ( Blazeck dkk., 2014 ; Friedlander dkk., 2016 ) dapat meningkatkan produksi
lipid pada jamur berserabut. Selain itu, akumulasi lipid lebih disukai dalam medium glukosa tinggi ( Blazeck
dkk., 2014 ), yang merupakan tantangan untuk pelepasan glukosa yang umumnya lambat selama
degradasi lignoselulosa.
4.4. Asam karboksilat dari metabolisme pusat
Aspergillus spesies digunakan untuk produksi asam organik seperti asam sitrat dan asam
itakonat di industri ( Yang dkk., 2017 ). Namun, kapasitas lignoselulolitiknya yang rendah tidak dapat
mendukung tingkat tinggi
524
Bioteknologi Kemajuan 37 (2019) 519–529
produksi asam organik ini langsung dari lignoselulosa. Ekspresi tiga selulase heterolog di Aspergillus
dibandingkan pada glukosa dan pati ( Yamada dkk., 2014 ), menunjukkan aktivitas selulase perlu
ditingkatkan lebih lanjut. Siklus asam tri-karboksilat diidentifikasi sebagai nasib utama piruvat di T.
reesei terlepas dari konsentrasi glukosa dalam medium ( Chambergo et al., 2002 ; Jouhten et al., 2009 ),
sehingga lebih praktis untuk merekayasa organisme ini untuk produksi asam karboksilat daripada
etanol. Secara mencolok, melalui rekayasa metabolik M. thermophila, kadar asam malat yang tinggi
dapat langsung diproduksi dari bahan selulosa (168 g / L dari selulosa kristal dan 95 g / L dari jerami
jagung) ( Tian dkk., 2016 ). Laporan ini membuktikan bahwa sangat mungkin untuk memproduksi
bahan kimia curah langsung dari lignoselulosa oleh jamur di industri.
5. Alat untuk rekayasa jamur lignoselulolitik
Alat manipulasi genetik yang efisien sangat penting untuk rekayasa produksi enzim dan jalur
metabolisme pada jamur lignoselulolitik. Metode transformasi DNA yang umum digunakan, pembuat
seleksi dan promotor, dan strategi untuk ekspresi protein heterolog dalam jamur berfilamen telah
ditinjau secara komprehensif ( Singh dkk., 2015 ; Su et al., 2012 ). Oleh karena itu, kami hanya akan
fokus pada perkakas yang baru-baru ini dikembangkan di area ini.
5.1. Kontrol yang tepat dari ekspresi gen
Promotor gen dalam metabolisme karbon pusat (misalnya gliserol-aldehid-3-fosfat
dehidrogenase) dan sintesis protein (misalnya faktor perpanjangan translasi) telah banyak digunakan
untuk ekspresi konstan dari enzim lignoselulolitik dan faktor transkripsi terkait dalam jamur ( Linger et
al., 2015 ; Yao dkk., 2016 ). Di sisi lain, asli atau dimodifikasi secara rasional ( Liu et al., 2008 ; Zou
dkk., 2012 ) promotor dari gen pengkode selulase (hemi) digunakan untuk ekspresi gen yang tidak
dapat dideduksi dalam media lignoselulosa. Para promotor ini dengan kekuatan pendorong yang
berbeda ( Wang dkk., 2014 ) adalah alat yang berharga untuk produksi in vivo dari campuran enzim
lignoselulolitik dari komposisi yang diinginkan.
Modulasi transkripsi dinamis efisien untuk kontrol ekspresi gen buatan dan menentukan tingkat
ekspresi optimal dari gen target. Promotor ditekan oleh tembaga ( Lv dkk., 2015 ) atau L- metionin ( Bischof
dkk., 2015 ) diidentifikasi dan digunakan untuk ekspresi merdu dari enzim dan regulator transkripsi T.
reesei. Secara acak, promotor dalam menanggapi cahaya, sumber tembaga dan nitrogen digunakan
untuk mengatur ekspresi gen di N. crassa ( Hurley dkk., 2012 ; Ouyang dkk., 2015 ). Sistem rumit lain
untuk ekspresi gen merdu di T. reesei mengandung faktor transkripsi sintetik dan promotor, yang
memungkinkan pengaktifan dan penonaktifan ekspresi gen yang diinduksi cahaya ( Zhang dkk.,
sintetik (domain pengikatan Gal4, Nls-LacI dan VP16) pada jamur berserabut. Diharapkan bahwa
lebih banyak perangkat pengaturan transkripsi dalam menanggapi sinyal praktis dalam fermentasi
industri akan dikembangkan dalam jamur berfilamen.
Pendekatan lain untuk penurunan regulasi gen target pada jamur berfilamen adalah
pembungkaman RNA ( Armas-Tizapantzi dan Montiel-González, 2016 ). RNA jepit rambut ( Nakayashiki
dkk., 2005 ), dan dengan lebih sedikit laporan untuk RNA untai ganda tanpa jepit rambut ( Dia dkk.,
2015 ) dan antisense RNA ( Wang et al., 2005 ), berhasil digunakan untuk knock-down gen pada jamur
lignoselulolitik. Menggunakan promotor yang dikontrol tembaga, sistem interferensi RNA untuk
pembungkaman balik gen target dibuat di T. reesei ( Wang dkk., 2018 ). Meskipun efisien dalam
menekan produksi selulase endogen ( Brody dan Maiyuran, 2009 ; Qin dkk., 2012 ), Pembungkaman
RNA jarang digunakan dalam rekayasa regangan untuk meningkatkan efisiensi lignoselulolitik jamur.
G. Liu, Y. Qu
Gambar 4. Diagram skematis dari empat pendekatan untuk memperkenalkan dua gen menggunakan satu penanda yang dapat dipilih pada jamur berserabut. Promotor dan terminator untuk mengontrol ekspresi gen tidak ditampilkan.
5.2. Manipulasi genetik dari banyak gen
Rekayasa sistematis jamur berfilamen melalui manipulasi beberapa gen telah sangat dibatasi
oleh efisiensi rendah transformasi dan rekombinasi homolog, dan kurangnya cukup penanda yang
dapat dipilih. Untuk mengatasi keterbatasan ini, sistem CRISPR / Cas9 (lihat sub-bagian 5.3) dan
solusi berikut telah dikembangkan pada jamur lignoselulolitik:
5.2.1. Memaksimalkan jumlah penanda yang dapat dipilih yang tersedia
Selain marker dominan yang umum digunakan, berbagai strain aux- otrophic telah dibuat di T.
reesei ( Derntl dkk., 2015 ;
Zhang et al., 2010 ). Dengan bantuan Cre / loxP atau β-rec / enam sistem pemotongan sendiri, daur
ulang penanda yang dapat dipilih (terutama yang dapat dipilih secara dua arah seperti pyrG dan amdS)
dicapai pada banyak jamur lignoselulolitik ( Jiang dkk., 2016 ; Steiger dkk., 2011 ; Szewczyk dkk., 2014 ),
yang memungkinkan beberapa putaran manipulasi genetik menggunakan penanda yang dapat dipilih
yang sama ( Gambar 4 Sebuah).
5.2.2. Pembastaran
Metode persilangan seksual telah diterapkan dengan baik N.
crassa, yang efisien untuk pembangunan beberapa galur penghapusan gen berdasarkan pustaka
galur knock-out gen tunggal yang tersedia di kedua jenis kawin ( Dunlap dkk., 2007 ) ( Gambar 4 b).
Misalnya, a N. crassa mutan dengan penghapusan enam gen β-glukosidase dibangun melalui
pendekatan ini tanpa memperkenalkan penanda tambahan yang dapat dipilih ( Fan dkk., 2012 ).
Sistem persilangan seksual juga didirikan di T. reesei ( Schuster et al., 2012 ), sementara belum
dikembangkan di banyak jamur lignoselulolitik lainnya.
