DISKUSI HASIL PRAKTIKUM HPLC

Kelompok IV-A:
Amaliyah (2015.04.3.0005)
Arif Prabowo (2015.04.3.0008)
Dia Indah Sari (2015.04.3.0021)
Fadhila Eka Pratiwi (2015.04.3.0031)
Henny Indah A. (2015.04.3.0040)
Laurentia (2015.04.3.0047)
Lia Trinanda (2015.04.3.0048)

Program Studi Farmasi

Fakultas Kedokteran
Universitas Hang Tuah Surabaya
2017
 TUJUAN
Menjelaskan komponen instrumen HPLC beserta masing-
masing fungsinya.
Menjelaskan cara kerja operasional analisis dengan HPLC.
Menjelaskan kondisi HPLC dan pengaruhnya terhadap
kromatogram.
Melakukan analisis kualitatif dan kuantitatif dengan HPLC.
 Prinsip Dasar
HPLC adalah kependekan dari High Performance Liquid Chromatography atau
dikenal dengan istilah KCKT yaitu kromatografi cair kinerja tinggi. Instrumen HPLC
terdiri dari botol-botol eluen, pompa, kolom pelindung, gerbang suntik, kolom,
pembuangan, detektor, penampung eluen, recorder/PC.
Sistem injektor HPLC yang digunakan dalam praktikum ini adalah injektor dengan
pipa dosis ( loop valve). Prinsip kerjanya adalah load-inject, dimana sampel akan masuk
memenuhi volume loop terlebih dahulu dan masuk menuju kolom pemisahan dengan
volume yang tidak berkurang sedikitpun. Jadi pada saat sampel diinjeksikan maka sampel
tidak akan langsung masuk kedalam kolom, tetapi akan memenuhi pipa dosis terlebih
dahulu dan volume sampel yang diinjeksikan sebaiknya lima kali dari volume pipa
dosisnya. Pipa dosis yang telah terisi sampel akan berhubungan dengan kolom sehingga
sampel akan menuju kolom dengan bantuan fase geraknya.
Kolom pada HPLC merupakan bagian yang sangat penting karena pemisahan
komponene-komponen sampel akan terjadi didalam kolom. Berdasarkan fase diam dan fase
geraknya, kolom HPLC dibedakan atas fase normal yaitu fase diam bersifat polar dan fase
geraknya bersifat nonpolar dan fase terbalik yaitu fase diam bersifat non polar dan fase
gerak bersifat polar.
 Alat dan Bahan
Alat :
1. labu ukur
2. Botol vial
3. Pipet volume
4. Microsyringe 100
5. HPLC Shimadzu senal No.L 20705310120
Bahan :
6. Larutan pembanding Nipagin dan Nipasol
7. Metanol pro HPLC, Aquadest bidestillata steril
 Prosedur Kerja
Membaut larutan Menepatkan solvent
baku Nipagin dan Menghidupkan alat (fase gerak) pada
Nipasol 1-10ppm HPLC Shimatzu gelas solvent
dalam metanol

Menghidupkan LC-1100
Menjalankan Mengjidupkan kompiter
dan pastikan bahwa
program LC hingga masuk windows
komputer dan LC
Chem station dan program CAG boot
berkomunikasi dengan
server
baik

Load method dan set Tunggu sampai

kondisi HPLC ready
 Kondisi HPLC: Fase gerak metanol-
air=70:30, panjang gelombang Menyaring
analitik=254nm, suhu sampel Analisis
kolom=30C, kolom=Li- dengan filter dengan HPLC
Chrosphere RP-18,kec, 0.2 mikron
alir=1ml/menit

Membuat tabel waktu Mengamati

retensi, peak area dan
peak heightnya pada
masing-masing kosentrasi
Menyuntikan
kromatogram yang
masing masing
dihasilkan. Hitung
larutan standar
resolusi kedua peak

Menentukan persamaan Menyatat waktu retensi dan area dari

gari regresi antara peak peak yang diperoleh. Simpulkan
kosentrasi Nipagim dan zat manakah yg terkandung di dlm
Nipasol dengan masing- sampe, hitung kadar berdasarkan
masing peak areanya persamaan regresi yg diperoleh
Data Hasil Pengamatan
 SUB KELOMPOK - 7

TR TR AREA NPG AREA NPS

ZAT
NPG NPS (Y) (Y)

Std tunggal nipagin 50 ppm 4,179 - 777,532 -

Std tunggal niposol 50 ppm - 6,793 - 593,029

Std campuran 1 ppm 4,092 6,765 94601 17540

Std campuran 2,5 ppm 4,202 6,762 39624 31891

Std campuran 7,5 ppm 4,203 6,763 104202 62283

Std campuran 10 ppm 4,200 6,779 235406 121444

Sampel :

