Bioteknologi ?

Judul :
 PCR merupakan suatu teknik atau metode perbanyakan
(replikasi) DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme.

Saat ini PCR sudah digunakan secara luas

untuk berbagai macam kebutuhan, diantaranya:

a. Isolasi Gen
b. DNA Sequencing
c. Forensik
d. Diagnosa Penyakit
 Manfaat teknik PCR ini berdampak sangat luas terhadap kemajuan
sains dan teknologi secara umum yaitu antara lain sebagai berikut:

1. Memperkuat gen spesifik sebelum diklon.

2. Membuat fragmen gen DNA secara berlimpah
3. Dapat mendeteksi DNA gen virus yang sulit untuk dideteksi
4. Dapat mendeteksi/ mendiagnosis DNA sel embrionik yang mengalami
kelainan sebelum dilahirkan.
5. Bidang kedokteran forensik. Contohnya mendeteksi penyakit yang dapat
menginfeksi, variasi dan mutasi dari gen.
6. Mengetahui hubungan kekerabatan antar spesies atau untuk mengetahui
dari mana spesies tersebut berasal.
7. Melacak asal usul seseorang dengan membandingkan “finger print”
1. Tahap peleburan (melting)/denaturasi. Pada tahap
ini (suhu tinggi, 94–96 °C) ikatan H DNA terputus
(denaturasi) dan DNA menjadi berberkas tunggal.
Biasanya pada tahap awal PCR tahap ini dilakukan
agak lama (sampai 5 menit) untuk memastikan
semua berkas DNA terpisah. Durasi 1–2 menit.
2. Tahap penempelan atau annealing. Primer
menempel pada bagian DNA templat yg
komplementer urutan basanya. Ini dilakukan pada
suhu antara 45–60°C. Penempelan ini bersifat
spesifik. Suhu yang tidak tepat menyebabkan tidak
terjadinya penempelan atau primer menempel di
sembarang tempat. Durasi tahap ini 1–2 menit.

3. Tahap pemanjangan atau elongasi. Suhu untuk

proses ini tergantung dari jenis DNA polimerase
(ditunjukkan oleh P pada gambar) yang dipakai.
Dengan Taq-polimerase, proses ini biasanya
dilakukan pada suhu 76 °C. Durasi waktu 1 menit.
Klik tengah untuk melihat video prinsip kerja PCR
 1. Memiliki spesifisitas tinggi
2. Sangat cepat, dapat memberikan hasil yang sama pada hari yang sama
3. Dapat membedakan varian mikroorganisme
4. Mikroorganisme yang dideteksi tidak harus hidup
5. Mudah di set up

1.Sangat mudah terkontaminasi

2.Biaya peralatan dan reagen mahal
3.Interpretasi hasil PCR yang positif belum tervalidasi untuk semua penyakit
infeksi (misalnya infeksi pasif atau laten)
4.Teknik prosedur yang kompleks dan bertahap membutuhkan keahlian khusus
untuk melakukannya.
Elektroforesis utk pemisahan campuran senyawa yg berbeda
dengan teknik analisis serta pemisahan yang pernah didiskusikan.
Pemisahan tergantung pada ;
•Struktur kimia
•pH,
•Gugus fungsional
•Dan bobot molekulnya.

Analisis ini sangat informatif tentang data:

• Senyawa metabolit maupun senyawa biokimia dengan BM
besar
•Tidak diperlukan jumlah besar, dan pemurnian yang tinggi.
•Dapat digunakan sampel langsung tanpa pemisahan, misalnya
urin dan cairan limpa.
 Menyediakan informasi mengenai ukuran, konfirmasi dan
muatan dari protein dan asam nukleat
 Sebagai metode pemisahan yang dapat digunakan untuk
menentukan komponen dari protein atau asam nukleat setiap
individu
 Pada bidang kepolisian teknik ini digunakan nuntuk
pemeriksaan DNA, karakteristik khusus, misalnya sidik jari.
Sehingga membantu polisi dalam mengungkap sebuah kasus.
 Dalam biologi molekuler, elektroforesis merupakan salah satu
cara untuk memvisualisasikan keberadaan DNA, plasmid, dan
produk PCR.

Kertas sebagai fase diam dan partikel bermuatan yang terlarut
sebagai fase gerak, terutama ion-ion komleks
Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi
konsentrasi sepanjang sistem pemisahan.
Pergerakan partikel dalam kertas tergantung
pada muatan atau valensi zat terlarut, luas
penampang, tegangan yang digunakan,
konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH,
viskositas, dan adsorpsivitas zat terlarut.
Pemisahan ini terjadi akibat adanya
gradasi konsentrasi sepanjang sistem
pemisahan. Pergerakan partikel dalam
kertas tergantung pada muatan atau
valensi zat terlarut, luas penampang,
tegangan yang digunakan, konsentrasi
elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan
adsorpsivitas zat terlarut.
Keunggulan Elektroforesis Kertas

•Proses migrasi lebih cepat

•Pemisahan spot menjadi lebih kecil
•Mudah memisahkan sampel dengan spektrofotometri
•Mudah dilarutkan dalam pelarut dalam jumlah sedikit.