5.2.3. Perakitan fragmen DNA besar
Konstruksi fragmen besar yang berisi beberapa kaset ekspresi gen tidak hanya mampu
menyimpan penanda yang dapat dipilih tetapi juga menguntungkan untuk rekayasa modularitas
proses seluler ( Qi et al., 2015 ). Dengan perkembangan pesat metode perakitan DNA ( Juhas dan
Ajioka,
525
Bioteknologi Kemajuan 37 (2019) 519–529
2017 ), dimungkinkan untuk secara bersamaan mengekspresikan beberapa gen target melalui
transformasi satu langkah jamur lignoselulolitik ( Gambar 4 c). SEBUAH
Fragmen 14.1-kb berisi empat kaset ekspresi gen yang dibuat Escherichia coli mampu meningkatkan
produksi enzim lignoselulolitik ketika diubah menjadi P. oxalicum ( Gao et al., 2017a ). Selain itu,
sistem ekspresi polikistronik berbasis peptida 2A terbukti layak digunakan T. reesei ( Subramanian et
al., 2017 ), yang dapat memperkecil ukuran fragmen DNA multi-gen.
5.3. Pengeditan gen yang ditargetkan
Sistem CRISPR / Cas9 sebagai alat pengeditan genom yang kuat telah berhasil dikembangkan
pada banyak spesies jamur lignoselulolitik termasuk T. reesei, N. crassa dan M. thermophila ( lihat
review terbaru
Krappmann, 2017 ). Gangguan yang efisien, penggantian atau integrasi sekuens DNA tercapai,
dengan hasil yang paling mencolok bahwa banyak gen dapat diedit secara bersamaan ( Liu dkk.,
2015 ) ( Gambar 4 d) dan lengan homologi yang sangat pendek sudah cukup untuk kombinasi ulang
homolog ( Zhang dkk., 2016c ). Sistem telah digunakan untuk meningkatkan produksi enzim
lignoselulolitik di N. crassa
( Matsu-Ura dkk., 2015 ) dan M. thermophila ( Liu dkk., 2017 ) melalui manipulasi gen regulator terkait.
Dapat diantisipasi bahwa pembungkaman berbasis CRISPR / (d) Cas9 dan aktivasi ekspresi gen ( Hsu
dkk., 2014 ) dan integrasi multi-salinan bagian DNA ( Shi dkk., 2016 ) akan diadaptasi dalam jamur
berserabut dalam waktu dekat. Selain itu, rekombinasi homolog yang tepat dimediasi oleh I- Sce Saya
endonuclease dilaporkan di T. reesei ( Ouedraogo dkk., 2016 ), yang cocok untuk menyelidiki fungsi
gen dengan menghilangkan efek insersi ektopik.
5.4. Skrining fenotipe throughput tinggi
Metode yang saat ini digunakan untuk mengevaluasi strain jamur terutama didasarkan pada labu
goyang, pelat Petri, dan pelat mikro, yang memakan waktu dan tenaga. Meskipun fluoresensi
mengaktifkan penyortiran sel
G. Liu, Y. Qu
(FACS) telah banyak digunakan untuk penyaringan throughput tinggi dari bakteri dan sel ragi,
aplikasinya dalam studi jamur berfilamen terhalang oleh struktur hifa mereka. FACS telah dicapai di T.
reesei
dengan menggunakan spora berkecambah dan digunakan untuk penyaringan selulase mutan
penghasil tinggi ( Throndset dkk., 2010 ). Melalui tampilan permukaan sel dari protein fluoresensi
merah, T. reesei strain dengan kapasitas sekresi protein yang ditingkatkan dapat diisolasi dengan
FACS ( Gao dkk., 2018 ). Sebagai alternatif, sel jamur berserabut dapat dianalisis dengan FACS
melalui pembudidayaan spora dalam mikro-partikel alginat monodisperse ( Delgado-Ramos dkk.,
2014 ). Metode mikroenkapsulasi ini diharapkan dapat diadaptasi untuk penapisan tingkat sekresi
selulase dengan memasukkan substrat fluorogenik ke dalam kapsul ( Huang et al., 2015 ).
6. Perspektif masa depan
6.1. Pemahaman yang lebih dalam tentang biokonversi lignoselulosa
Pengetahuan kita tentang proses seluler yang terlibat dalam konversi lignoselulosa oleh jamur
masih sangat terbatas. Bagaimana sinyal selulosa memicu ekspresi gen selulase? Apa mekanisme
molekuler untuk transkripsi yang diatur ke bawah dari gen penyandi protein yang disekresikan pada
tekanan retikulum endoplasma ( Pakula dkk., 2003 )? Tahapan manakah dalam jalur sekretori yang
membatasi laju produksi enzim? Penjelasan proses fundamental ini akan memberikan kandidat target
rekayasa untuk meningkatkan produksi enzim lignoselulolitik. Selain itu, meskipun model
metabolisme seluruh genom telah dibangun kembali pada beberapa jamur lignoselulolitik, misalnya T.
reesei ( Castillo dkk., 2016 ), sebagai dasar untuk rekayasa metabolik, studi eksperimental perlu
dilakukan untuk mengkarakterisasi fungsi nyata dari enzim metabolik yang diprediksi dan untuk
memahami distribusi dan regulasi fluks metabolik.
6.2. Mengisi kesenjangan antara akuisisi pengetahuan dan rekayasa regangan
Saat ini rekayasa jamur lignoselulolitik telah secara serius berada di belakang studi fundamental
terkait. Misalnya, setidaknya sepuluh faktor transkripsi diketahui mempengaruhi transkripsi gen enzim
lignoselulolitik di T. reesei ( Gambar 2 ) ( Benocci dkk., 2017 ;
Kubicek, 2013 ) sebagaimana dibuktikan dengan gangguan gen tunggal, tetapi pengeditan sistem
multipleks dari regulator ini belum dilaporkan. Juga, meskipun sering dilaporkan optimasi in vitro dari
preparasi selulase terhadap bahan lignoselulosa yang berbeda (terutama oleh laboratorium teknik
kimia), produksi campuran enzim yang ditingkatkan ini dalam satu regangan untuk pengurangan
biaya ( Merino dan Cherry, 2007 ) kurang dieksplorasi. Kami percaya bahwa celah translasi tersebut
sebagian besar disebabkan oleh kesulitan teknis dalam modifikasi genetik multipel jamur berfilamen.
Dengan terbukanya sistem CRISPR / Cas9 pada beberapa spesies jamur telah membuka pintu untuk
masalah ini, rekayasa sistem jamur lignoselulolitik diharapkan dapat menjadi kenyataan di
tahun-tahun mendatang. Tentunya, upaya tersebut membutuhkan integrasi ilmu dan alat yang efisien
dalam beberapa disiplin ilmu penelitian seperti genetika, mikologi, biokimia dan teknik kimia.
6.3. Pemasangan teknik regangan ke dalam desain proses industri
Kesenjangan lain dalam penelitian biokonversi lignoselulosa, seperti yang dikemukakan oleh Druzhinina
dan Kubicek (2017) , terletak di antara teknik regangan di laboratorium dan aplikasi industri. Proses
sakarifikasi lignoselulosa hulu dan hilir, termasuk pretreatment substrat, produksi enzim dan
fermentasi gula, bervariasi antara rute teknis yang berbeda, yang membutuhkan strain jamur yang
disesuaikan untuk produksi enzim (diringkas dalam Gambar 1 ). Misalnya, selulosa mikrokristalin
sebagai sumber karbon yang mahal banyak digunakan untuk mengevaluasi produktivitas galur di
laboratorium, tetapi tidak cocok untuk produksi selulase skala industri. Menggunakan
526
Bioteknologi Kemajuan 37 (2019) 519–529
molase tebu sebagai sumber karbon untuk produksi selulase, pengenalan invertase heterolog
diperlukan dalam T. reesei ( Ellilä dkk., 2017 ). Contoh lain adalah bahwa kami menemukan sediaan
selulase dengan efisiensi sakarifikasi yang berbeda dapat memiliki kinerja yang serupa ketika
digunakan dalam sakarifikasi dan fermentasi simultan untuk produksi etanol (data tidak
dipublikasikan), yang menunjukkan bahwa enzim perlu dievaluasi dalam konteks praktis.