Sampel no.7 4,206 6,769 82863 61103

Persamaan Regresi (y = bx+a)
Nipagin
Y = 24758,08x 41701
R = 0,9315
Nipasol
Y = 12051,56x + 2310,5
R = 0,9992

Kadar Nipagin (Sampel no.7)

Y = bx + a
Y = 24758,08x 41701
82863 = 24758,08x 41701
x =

x = 5,0312 ppm

Kadar Nipasol (Sampel no.7)

Y = bx + a
Y = 12051,56x + 2310,5
61103 = 12051.56x + 2310.5
x =

x = 4,8784 ppm
Larutan Baku :
Nipagin = 0,0050g /100ml = 50 ppm
Nipasol = 0,0050g /100ml = 50 ppm
Membuat Larutan Standart Campuran
1 ppm = X 50 ppm
2,5 ppm = X 50 ppm
5 ppm = X 50 ppm
7,5 ppm = X 50 ppm
10 ppm = X 50 ppm
 SUB KELOMPOK 8
TR TR AREA NPG AREA NPS
ZAT
NPG NPS (Y) (Y)

Std tunggal nipagin 50 ppm 4,179 - 777,532 -

Std tunggal niposol 50 ppm - 6,793 - 593,029

Std campuran 1 ppm 4,092 6,765 94601 17540

Std campuran 2,5 ppm 4,202 6,757 39624 31981

Std campuran 7,5 ppm 4,203 6,763 104202 94913

Std campuran 10 ppm 4,200 6,779 235486 121444

Sampel :

Sampel no.3 4,202 6,772 121264 86989

Sampel no.9 4,210 6,772 74259 60028

Persamaan regresi (y = bx + a)
Nipagin :
R = 0,9314 y = bx + a
A = -41701 y = 24578,08x + -41701
B = 24578,08

Nipasol :
R = 0,9992 y = bx + a
A = 2310,5 y = 12051,56 + 2310,5
B = 12051,56

Kadar Nipagin (Sampel no.3)

Y = bx + a
121264 = 25758,08x 41701
x =

x = 6,5822 ppm

Kadar Nipasol (Sampel no.3)

Y = bx + a
86989 = 12051,05x + 2310,5
x =

x = 7,0263 ppm
Kadar Nipagin (Sampel no.9)
Y = bx + a
74259 = 24758,08x 41701
x =
x = 4,6837 ppm

Kadar Nipasol (Sampel no.9)

Y = bx + a
60028 = 12051,56x + 2310,5
x =
x = 4,7892 ppm
Larutan Baku :
Nipagin = 0,0050g /100ml = 50 ppm
Nipasol = 0,0050g /100ml = 50 ppm
Membuat Larutan Standart Campuran
1 ppm = X 50 ppm
2,5 ppm = X 50 ppm
5 ppm = X 50 ppm
7,5 ppm = X 50 ppm
10 ppm = X 50 ppm
 Analisis Data