Kekurangan Elektroforesis Kertas

Adanya gangguan yg disebabkan oleh adanya gugus OH- yg

terdapat pada selulosa yg dapat berinteraksi dengan molekul
polar sehingga daya migrasi molekul tersebut terganggu dan
menjadi lebih rendah
 Jika atom akan membentuk ikatan dengan atom lain maka atom
tersebut harus merubah bentuk orbitalnya sehingga memiliki bentuk
dan tingkat energi yang sama.
Molekul CH4
• 6C 1 s2 2s2 2p2
  

Atom C harus menyediakan 4 orbital dengan

e tunggal, karena akan mengikat 4 atom H

6C 1 s2 2s1 2p3    

Hibridisasinya sp3
 Bentuk orbital 2s dan 2p

Bentuk terpisah

S Py Pz
Px
 Bentuk orbital 2s dan 2p

Bentuk terpisah

S Pz
Px Py
 Proses Hibridisasi

S Px Py Pz

Setelah mengalami
hibridisasi
Hibrida
Hibrida siap menerima atom lain.
H

H
H
Karena yang mengalami hibridisasi terdiri 1
orbital S dan 3 orbital P, maka jenis
Hibridisasinya sp3
Bentuk hibridanya Tetrahedral
H

C
H
H H

Antar Orbital dalam molekul saling

tolak menolak sehingga bentuk ruang
geometrinya sangat ditentukan oleh
jumlah Orbitalnya
Prinsip Sekuensing

Sintesis DNA in vitro dengan DNA Polymerase dan penggunaan 2`,

3`dideoxynucleotida.
Hilangnya molekul 3`-OH menyebabkan berthentinya reaksi sintesis untai
DNA pada point dimana molekul dideoxynukleotida disintesis, karena tidak ada reaksi
yang bisa dilakukan tanpa adanya molekul tersebut
Sintesis untai DNA baru diawali pada posisi spesifik dengan menggunakan
primer yang menempel pada ujung 3` pada daerah yang akan disekuensing
Reaksi sintesis DNA menggunakan deoxynucleotida dan dideoxynucleotida
akan menghasilkan beberapa fragment DNA yang memiliki residu nukcleotida yang
serupa
Perbedaan ukuran fragment DNA dapat dianalisis dengan polyacrilamide gel
elektroforesis

Dua Teknik Sekuensing:

Metode Enzymatic (Metode Sanger)
Metode Degradasi Kimiawi (Metode Maxam - Gilbert)
Sekuensing DN
adalah proses penentuan urutan nukleotida pada suatu fragmen DNA. Dewasa ini,
hampir semua usaha sekuensing DNA dilakukan dengan menggunakan metode terminasi
rantai yang dikembangkan oleh Frederick Sanger. Teknik tersebut melibatkan terminasi
atau penghentian reaksi sintesis DNA in vitroyang spesifik untuk sekuens tertentu
menggunakan substrat nukleotida yang telah dimodifikasi.
Pada metode sekuensing terminasi rantai (metode Sanger), perpanjangan atau ekstensi
rantai DNA dimulai pada situs spesifik pada DNA cetakan dengan menggunakan
oligonukleotida pendek yang disebut primer yang komplementer terhadap DNA pada
daerah situs tersebut. Primer tersebut diperpanjang menggunakan DNA polimerase, enzim
yang mereplikasi DNA. Bersama dengan primer dan DNA polimerase, diikutsertakan pula
empat jenis basa deoksinukleotida, juga nukleotida pemutus atau penghenti rantai
(terminator rantai) dalam konsentrasi rendah. Penggabungan nukleotida pemutus rantai
tersebut secara terbatas kepada rantai DNA oleh polimerase DNA menghasilkan fragmen-
fragmen DNA yang berhenti bertumbuh hanya pada posisi pada DNA tempat nukleotida
tertentu tersebut tergabungkan. Fragmen-fragmen DNA tersebut lalu dipisahkan menurut
ukurannya dengan elektroforesis.
Metode sekuensing DNA yang lain adalah metode Maxam dan Gilbert yang didasari oleh
modifikasi kimiawi DNA yang dilanjutkan dengan pemotongan DNA.
Sekuensing
RNA lebih tidak stabil daripada DNA di dalam sel dan lebih rentan
terhadap penguraian oleh enzim nuklease secara laboratorium.
Dalam sekuensing RNA, metode yang umum digunakan adalah
mula-mula membentuk fragmen DNA dari RNA tersebut dengan
enzim transkrip balik. Misalnya, DNA dapat disintesis dari cetakan
mRNA dan disebut sebagai DNA komplementer. Fragmen DNA
tersebut kemudian dapat disekuensing dengan cara seperti yang
disebutkan di atas.
Sekuensing protein atau sekuensing peptida adalah penentuan urutan
asam anino pada suatu protein atau peptida (oligopeptida maupun
polipeptida). Metode untuk sekuensing protein umumnya melibatkan
pemutusan ikatan yang diikuti dengan identifikasi asam amino.
Pada metode degradasi Edman, residu
pada ujung-N (ujung
amino) protein dipotong satu per satu
dengan reaksi kimia. Setelah setiap
pemotongan, residu as. amino yang telah
dipotong tersebut dapat diidentifikasi
menggunakan kromatografi. Prosedur
tersebut diulangi untuk setiap residu asam
amino. Kelemahan metode ini adalah
bahwa polipeptida yang di-sekuensing tidak
dapat lebih panjang dari 50–60 residu
(dapat disiasati dengan memotong-motong
polipeptida berukuran besar menjadi
peptida-peptida berukuran lebih kecil
sebelum dilakukan reaksi).
 Sekuensing Polisakarida