7. Kesimpulan
Rekayasa genetika rasional telah memberikan kontribusi besar untuk meningkatkan tingkat
produksi dan efisiensi penurunan enzim lignoselulolitik dalam jamur berfilamen. Selain itu, rekayasa
metabolisme beberapa jamur lignoselulolitik menyarankan potensi untuk menggunakan organisme ini
untuk menghasilkan bahan kimia massal langsung dari bahan lignoselulosa. Di masa depan,
klarifikasi mekanisme kunci untuk produksi enzim tingkat tinggi, pengembangan sistem enzim yang
sangat efisien untuk degradasi substrat, dan pemahaman yang mendalam tentang jaringan
metabolisme, diharapkan dapat memberikan target baru untuk rekayasa lebih lanjut jamur
lignoselulolitik. Untuk mencapai rekayasa genetika sistem, alat canggih (terutama untuk pengeditan
gen multipleks dan penyempurnaan ekspresi gen) perlu lebih dioptimalkan dalam jamur
lignoselulolitik.
Ucapan Terima Kasih
Kami berterima kasih atas hibah dari National Natural Science Foundation of China (hibah no.
31700062) dan Program Beasiswa Muda Universitas Shandong (YSPSDU, untuk GL).
Referensi
Ali, SS, Nugent, B., Mullins, E., Doohan, FM, 2013. Wawasan dari jamur Fusarium
oxysporum.dll menunjuk pengangkut glukosa berafinitas tinggi sebagai target untuk meningkatkan produksi etanol dari
lignoselulosa. PLoS One 8 (1), e54701 .
Ali, SS, Nugent, B., Mullins, E., Doohan, FM, 2016. Konsolidasi dengan mediasi jamur
bioprocessing: potensi Fusarium oxysporum untuk industri etanol lignoselulosa. AMB Express 6 (1), 13 .
Anasontzis, GE, Kourtoglou, E., Villas-Boas, SG, Hatzinikolaou, DG, Christakopoulos,
P., 2016. Rekayasa Metabolik Fusarium oxysporum untuk meningkatkan kemampuan produksi etanolnya.
Depan. Mikrobiol. 7, 632 .
Armas-Tizapantzi, A., Montiel-González, AM, 2016. RNAi silencing: alat untuk fungsional
penelitian genomik tentang jamur. Berbagai jamur. Wahyu 30 (3), 91–100 .
Balan, V., 2014. Tantangan saat ini dalam memproduksi biofuel secara komersial dari lig-
biomassa noselulosa. ISRN Biotechnol. 2014, 463074 .
Barta, Z., Kovacs, K., Reczey, K., Zacchi, G., 2010. Desain proses dan ekonomi di tempat
produksi selulase pada berbagai sumber karbon di pabrik etanol berbasis kayu lunak. Res enzim. 2010,
734182 .
Benocci, T., Aguilar-Pontes, MV, Zhou, M., Seiboth, B., de Vries, RP, 2017. Regulator
degradasi biomassa tanaman pada jamur ascomycetous. Biotechnol. Bahan bakar nabati 10, 152 .
Berghall, S., Hilditch, S., Penttila, M., Richard, P., 2007. Identifikasi dalam cetakan
Hypocrea jecorina dari gen yang mengkodekan NADP (+): D-xylose dehydrogenase. FEMS Microbiol. Lett. 277
(2), 249–253 .
Berlin, A., 2013. Tidak ada hambatan untuk pemecahan selulosa. Sains 342 (6165), 1454–1456 .
Bischof, RH, Horejs, J., Metz, B., Gamauf, C., Kubicek, CP, Seiboth, B., 2015. L-
Promotor metionin yang dapat ditekan untuk ekspresi gen yang dapat disesuaikan dalam Trichoderma reesei.
Mikrob. Pabrik Sel 14, 120 .
Bischof, RH, Ramoni, J., Seiboth, B., 2016. Cellulases dan seterusnya: 70 tahun pertama
penghasil enzim Trichoderma reesei. Mikrob. Pabrik Sel 15 (1), 106 .
Blazeck, J., Hill, A., Liu, L., Knight, R., Miller, J., Pan, A., Otoupal, P., Alper, HS, 2014.
Memanfaatkan Yarrowia lipolytica lipogenesis untuk menciptakan landasan produksi lipid dan biofuel. Nat.
Komun. 5, 3131 .
Brody, H., Maiyuran, S., 2009. Pembungkaman gen yang dimediasi RNAi dari gen yang sangat diekspresikan di
jamur industri Trichoderma reesei dan Aspergillus niger. Ind. Biotechnol. 5 (1), 53–60 .
Brown, DE, Hasan, M., Lepe-Casillas, M., Thornton, AJ, 1990. Pengaruh suhu dan
pH pada akumulasi lipid sebesar Trichoderma reesei. Appl. Mikrobiol. Biotechnol. 34 (3), 335–339 .
Bulakhov, AG, Volkov, PV, Rozhkova, AM, Gusakov, AV, Nemashkalov, VA,
Satrutdinov, AD, Sinitsyn, AP, 2017. Menggunakan promotor yang dapat diinduksi dari pengkodean gen Penicillium
verruculosum glukoamilase untuk produksi sediaan enzim dengan kinerja selulase yang ditingkatkan. PLoS One
12 (1), e0170404 .
Casado López, S., Sietiö, O.-M., Hildén, K., de Vries, RP, Mäkelä, MR, 2016.
Ekspresi homolog dan heterolog gen basidiomycete terkait dengan degradasi biomassa tanaman. Dalam:
Schmoll, M., Dattenböck, C. (Eds.), Sistem Ekspresi Gen dalam Jamur: Kemajuan dan Aplikasi. Penerbitan
Internasional Springer,
G. Liu, Y. Qu
Cham, hlm. 119–160 .
Castillo, S., Barth, D., Arvas, M., Pakula, TM, Pitkanen, E., Blomberg, P., Seppanen-
Laakso, T., Nygren, H., Sivasiddarthan, D., Penttila, M., Oja, M., 2016. Model metabolisme genom utuh Trichoderma
reesei dibangun dengan rekonstruksi komparatif. Biotechnol. Bahan bakar nabati 9, 252 .
Chambergo, FS, Bonaccorsi, ED, Ferreira, AJ, Ramos, AS, Ferreira Junior, JR,
Abrahao-Neto, J., Farah, JP, El-Dorry, H., 2002. Penjelasan nasib metabolisme glukosa dalam jamur berfilamen Trichoderma Biotechnol. 29 (9), 419–425 .
reesei menggunakan analisis tag urutan yang diekspresikan (EST) dan mikroarray cDNA. J. Biol. Chem. 277
(16), 13983–13988 .
Chen, M., Qin, Y., Cao, Q., Liu, G., Li, J., Li, Z., Zhao, J., Qu, Y., 2013. Promosi
produksi enzim lignoselulolitik ekstraseluler dengan menahan β-glukosidase intraseluler di Penicillium
decumbens. Bioresour. Technol. 137, 33–40 .
Chylenski, P., Petrovic, DM, Muller, G., Dahlstrom, M., Bengtsson, O., Lersch, M., Siika-
Aho, M., Horn, SJ, Eijsink, VGH, 2017. Degradasi enzimatis dari kayu lunak pulp sulfit dan peran LPMO.
