TM KE 6

PARAMETER DAN METODE UJI

EKSTRAK
(Metode Uji Parameter Non Spesifik)

TIM DOSEN STANDARISASI DAN PENENTUAN MARKER OBA

 Parameter Non Spesifik
 Adalah semua aspek yang tidak terkait dengan
aktifitas farmakologi secara langsung namun
mempengaruhi aspek keamanan dan stabilitas
ekstrak serta sediaan yang dihasilkan
 Standarisasi dan analisis aspek nonspesifik diarahkan
pada batas maskimal yang diperkenan-kan terhadap
material berbahaya yang ada di dalam ekstrak
 Parameter Non Spesifik
Meliputi :
1. Penetapan Kadar Air
2. Penetapan Susut Pengeringan
3. Penentuan Bobot Jenis
4. Penetapan Sisa Pelarut
5. Penetapan Kadar Abu
6. Penetapan Cemaran Mikroba
7. Penetapan Cemaran Logam Berat
8. Penetapan Residu Pestisida
 1. Penetapan Kadar air

 Tujuan : menetapkan residu air setelah proses

pengentalan atau pengeringan
 Pengukuran kadar air ditentukan dengan
metode:
1. Titrasi (langsung dan tidak langsung), pereaksi
yg digunakan adalah Karl-Fischer
2. Destilasi, pereaksi yang digunakan adalah toluen
3. Gravimetri (tidak sesuai untuk ekstrak dgn
kandungan minyak atsiri tinggi)
 Penetapan Kadar
air (lanjutan)
Titrasi langsung
±20 ml methanol (dalam labu
titrasi)  dititrasi dengan Karl
Fischer s/d TAT  masukan
(dgn cepat) zat (mengandung
±10-50 mg air)  aduk 1
menit  titrasi dgn Karl
Fischer yg telah diketahui
kesetaraan airnya
Sumber gambar: google image
Titrasi tidak langsung
±20 ml methanol (dalam labu
titrasi)  dititrasi dengan Karl
Fischer s/d TAT  masukan (dgn
cepat) zat (mengandung ±10-50
mg air)  aduk 1 menit 
tambahkan Karl Fischer berlebih
yg diukur seksama  titrasi dgn
baku air-metanol
 Penetapan
Kadar air
b. Destilasi (lanjutan)