Walaupun polisakarida juga merupakan biopolimer (yang termasuk

dalam karbohidrat dengan monomer monosakarida, tidaklah lazim untuk
melakukan 'sekuensing' polisakarida, karena beberapa alasan. Walaupun
banyak polisakarida yang berstruktur rantai lurus, banyak pula yang
berstruktur bercabang. Terdapat banyak sekali jenis monosakarida yang
dapat menyusun polisakarida dengan banyak macam cara ikatan kimia pula.
Selain itu, alasan teoretis utama ketidaklaziman sekuensing polisakarida
adalah bahwa masing-masing polimer lain yang disebutkan di atas secara
umum dibentuk oleh satu jenis enzim berdasarkan 'cetakan' tertentu,
sedangkan satu penggabungan monomer pada polisakarida dapat dibentuk
oleh berbagai jenis enzim. Sering kali pembentukan ikatan polimer
polisakarida tidaklah spesifik; bergantung pada enzim yang beraksi, satu
dari beberapa jenis monomer dapat digabungkan. Hal ini dapat
mengakibatkan terbentuknya sekelompok molekul yang mirip satu sama
lain.
Antibodi monoklonal adalah antibodi monospesifik yang dapat
mengikat satu epitop saja. Antibodi monoklonal ini dapat dihasilkan
dengan teknik hibridoma. Sel hibridoma merupakan fusi sel dan sel.
Pembuatan sel hibridoma terdiri dari tiga tahap utama yaitu imunisasi,
fusi, dan kloning.

Imunisasi dapat dilakukan dengan imunisasi konvensional, imunisasi

sekali suntik intralimpa, maupun imunisasi in vitro.

Fusi sel ini menghasilkan sel hibrid yang mampu menghasilkan antibodi
seperti pada sel limpa dan dapat terus menerus dibiakan seperti sel
myeloma. Frekuensi terjadinya fusi sel ini relatif rendah sehingga sel
induk yang tidak mengalami fusi dihilangkan agar sel hasil fusi dapat
tumbuh.
Frekuensi fusi sel dapat diperbanyak dengan menggunakan Polietilen
glikol (PEG), DMSO, dan penggunaan medan listrik. PEG berfungsi
untuk membuka membran sel sehingga mempermudah proses fusi. Sel
hibrid kemudian ditumbuhkan pada media pertumbuhan.[Penambahan
berbagai macam sistem pemberi makan dapat meningkatkan
pertumbuhan sel hibridoma.
 Any
question...
!!!
 Rizki.2012.Bahan Ajar Bioteknologi.Rios Multicipta.Padang

http://www.wikipedia.co.id/

https://www.youtube.com/watch?v=iQsu3Kz9NYo
Diakses : 25/2/15 16:42

https://www.youtube.com/results?search_query=elektroforesis
Diakses : 25/2/15 17:25

Sumber Lain yang Relevan

• Mahasiswa dapat menjelaskan prinsip dari PCR,
elektroforesis, hibridisasi, sekuensing dan antibodi
monoklonal
• Mahasiswa dapat menjelaskan prinsip dari teknik biologi
molekuler seperti isolasi DNA, isolasi protein, isolasi enzim, dll
• Mahasiswa dapat menegtahui manfaat dari teknik rekombinasi
DNA