Biotechnol. Biofuel 10, 177 .
Coconi-Linares, N., Magana-Ortiz, D., Guzman-Ortiz, DA, Fernandez, F., Loske, AM,
Gomez-Lim, MA, 2014. Produksi mangan peroksidase, lignin peroksidase, dan peroksidase serbaguna dalam Phanerochaete jamur selulolitik Trichoderma reesei. J. Microbiol. Metode 108, 70–73 .
chrysosporium. Appl. Mikrobiol. Biotechnol. 98 (22), 9283–9294 .
Coradetti, ST, Xiong, Y., Glass, NL, 2013. Analisis transkrip selulase yang dilestarikan
regulator nasional menunjukkan produksi enzim selulolitik yang tidak bergantung pada induser dalam
Neurospora crassa. Mikrobiologi terbuka 2 (4), 595-609 .
Craig, JP, Coradetti, ST, Starr, TL, Glass, NL, 2015. Jaringan target langsung dari
Neurospora crassa regulator dekonstruksi dinding sel tanaman CLR-1, CLR-2, dan XLR-1. MBio 6 (5)
(e01452–01415) .
Dashtban, M., Qin, W., 2012. Ekspresi berlebih dari β-glukosidase termotoleran eksotis di
Trichoderma reesei dan peningkatan yang signifikan dalam aktivitas selulolitik dan sakarifikasi jerami barley.
Mikrob. Pabrik Sel 11, 63 .
Dashtban, M., Schraft, H., Syed, TA, Qin, W., 2010. Biodegradasi jamur dan enzy-
modifikasi matic dari lignin. Int. J. Biochem. Mol. Biol. 1 (1), 36–50 .
Dashtban, M., Kepka, G., Seiboth, B., Qin, W., 2013. Produksi Xylitol secara genetik
direkayasa Trichoderma reesei strain menggunakan jerami barley sebagai bahan baku. Appl. Biochem. Biotechnol. 169 (2),
554–569 .
Delgado-Ramos, L., Marcos, AT, Ramos-Guelfo, MS, Sanchez-Barrionuevo, L., Smet, F.,
Chavez, S., Canovas, D., 2014. Flow cytometry dari koloni mikroenkapsulasi untuk analisis genetika jamur
berfilamen. G3 (Bethesda) 4 (11), 2271–2278 .
den Haan, R., van Rensburg, E., Rose, SH, Gorgens, JF, van Zyl, WH, 2015. Kemajuan
dan tantangan dalam rekayasa mikroorganisme non-selulolitik untuk bioproses terkonsolidasi. Curr. Opin.
Biotechnol. 33, 32–38 .
Derntl, C., Gudynaite-Savitch, L., Calixte, S., White, T., Mach, RL, Mach-Aigner, AR,
2013. Mutasi pengatur Xilanase 1 menyebabkan fenotipe pengekspresian glukosa buta hidrolase dalam
industri Trichoderma strain. Biotechnol. Biofuel 6 (1), 62 .
Derntl, C., Kiesenhofer, DP, Mach, RL, Mach-Aigner, AR, 2015. Strategi baru untuk
manipulasi genom Trichoderma reesei dengan tujuan rekayasa regangan. Appl. Mengepung. Mikrobiol. 81 (18),
6314–6323 .
Dogaris, I., Mamma, D., Kekos, D., 2013. Produksi bioteknologi etanol dari
sumber daya terbarukan oleh Neurospora crassa: alternatif untuk fermentasi ragi konvensional? Appl.
Mikrobiol. Biotechnol. 97 (4), 1457–1473 .
Druzhinina, IS, Kubicek, CP, 2017. Rekayasa genetika Trichoderma reesei selulase
dan produksinya. Mikrob. Biotechnol. 10 (6), 1485–1499 .
Du, J., Song, W., Zhang, X., Zhao, J., Liu, G., Qu, Y., 2018. Penguatan diferensial dari
hidrolisis enzimatis dengan menambahkan bahan kimia dan protein aksesori ke substrat muatan padat tinggi
dengan perlakuan awal yang berbeda. Bioproses Biosyst. Eng. 41 (8), 1153–1163 .
Dunlap, JC, Borkovich, KA, Henn, MR, Turner, GE, Sachs, MS, Kaca, NL,
McCluskey, K., Plamann, M., Galagan, JE, Birren, BW, Weiss, RL, Townsend, JP, Loros, JJ, Nelson, MA,
Lambreghts, R., Colot, HV, Park, G., Collopy, P., Ringelberg, C., Crew, C., Litvinkova, L., Decaprio, D., Hood,
HM, Curilla, S., Shi, M., Crawford, M., Koerhsen, M., Montgomery, P ., Larson, L., Pearson, M., Kasuga, T., Tian,
C., Basturkmen, M., Altamirano, L., Xu, J., 2007. Adv. Genet. 57, 49–96 Memungkinkan komunitas untuk
membedah organisme: gambaran umum dari Neurospora proyek genomik fungsional .
Eibinger, M., Ganner, T., Bubner, P., Rosker, S., Kracher, D., Haltrich, D., Ludwig, R.,
Plank, H., Nidetzky, B., 2014. Degradasi permukaan selulosa oleh litik polisakarida monooksigenase dan
pengaruhnya terhadap efisiensi hidrolitik selulase. J. Biol. Chem. 289 (52), 35929–35938 .
Ellilä, S., Fonseca, L., Uchima, C., Cota, J., Goldman, GH, Saloheimo, M., Sacon, V.,
Siika-Aho, M., 2017. Pengembangan proses produksi selulase dengan biaya rendah menggunakan
Trichoderma reesei untuk biorefineries Brasil. Biotechnol. Bahan bakar nabati 10, 30 .
Fan, Z., Wu, W., Hildebrand, A., Kasuga, T., Zhang, R., Xiong, X., 2012. Sebuah novel bio-
rute kimia untuk bahan bakar dan produksi bahan kimia dari biomassa selulosa. PLoS One 7 (2), e31693 .
Fan, F., Ma, G., Li, J., Liu, Q., Benz, JP, Tian, C., Ma, Y., 2015. Analisis seluruh genom dari
respon stres retikulum endoplasma selama produksi lignoselulase di
Neurospora crassa. Biotechnol. Biofuel 8, 66 .
Friedlander, J., Tsakraklides, V., Kamineni, A., Greenhagen, EH, Consiglio, AL,
MacEwen, K., Crabtree, DV, Afshar, J., Nugent, RL, Hamilton, MA, Joe Shaw, A., South, CR, Stephanopoulos,
G., Brevnova, EE, 2016. Teknik produksi lipid tinggi Yarrowia lipolytica regangan. Biotechnol. Bahan bakar nabati
9, 77 .
Gao, L., Li, Z., Xia, C., Qu, Y., Liu, M., Yang, P., Yu, L., Song, X., 2017a. Menggabungkan
manipulasi faktor transkripsi dan ekspresi berlebih dari gen target untuk meningkatkan produksi enzim
lignoselulolitik di Penicillium oxalicum. Biotechnol. Bahan bakar nabati 10, 100 .
Gao, L., Xia, C., Xu, J., Li, Z., Yu, L., Liu, G., Song, X., Qu, Y., 2017b. Mantan konstitutif
tekanan faktor transkripsi chimeric memungkinkan sintesis selulase di bawah non-
527
Bioteknologi Kemajuan 37 (2019) 519–529
mendorong kondisi di Penicillium oxalicum. Biotechnol. J.12 (11), 1700119 .
Gao, F., Hao, Z., Sun, X., Qin, L., Zhao, T., Liu, W., Luo, H., Yao, B., Su, X., 2018. A
sistem serbaguna untuk penyaringan dan isolasi cepat Trichoderma reesei hiperproduser selulase berdasarkan
penyortiran sel berbantuan DsRed dan fluoresensi. Biotechnol. Bahan bakar nabati 11, 261 .