Rs. Sampel no.3

Rs. Sampel no.7

Rs. Sampel no.9

 Pembahasan Hasil Praktikum
Percobaan kali ini bertujuan untuk menentukan kadar nipagin dan nipasol
dalam sampel menggunakan instrumen HPLC (High Performance Liquid
Chromatography). Prinsip dasar HPLC yaitu berdasarkan perbedaan distribusi
komponen komponen dalam sampel diantara dua fase, fase gerak dan fase
diam. Fase gerak yang digunakan adalah metanol dan air dengan
perbandingan 70:30.
Setelah diencerkan dari kadar 50 ppm menjadi kadar 1 ppm; 2,5 ppm; 5
ppm; 7,5 ppm; dan 10 ppm secara kuantitatif, larutan sampel disaring.
Penyaringan dilakukan menggunakan kertas saring whatman dan membran
filter. Hal tersebut dilakukan karena dalam sampel tidak hanya mengandung
nipagin dan nipasol, namun terdapat zat penyusun lain yang belum larut
seluruhnya yang masih berupa partikel partikel padat dalam larutan dan agar
diperoleh larutan sampel murni tanpa ada partikel partikel
pengganggu/pengotor yang dapat mempengaruhi hasil pemisahan.
 Sebelum ditampung, sebagian filtrat dibuang terlebih dahulu yang
dimaksudkan untuk membilas membran agar dapat dipastikan tidak ada
zat kontaminan dari membran yang dapat ikut tertampung.
Analisis pada percobaan kali ini adalah analisis kualitatif dan
kuantitatif. Analisis kualitatif dilakukan dengan membandingkan waktu
retensi komponen dalam sampel dengan waktu retensi standar. Puncak
yang akan muncul pada kromatogram adalah puncak komponen nipagin
terlebih dahulu.
Sebelum dilakukan pemisahan, instrumen HPLC harus dikondisikan
pada keadaan optimal agar hasil pemisahan yang didapatkan baik.
Kemudian baik sampel maupun standar, sebelum diinjeksikan ke dalam
HPLC perlu dilakukan degassing untuk menghilangkan gelembung udara
karena gelembung udara dapat terkumpul di kepala pompa ataupun
detektor sehingga akan mengganggu kondisi HPLC.
 Kadar analit nipagin dan nipasol dapat ditentukan dengan menghitung konsentrasi
analit menggunakan persamaan y = bx + a. Berdasarkan data pengamatan, diperoleh
kadar nipagin dan nipasol dalam sampel masing masing. Pada sampel no 3 didapatkan
kadar nipagin sebesar 6,5822 ppm sedangkan kadar nipasol sebesar 7,0263 ppm,
sehingga didapatkan resolusi sebesar 2,7052. Pada sampel no 7 didapatkan kadar
nipagin sebesar 5,0312 ppm sedangkan kadar nipasol sebesar 4,8784 ppm, sehingga
didapatkan resolusi sebesar 3,0152. Pada sampel no 9 didapatkan kadar nipagin sebesar
4,6837 ppm sedangkan kadar nipasol sebesar 4,7892 ppm, sehingga didapatkan
resolusi sebesar 3,2025.
Kesalahan kesalahan yang mungkin terjadi selama analisis pada percobaan ini
diantaranya, masih terdapat pengotor di dalam sampel sehingga peak yang dihasilkan
tidak hanya peak dari nipagin dan nipasol saja.
 Pembahasan Jurnal
Simultaneous Determination Of Amphetamine, And Caffeinne
In Seized Tablets By High Performance Liquid Chromatography

Pada jurnal menggunakan pelarut asam encer orto fosfat (Ph 2,1) dan
acetonitrile dengan perbandingan 90:10. Panjang gelombang yang
digunakan adalah 205 nm. Pada metode ini termasuk kromatografi fase
terbalik yang dilakukan pada 40 C
Pada jurnal ditentukan kadar amfetamin, metamfetamin dan caffeine
 Pada jurnal terdapat metode validasi guna untuk selektivitas,
linieritas, akurasi, dan presisi. Pada selektivitas kromatogram yang
ditunjukkan jelas bahwa di bawah kondisi kromatografi amfetamin,
methamphetamine, dan kafein benar-benar terpisah satu sama lain, yang
menunjukkan metode ini selektif dan dapat digunakan untuk identifikasi
secara serentak dan kuantifikasi.
Pada linearitas, metode ini ditentukan untuk setiap komponen,
dengan membuat grafik kalibrasi area puncak terhadap konsentrasi.
Sedangkan akurasi ditentukan guna untuk meminimalisir kesalahan
relatif dari konsentrasi ata-rata yang diamati dihitung sebagai indikasi
akurasi.Dan juga perlu ketelitian (presisi) dengan ditentukan dengan
analisis tiga seri larutan kerja secara individual amfetamin,
metamfetamin, dan kafein pada tiga konsentrasi yang berbeda. Standar
deviasi relatif untuk semua tiga konsentrasi kurang dari 2,63%,
menggambarkan ketepatan metode ini cocok untuk keperluan rutin.
 Kesimpulan
1. Instrumen HPLC terdiri dari botol eluen, pompa, kolom, gerbang suntik,
detektor, recorder.
2. Cara kerja operasional dari HPLC adalah Load Inject
3. Kondisi yang mempengaruhi kromatogram yaitu fase gerak (metanol:air)
70:30, panjang gelombang 254 nm, kolom 30C, kolom dengan spesifikasi
(masenal sum C18 dimensi 4,6 x 150 nm), dan kecepatan alir 1 ml/menit.
4. - Analisis kuantitatif = untuk mengetahui kandungan senyawa nipagin dan
nipasol pada sampel.
- Analisis kualitatif = untuk mengetahui kadar dari nipagin dan nipasol pada
sampel.
 Daftar Pustaka
Tim Dosen.2015.Paket Instruksional Praktikum Analisis Farmasi I.Surabaya: FF-
Universitas Airlangga.

Pavlova,V, et all. Simultaneous Determination Of Amphetamine, Metamphetamine,

And Caffeine In Seized Tablets By High-Performance Liquid Chromatography.
Skopje: Institute Of Chemistry.