Gusakov, AV, 2011. Alternatif untuk Trichoderma reesei dalam produksi biofuel. Tren
Han, X., Liu, G., Pan, Y., Song, W., Qu, Y., 2018. Bioproses terkonsolidasi untuk natrium
produksi glukonat dari penggunaan selulosa Penicillium oxalicum. Bioresour. Technol.
251, 407–410 .
Harris, PV, Xu, F., Kreel, NE, Kang, C., Fukuyama, S., 2014. Penggerak wawasan enzim baru
kemajuan dalam produksi etanol komersial. Curr. Opin. Chem. Biol. 19, 162–170 .
Hasper, AA, Trindade, LM, van der Veen, D., van Ooyen, AJ, de Graaff, LH, 2004.
Analisis fungsional dari aktivator transkripsi XlnR dari Aspergillus niger.
Mikrobiologi 150, 1367–1375 Pt 5 .
He, R., Guo, W., Wang, L., Zhang, D., 2015. Pembangunan sistem RNAi yang efisien di
Hemsworth, GR, Johnston, EM, Davies, GJ, Walton, PH, 2015. Polisakarida litik
monooksigenase dalam konversi biomassa. Tren Biotechnol. 33 (12), 747–761 .
Hsu, PD, Lander, ES, Zhang, F., 2014. Pengembangan dan aplikasi CRISPR-Cas9
untuk rekayasa genom. Sel 157 (6), 1262–1278 .
Hu, J., Arantes, V., Saddler, JN, 2011. Peningkatan hidrolisis enzimatik dari
substrat lignoselulosa dengan penambahan enzim tambahan seperti xilanase: apakah ini merupakan efek aditif atau
sinergis? Biotechnol. Bahan bakar nabati 4, 36 .
Hu, J., Chandra, R., Arantes, V., Gourlay, K., van Dyk, JS, Saddler, JN, 2015a. Itu
Penambahan enzim aksesori meningkatkan kinerja hidrolitik enzim selulase pada beban padat yang tinggi.
Bioresour. Technol. 186, 149–153 .
Hu, Y., Xue, H., Liu, G., Song, X., Qu, Y., 2015b. Produksi dan evaluasi yang efisien
enzim lignoselulolitik menggunakan sistem ekspresi protein konstitutif dalam Penicillium oxalicum. J. Ind.
Microbiol. Biotechnol. 42 (6), 877–887 .
Huang, M., Bai, Y., Sjostrom, SL, Hallstrom, BM, Liu, Z., Petranovic, D., Uhlen, M.,
Joensson, HN, Andersson-Svahn, H., Nielsen, J., 2015. Skrining mikrofluida dan sekuensing seluruh genom
mengidentifikasi mutasi yang terkait dengan peningkatan sekresi protein oleh ragi. Proc. Natl. Acad. Sci. AS
112 (34), E4689 – E4696 .
Hurley, JM, Chen, CH, Loros, JJ, Dunlap, JC, 2012. Sistem yang dapat diinduksi cahaya untuk
ekspresi protein merdu di Neurospora crassa. G3 (Bethesda) 2 (10), 1207–1212 .
Jiang, B., Zhang, R., Feng, D., Wang, F., Liu, K., Jiang, Y., Niu, K., Yuan, Q., Wang, M.,
Wang, H., Zhang, Y., Fang, X., 2016. Tet-on dan Cre- loxP berbasis sistem rekayasa genetika untuk
memudahkan daur ulang penanda seleksi di Penicillium oxalicum. Depan. Mikrobiol. 7, 485 .
Jouhten, P., Pitkanen, E., Pakula, T., Saloheimo, M., Penttila, M., Maaheimo, H., 2009.
Rasio fluks metabolik 13C dan analisis jalur karbon baru menegaskan hal itu Trichoderma reesei menggunakan
terutama jalur pernapasan juga pada glukosa sumber karbon yang disukai. BMC Syst. Biol. 3, 104 .
Juhas, M., Ajioka, JW, 2017. Perakitan DNA dengan berat molekul tinggi in vivo untuk sintetik
aplikasi biologi. Crit. Rev. Biotechnol. 37 (3), 277–286 .
Karnaouri, A., Matsakas, L., Topakas, E., Rova, U., Christakopoulos, P., 2016.
Pengembangan campuran enzim yang dibuat khusus untuk termofilik untuk biokonversi residu pertanian dan
hutan. Depan. Mikrobiol. 7, 177 .
Kiiskinen, LL, Kruus, K., Bailey, M., Ylosmaki, E., Siika-Aho, M., Saloheimo, M., 2004.
Ekspresi dari Melanocarpus albomyces laccase masuk Trichoderma reesei dan karakterisasi enzim yang
dimurnikan. Mikrobiologi 150, 3065–3074 Pt 9 .
Krappmann, S., 2017. CRISPR-Cas9, anak baru di blok biologi molekuler jamur.
Med. Mycol. 55 (1), 16–23 .
Kubicek, CP, 2013. Pendekatan biologis sistem untuk memahami selulase
produksi oleh Trichoderma reesei. J. Biotechnol. 163 (2), 133–142 .
Kubicek, CP, Starr, TL, Glass, NL, 2014. Enzim pengurai dinding sel tanaman dan
sekresi pada jamur patogen tanaman. Annu. Pdt. Phytopathol. 52, 427–451 .
Kumar, R., Wyman, CE, 2014. Penghambatan selulase yang kuat oleh mannan polisakarida di
konversi selulosa menjadi gula. Biotechnol. Bioeng. 111 (7), 1341–1353 .
Li, Z., Yao, G., Wu, R., Gao, L., Kan, Q., Liu, M., Yang, P., Liu, G., Qin, Y., Song, X., Zhong,
Y., Fang, X., Qu, Y., 2015. Regulasi ekspresi gen selulase yang sinergis dan terkontrol dosis Penicillium
oxalicum. PLoS Genet. 11 (9), e1005509 .
Li, Y., Zheng, X., Zhang, X., Bao, L., Zhu, Y., Qu, Y., Zhao, J., Qin, Y., 2016. Peran yang berbeda dari Penicillium
oxalicum LaeA dalam produksi selulase ekstraseluler dan β- xylosidase. Depan. Mikrobiol. 7, 2091 .
Li, Y., Zhang, X., Xiong, L., Mehmood, MA, Zhao, X., Bai, F., 2017. Produksi selulase di tempat dan sakarifikasi efisien dari
penggunaan brangkasan jagung cbh2.dll mengungkapkan secara berlebihan Trichoderma reesei dengan sistem
induksi baru. Bioresour. Technol. 238, 643–649 .
Lin, H., Hildebrand, A., Kasuga, T., Fan, Z., 2017. Teknik Neurospora crassa untuk
produksi selobionat langsung dari selulosa tanpa penambahan enzim. Enzim. Mikrob. Technol. 99, 25–31 .
Lin, L., Sun, Z., Li, J., Chen, Y., Liu, Q., Sun, W., Tian, C., 2018. Gangguan gul-1
menurunkan viskositas kultur dan meningkatkan sekresi protein dalam jamur berserabut Neurospora crassa. Mikrob.
Pabrik Sel 17 (1), 96 .
Berlama-lama, JG, Taylor 2nd, LE, Baker, JO, Vander Wall, T., Hobdey, SE, Podkaminer, K.,
Himmel, ME, Decker, SR, 2015. Sistem ekspresi konstitutif untuk keluarga glikosil hidrolase 7 selobiohidrolase di
Hypocrea jecorina. Biotechnol. Bahan bakar nabati 8, 45 .
Liu, T., Wang, T., Li, X., Liu, X., 2008. Peningkatan ekspresi gen heterolog di
Trichoderma reesei oleh gen selobiohidrolase I ( cbh1) pengoptimalan promotor. Acta Biochim. Biofis. Dosa.
Shanghai 40 (2), 158–165 .
Liu, G., Qin, Y., Li, Z., Qu, Y., 2013a. Pengembangan lig- yang sangat efisien dan berbiaya rendah
sistem enzim noselulolitik di era pasca genom. Biotechnol. Adv. 31 (6), 962–975 .
Liu, G., Qin, Y., Li, Z., Qu, Y., 2013b. Meningkatkan produksi enzim lignoselulolitik dengan
G. Liu, Y. Qu
Penicillium: dari skrining regangan hingga biologi sistem. Biofuel 4 (5), 523–534 .
Liu, R., Chen, L., Jiang, Y., Zhou, Z., Zou, G., 2015. Pengeditan genom yang efisien di fila-
jamur mental Trichoderma reesei menggunakan sistem CRISPR / Cas9. Cell Discov. 1, 15007 .
Liu, Q., Gao, R., Li, J., Lin, L., Zhao, J., Sun, W., Tian, C., 2017. Pengembangan genom-
mengedit sistem CRISPR / Cas9 di jamur termofilik Myceliophthora spesies dan aplikasinya untuk rekayasa
regangan produksi hiper-selulase. Biotechnol. Biofuel 10 (1) .
Lv, X., Zheng, F., Li, C., Zhang, W., Chen, G., Liu, W., 2015. Karakterisasi promotor responsif tembaga dan ekspresi
berlebih yang dimediasi dari regulator xilanase 1 menghasilkan produksi selulase yang tidak bergantung induksi
dalam Trichoderma reesei.
Biotechnol. Bahan bakar nabati 8, 67 .
Lynd, LR, Laser, MS, Bransby, D., Dale, BE, Davison, B., Hamilton, R., Himmel, M.,
Keller, M., McMillan, JD, Sheehan, J., Wyman, CE, 2008. Bagaimana biotek dapat mengubah biofuel.
Nat. Biotechnol. 26 (2), 169–172 .
Ma, L., Zhang, J., Zou, G., Wang, C., Zhou, Z., 2011. Peningkatan aktivitas selulase di
Trichoderma reesei oleh ekspresi heterolog dari gen β-glukosidase dari
Penicillium decumbens. Enzim. Mikrob. Technol. 49 (4), 366–371 .
Manavalan, T., Liu, R., Zhou, Z., Zou, G., 2017. Optimasi gen asetil xilan esterase
ekspresi dalam Trichoderma reesei dan aplikasinya untuk meningkatkan efisiensi sakarifikasi pada berbagai
biomassa. Proses Biochem. 58, 160–166 .
Matsu-Ura, T., Baek, M., Kwon, J., Hong, C., 2015. Pengeditan gen yang efisien dalam Neurospora
crassa dengan teknologi CRISPR. Berbagai jamur. Biotechnol. 2 (1), 4 .
Mello-De-Sousa, TM, Gorsche, R., Rassinger, A., Pocas-Fonseca, MJ, Mach, RL, Mach-
Aigner, AR, 2014. Bentuk terpotong dari Carbon catabolite repressor 1 meningkatkan produksi selulase di Trichoderma
reesei. Biotechnol. Biofuel 7 (1), 129 .
Merino, ST, Cherry, J., 2007. Kemajuan dan tantangan dalam pengembangan enzim untuk bio-
pemanfaatan massal. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 108, 95–120 .
Montenegro-Montero, A., Goity, A., Larrondo, LF, 2015. Faktor transkripsi bZIP
HAC-1 terlibat dalam respon protein yang tidak terlipat dan diperlukan untuk pertumbuhan selulosa Neurospora
crassa. PLoS One 10 (7), e0131415 .
Nakayashiki, H., Hanada, S., Nguyen, BQ, Kadotani, N., Tosa, Y., Mayama, S., 2005.
Peredam RNA sebagai alat untuk mengeksplorasi fungsi gen pada jamur ascomycete. Genet Jamur. Biol. 42 (4),
275–283 .
Ouedraogo, JP, Arentshorst, M., Nikolaev, I., Barends, S., Ram, AF, 2016. Enzim I-SceI
integrasi termediasi (SEMI) untuk penargetan gen yang cepat dan efisien di Trichoderma re- esei. J. Biotechnol.
222, 25–28 .
Ouyang, S., Beecher, CN, Wang, K., Larive, CK, Borkovich, KA, 2015. Metabolik im-
pakta menggunakan nitrogen dan promotor yang diatur tembaga untuk mengatur ekspresi gen di Neurospora
crassa. G3 (Bethesda) 5 (9), 1899–1908 .
Pakula, TM, Laxell, M., Huuskonen, A., Uusitalo, J., Saloheimo, M., Penttila, M., 2003.
Efek obat yang menghambat sekresi protein dalam jamur berfilamen
Trichoderma reesei. Bukti penurunan regulasi gen yang menyandikan protein yang disekresikan dalam sel yang
tertekan. J. Biol. Chem. 278 (45), 45011–45020 .
Pei, X., Fan, F., Lin, L., Chen, Y., Sun, W., Zhang, S., Tian, C., 2015. Keterlibatan
adaptor protein 3 kompleks dalam sekresi lignoselulase di Neurospora crassa diungkapkan oleh skrining genomik
komparatif. Biotechnol. Bahan bakar nabati 8, 124 .
Peng, S., Cao, Q., Qin, Y., Li, X., Liu, G., Qu, Y., 2017. AltA aldonolaktonase dari
Penicillium oxalicum mengurangi penghambatan β-glukosidase selama biodegradasi lignoselulosa. Appl.
Mikrobiol. Biotechnol. 101 (9), 3627–3636 .
Qi, H., Li, BZ, Zhang, WQ, Liu, D., Yuan, YJ, 2015. Modularisasi elemen genetik
mempromosikan rekayasa metabolik sintetis. Biotechnol. Adv. 33 (7), 1412–1419 .
Qin, LN, Cai, FR, Dong, XR, Huang, ZB, Tao, Y., Huang, JZ, Dong, ZY, 2012.
Peningkatan produksi lipase heterolog di Trichoderma reesei oleh pembungkaman gen yang dimediasi oleh RNAi dari
gen endogenik yang sangat diekspresikan. Bioresour. Technol. 109, 116–122 .
Roche, CM, Kaca, NL, Blanch, HW, Clark, DS, 2014a. Rekayasa filamen
jamur Neurospora crassa untuk produksi lipid dari biomassa lignoselulosa. Biotechnol. Bioeng. 111
(6), 1097–1107 .
Roche, CM, Loros, JJ, McCluskey, K., Glass, NL, 2014b. Neurospora crassa: mencari
kembali dan melihat ke depan pada mikroba model. Saya. J. Bot. 101 (12), 2022–2035 .
Schubert, C., 2006. Dapatkah biofuel akhirnya menjadi pusat perhatian? Nat. Biotechnol. 24 (7),
777–784 .
Schuster, A., Bruno, KS, Collett, JR, Baker, SE, Seiboth, B., Kubicek, CP, Schmoll, M.,
2012. Toolkit serbaguna untuk genomik fungsional throughput tinggi dengan Trichoderma reesei. Biotechnol.
Biofuel 5 (1), 1 .
Seiboth, B., Gamauf, C., Pail, M., Hartl, L., Kubicek, CP, 2007. Reduktase D-xilosa dari
Hypocrea jecorina adalah reduktase aldosa utama dalam pentosa dan katabolisme D-galaktosa dan diperlukan
untuk induksi β-galaktosidase dan selulase oleh laktosa. Mol. Mikrobiol. 66 (4), 890–900 .
Seiboth, B., Karimi, RA, Phatale, PA, Linke, R., Hartl, L., Sauer, DG, Smith, KM,
Baker, SE, Freitag, M., Kubicek, CP, 2012. Putatif protein methyltransferase LAE1 mengontrol ekspresi gen
selulase di Trichoderma reesei. Mol. Mikrobiol. 84 (6), 1150–1164 .
Shi, S., Liang, Y., Zhang, MM, Ang, EL, Zhao, H., 2016. Satu langkah yang sangat efisien,
strategi tanpa penanda untuk integrasi kromosom multi-salinan dari jalur biokimia besar di Saccharomyces
cerevisiae. Metab. Eng. 33, 19–27 .
Shida, Y., Yamaguchi, K., Nitta, M., Nakamura, A., Takahashi, M., Kidokoro, S., Mori, K.,
Tashiro, K., Kuhara, S., Matsuzawa, T., Yaoi, K., Sakamoto, Y., Tanaka, N., Morikawa,
Y., Ogasawara, W., 2015. Dampak mutasi nukleotida tunggal bgl2 pada induksi selulase di a Trichoderma
reesei mutan. Biotechnol. Bahan bakar nabati 8, 230 .
Singh, A., Taylor 2nd, LE, Vander Wall, TA, Linger, J., Himmel, ME, Podkaminer, K.,
Adney, WS, Decker, SR, 2015. Ekspresi protein heterolog di Hypocrea je- corina: perspektif sejarah dan
perkembangan baru. Biotechnol. Adv. 33 (1), 142–154 .
Sinitsyn, AP, Osipov, DO, Rozhkova, AM, Bushina, EV, Dotsenko, GS, Sinitsyna,
528
Bioteknologi Kemajuan 37 (2019) 519–529
OA, Kondrat'Eva, EG, Zorov, IN, Okunev, ON, Nemashkalov, VA, 2014. Produksi kompleks enzim selulase dan
hemiselulase yang sangat efektif berdasarkan Penicillium verruculosum saring untuk hidrolisis bahan baku
tanaman. Appl. Biochem. Mikrobiol. 50 (8), 761–772 .
Sinitsyn, AP, Korotkova, OG, Sinitsyna, OA, Rozhkova, AM, Dotsenko, GS,
Proskurina, OV, Osipov, DO, Kondrat'Eva, EG, Chekushina, AV, 2016. Mengoptimalkan komposisi kompleks
enzim selulase dari Penicillium verrucu- losum: Meningkatkan kemampuan hidrolitik melalui rekayasa
genetika. Catal. Ind. 8 (1), 101–106 .
Skory, CD, Freer, SN, Bothast, RJ, 1997. Skrining untuk filamen penghasil etanol
jamur. Biotechnol. Lett. 19 (3), 203-206 .
Steiger, MG, Vitikainen, M., Uskonen, P., Brunner, K., Adam, G., Pakula, T., Penttila, M.,
Saloheimo, M., Mach, RL, Mach-Aigner, AR, 2011. Sistem transformasi untuk
Hypocrea jecorina (Trichoderma reesei) yang mendukung integrasi homolog dan menggunakan penanda yang dapat
digunakan kembali secara dua arah. Appl. Mengepung. Mikrobiol. 77 (1), 114–121 .
Su, X., Xin, C., Dong, Z., 2009. Identifikasi transkrip yang ditinggikan di a Trichoderma reesei
regangan mengekspresikan aktivator transkripsi chimeric menggunakan hibridisasi subtraktif penekanan.
Dunia J. Microbiol. Biotechnol. 25 (6), 1075–1084 .
Su, X., Schmitz, G., Zhang, M., Mackie, RI, Cann, IK, 2012. Eks gen heterolog
tekanan pada jamur berserabut. Adv. Appl. Mikrobiol. 81, 1–61 .
Subramanian, V., Schuster, LA, Moore, KT, Taylor 2nd, LE, Baker, JO, Vander Wall,
TA, Linger, JG, Himmel, ME, Decker, SR, 2017. Platform pengekspres protein bikistronik berbasis peptida 2A
serbaguna untuk industri selulase yang memproduksi jamur,
Trichoderma reesei. Biotechnol. Biofuel 10, 34 .
Sun, J., Glass, NL, 2011. Identifikasi dari regulator selulolitik CRE-1 di Neurospora
crassa. PLoS One 6 (9), e25654 .
Sun, FF, Hong, J., Hu, J., Saddler, JN, Fang, X., Zhang, Z., Shen, S., 2015. Aksesori
enzim mempengaruhi hidrolisis selulase dari substrat model dan biomassa lignoselulosa yang realistis. Enzim.
Mikrob. Technol. 79-80, 42–48 .
Szewczyk, E., Kasuga, T., Fan, Z., 2014. Varian baru β-rekombinase / enam
kaset untuk penghapusan gen berulang dan pemurnian homokarion di Neurospora crassa. J. Microbiol.
Metode 100, 17–23 .
Throndset, W., Kim, S., Bower, B., Lantz, S., Kelemen, B., Pepsin, M., Chow, N.,
Mitchinson, C., Ward, M., 2010. Pemilahan aliran sitometrik dari jamur berserabut
Trichoderma reesei untuk strain yang ditingkatkan. Enzim. Mikrob. Technol. 47 (7), 335–341 .
Tian, C., Li, J., Long, C., Sun, T., Lin, L., Xu, J., Liu, Q., Ji, J., Sun, W., Ma, Y., 2016. Baru
Strain Penghasil Asam Organik Dibasa dan Persiapan dan Aplikasi yang Sama. (Paten PCT no.
WO2016127920A1) .
van den Brink, J., de Vries, RP, 2011. Set enzim jamur untuk polisakarida de-
gradasi. Appl. Mikrobiol. Biotechnol. 91 (6), 1477–1492 .
Visser, H., Joosten, V., Punt, PJ, Gusakov, AV, Olson, PT, Joosten, R., Bartels, J.,
Visser, J., Sinitsyn, AP, Emalfarb, MA, Verdoes, JC, Wery, J., 2011. Pengembangan teknologi jamur yang
matang dan platform produksi untuk enzim industri berdasarkan Myceliophthora thermophila isolate, sebelumnya
dikenal sebagai Keberuntungan Chrysosporium C1. Ind. Biotechnol. 7 (3), 214–223 .
Wang, TH, Zhong, YH, Huang, W., Liu, T., You, YW, 2005. Penghambatan antisense
gen xylitol dehydrogenase, xdh1 dari Trichoderma reesei. Lett. Appl. Mikrobiol. 40 (6), 424–429 .
Wang, S., Liu, G., Wang, J., Yu, J., Huang, B., Xing, M., 2013. Meningkatkan selulase pro-
duction in Trichoderma reesei RUT C30 melalui manipulasi gabungan untuk mengaktifkan dan menekan gen. J.
Ind. Microbiol. Biotechnol. 40 (6), 633–641 .
Wang, W., Meng, F., Liu, P., Yang, S., Wei, D., 2014. Pembuatan koleksi promotor
untuk gen ekspresi bersama dalam jamur berserabut Trichoderma reesei. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 41 (11),
1709–1718 .
Wang, G., Lv, P., He, R., Wang, H., Wang, L., Zhang, D., Chen, S., 2015a. Protein disulfida
isomerase homolog TrPDI2 berkontribusi pada produksi selobiohidrolase di
Trichoderma reesei. Enzim. Mikrob. Technol. 77, 21–28 .
Wang, J., Wu, Y., Gong, Y., Yu, S., Liu, G., 2015b. Meningkatkan produksi xilanase di
jamur termofilik Myceliophthora thermophila dengan ekspresi berlebih homolog dari Mtxyr1. J. Ind. Microbiol.
Biotechnol. 42 (9), 1233–1241 .
Wang, L., Zheng, F., Zhang, W., Zhong, Y., Chen, G., Meng, X., Liu, W., 2018. Tembaga-
sistem interferensi RNA terkontrol untuk membungkam gen target secara reversibel
Trichoderma reesei. Biotechnol. Bahan bakar nabati 11, 33 .
Xin, Q., Gong, Y., Lv, X., Chen, G., Liu, W., 2013. Trichoderma reesei histone acetyl-
transferase Gcn5 mengatur pertumbuhan jamur, konidiasi, dan ekspresi gen selulase. Curr. Mikrobiol. 67 (5),
580–589 .
Xu, Q., Singh, A., Himmel, ME, 2009. Perspektif dan arah baru untuk produksi
bioetanol menggunakan bioproses terkonsolidasi dari lignoselulosa. Curr. Opin. Biotechnol. 20 (3),
364–371 .
Xu, Q., Himmel, ME, Singh, A., 2015. Produksi etanol dari rekayasa
Trichoderma reesei. Dalam: Himmel, M. (Ed.), Konversi Mikroba Langsung dari Biomassa menjadi Biofuel Lanjutan.
Elsevier, Amsterdam, hlm. 197–208 .
Xue, X., Wu, Y., Qin, X., Ma, R., Luo, H., Su, X., Yao, B., 2016. Meninjau kembali ekspresi berlebih
dari β-glukosidase heterolog di Trichoderma reesei: ekspresi fusi dari
Neosartorya fischeri Bgl3A untuk cbh1 meningkatkan aktivitas selulase secara keseluruhan serta individu.
Mikrob. Pabrik Sel 15 (1), 122 .
Yamada, R., Hasunuma, T., Kondo, A., 2013. Memberi mikroorganisme non-selulolitik
dengan aktivitas selulolitik yang bertujuan untuk bioproses terkonsolidasi. Biotechnol. Adv. 31 (6), 754–763 .
Yamada, R., Yoshie, T., Wakai, S., Asai-Nakashima, N., Okazaki, F., Ogino, C., Hisada, H.,
Tsutsumi, H., Hata, Y., Kondo, A., 2014. Aspergillus oryzae- pabrik sel berbasis untuk produksi asam kojic
langsung dari selulosa. Mikrob. Pabrik Sel 13, 71 .
Yang, L., Lübeck, M., Lübeck, PS, 2017. Aspergillus sebagai pabrik sel serbaguna untuk organik
produksi asam. Berbagai jamur. Wahyu 31 (1), 33–49 .
Yao, G., Li, Z., Gao, L., Wu, R., Kan, Q., Liu, G., Qu, Y., 2015. Mendesain ulang peraturan
G. Liu, Y. Qu
jalur untuk meningkatkan produksi selulase di Penicillium oxalicum. Biotechnol. Biofuel
8, 71 .
Yao, G., Wu, R., Kan, Q., Gao, L., Liu, M., Yang, P., Du, J., Li, Z., Qu, Y., 2016. Produksi
kompleks selulase efisiensi tinggi melalui rekayasa β-glukosidase di Penicillium oxalicum. Biotechnol. Bahan
bakar nabati 9, 78 .
Ye, Y., Li, X., Cao, Y., Du, J., Chen, S., Zhao, J., 2017. Produksi hiper β-xylosidase
Penicillium oxalicum mutan meningkatkan produksi etanol dari brangkasan jagung dengan perlakuan alkali. Bioresour.
Technol. 245, 734–742 .
Zhang, Z., Qu, Y., Zhang, X., Lin, J., 2008. Pengaruh pembatasan oksigen pada xylose fer-
mentasi, metabolit intraseluler, dan enzim kunci dari Neurospora crassa
AS3.1602. Appl. Biochem. Biotechnol. 145 (1–3), 39–51 .
Zhang, G., Seiboth, B., Cao, W., Zhong, Y., Li, X., Wang, T., 2010. Sumber karbon baru-
sistem transformasi genetik dependen untuk pabrik sel serbaguna Hypocrea je- corina ( anamorph Trichoderma
reesei). FEMS Microbiol. Lett. 303 (1), 26–32 .
Zhang, J., Qu, Y., Xiao, P., Wang, X., Wang, T., He, F., 2012. Peningkatan kantung biomassa
charification oleh Trichoderma reesei melalui ekspresi heterolog lacA gen dari
Trametes sp. AH28-2. J. Biosci. Bioeng. 113 (6), 697–703 .
Zhang, F., Bai, F., Zhao, X., 2016a. Produksi selulase ditingkatkan dari Trichoderma reesei
Rut-C30 dengan rekayasa dengan perpustakaan protein jari seng buatan. Biotechnol. J. 11 (10), 1282–1290 .
Zhang, G., Liu, P., Wei, W., Wang, X., Wei, D., Wang, W., 2016b. A light-switchable
sistem ekspresi dua arah dalam jamur berserabut Trichoderma reesei. J. Biotechnol. 240, 85–93 .
Zhang, C., Meng, X., Wei, X., Lu, L., 2016c. Mutagenesis CRISPR yang sangat efisien oleh
akhir bermediasi mikrohomologi bergabung Aspergillus fumigatus. Genet Jamur. Biol. 86, 47–57 .
Zhang, X., Qu, Y., Qin, Y., 2016d. Ekspresi dan struktur kromatin selulolitik
529
Bioteknologi Kemajuan 37 (2019) 519–529
gen enzim yang diatur oleh protein heterochromatin 1. Biotechnol. Bahan bakar nabati 9, 206 .
Zhang, H., Zhang, J., Bao, J., 2016e. Fermentasi asam glukonat titer tinggi sebesar Aspergillus
niger dari brangkasan jagung asam encer kering tanpa detoksifikasi. Bioresour. Technol. 203, 211–219 .
Zhang, X., Li, Y., Zhao, X., Bai, F., 2017. Produksi selulase konstitutif dari glukosa
menggunakan rekombinan Trichoderma reesei saring mengekspresikan aktivator transkripsi buatan secara
berlebihan. Bioresour. Technol. 223, 317–322 .
Zhang, J., Wu, C., Wang, W., Wang, W., Wei, D., 2018a. Konstruksi ditingkatkan
aktivator transkripsi untuk meningkatkan produksi selulase di Trichoderma reesei
RUT C30. Bioresour. Bioproses. 5 (1), 40 .
Zhang, J., Zhang, G., Wang, W., Wang, W., Wei, D., 2018b. Produksi selulase ditingkatkan
di Trichoderma reesei RUT C30 melalui konstitusi aktivator transkripsi minimal. Mikrob. Pabrik Sel 17 (1), 75 .
Zhao, C., Chen, S., Fang, H., 2018. Bioproses terkonsolidasi dari biomassa lignoselulosa
menjadi asam itaconic dengan rekayasa metabolik Neurospora crassa. Appl. Mikrobiol. Biotechnol. 102 (22),
9577–9584 .
Zhou, Q., Xu, J., Kou, Y., Lv, X., Zhang, X., Zhao, G., Zhang, W., Chen, G., Liu, W., 2012.
Keterlibatan diferensial β-glukosidase dari Hypocrea jecorina dalam induksi cepat gen selulase oleh selulosa dan
selobiosa. Eukariot. Sel 11 (11), 1371–1381 .
Znameroski, EA, Coradetti, ST, Roche, CM, Tsai, JC, Iavarone, AT, Cate, JH, Kaca,
NL, 2012. Induksi enzim pendegradasi lignoselulosa di Neurospora crassa oleh cellodextrins. Proc. Natl. Acad.
Sci. AS 109 (16), 6012–6017 .
Zou, G., Shi, S., Jiang, Y., van den Brink, J., de Vries, RP, Chen, L., Zhang, J., Ma, L.,
Wang, C., Zhou, Z., 2012. Pembangunan sistem ekspresi hiper selulase di
Trichoderma reesei oleh promotor dan rekayasa enzim. Mikrob. Pabrik Sel
11, 21 .