Sumber gambar: Depkes RI. 2000. Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan, Jakarta
c. Metode Gravimetri (= susut pengeringan)
 Cawan kosong dipanaskan dalam oven pada suhu 105 0C selama 30
menit, didinginkan dalam eksikator selama 15 menit, lalu ditimbang
(W0).
 Masukkan + 10 gr ekstrak dalam wadah yg telah tara (W1).
 Keringkan dalam oven pada suhu 105 oC selama 3 jam  didinginkan
dalam eksikator selama 15-30 menit  timbang
 Lanjutkan pengeringan dan timbang dg jarak 1 jam sampai perbedaan
antara 2 penimbangan berturut2 tdk lebih dari 0,25% (W2).
Kadar air (%) = (W1 – W2) x 100
(W1 – W0)
 2. Penetapan Susut Pengeringan
 Prinsip : Pengukuran sisa zat setelah pengeringan pada
temperatur 105 oC selama 30 menit atau sampai berat
konstan yang dinyatakan sebagai nilai prosen (%)
 Dalam hal khusus, jika bahan tdk mengandung minyak
menguap/m. atsiri & sisa pelarut organik menguap maka
identik dg kadar air yaitu kandungan air karena berada di
atmosfer/lingkungan udara terbuka
 Tujuan : memberi batasan maksimal (rentang) tentang
besarnya senyawa yg hilang pd proses pengeringan
2. Penetapan Susut Pengeringan
Cara:
 botol timbang dangkal bertutup
dalam kondisi kosong
dipanaskan 105 °C selama 30
menit, dinginkan & tara 
 masukan 1-2 g ekstrak, ratakan
 masukan ke dalam oven,
buka tutupnya, keringkan pada
suhu 105 °C selama 30 menit 
 dlm keadaan tertutup dinginkan
dlm eksikator hingga suhu
kamar, timbang.
Catatan:
 Sebelum tiap pengeringan, biarkan botol dalam keadaan
tertutup mendingin dalam eksikator
 Jika sulit kering dan mencair pada pemanasan,
tambahkan 1 g silika yg telah ditimbang seksama
(sebelumnya silika dikeringkan dan disimpan dulu dalam
eksikator sampai suhu kamar)  campuran ekstrak+silika
dipanaskan lagi pada suhu tersebut sampai bobot tetap
 Lakukan hingga bobot tetap: perbedaan 2x penim-bangan
berturut-turut setelah dikeringkan/dipijar selama 1 jam <
0,25% atau perbedaan penimbangan tsb <0,5 mg
 3. Penentuan Bobot Jenis
 Prinsip : masa persatuan volume pada suhu kamar
tertentu (25 °C) yang ditentukan dg alat khusus
piknometer atau alat yg lainnya
Tujuan :
 memberikan batasan tentang besarnya masa per
satuan volume yg merupakan parameter khusus
ekstrak cair sampai ekstrak pekat (kental) yg masih
dapat dituang
 Memberikan gambaran kandungan kimia terlarut
3. Penentuan Bobot jenis
Prosedur:
piknometer (dlm kondisi bersih, kering dan
telah dikalibrasi), ditimbang  Ekstrak cair
(suhu ±20 °C) dimasukan ke dalam
piknometer  atur suhu piknometer+ekstrak
hingga suhu ±25 °C), tutup  buang
kelebihan ekstrak cair  piknometer+ekstrak
ditimbang. Lakukan hal yg sama thdp air.

Cara hitung:
BJ = pikno+ekstrak/pikno+air x BJ air

Sumber gambar: google image

 4. Penetapan Sisa Pelarut
 Tujuan : menetapkan kandungan sisa pelarut tertentu
setelah pengeringan
 Metode: destilasi (penetapan kadar etanol), atau metode
lain seperti: Kromatografi gas-cair (kolom kaca berisi S3;
gas pembawa = Nitrogen/Helium; detektor = FID)
 Nilai: maksimal yg diperbolehkan, namun jika pelarut tsb
berbahaya (co: kloroform) maka nilainya harus negatif
5. Penetapan Kadar
Abu
 Tujuan : memberikan gambaran
kandungan mineral internal dan
eksternal yang berasal dari proses
awal sampai terbentuknya ekstrak
 Kadar abu dinyatakan dalam % (b/b)
 Prosedur :
 Penetapan kadar abu total,
 penetapan kadar abu yang tidak
larut dalam asam
 Penetapan kadar abu larut asam
Sumber gambar: google image
 5. Penetapan Kadar Abu
(lanjutan)
a. Penetapan kadar abu total
Pijar dan tara krus silikat  2-3 g ekstrak (telah digerus)
dimasukan ke dlm krus silikat, ratakan  pijar perlahan suhu
500-600°C hingga arang habis (jadi abu putih), dinginkan dlm
desikator, timbang.

Catatan:
- Jika arang tidak hilang: tambahkan air panas 2 ml  saring
dgn kertas saring bebas abu  filtrat masukan Kembali dlm
krus, uapkan dgn waterbath, pijarkan kembali bersama kertas
tersebut dalam krus yg sama hingga bobot tetap, timbang.
 5. Penetapan Kadar Abu
(lanjutan)
b. Kadar abu larut dalam air
(jumlah garam mineral organik dalam ekstrak: asam oklasat, asam malat, dsb)
 Abu yang diperoleh dari kadar abu total, didihkan dengan 25
ml aquades (tutup dgn kaca arloji) selama 5 menit
 Kumpulkan bagian yang tidak larut dalam air, saring dengan
kertas saring bebas abu
 Bilas dengan dgn air panas, pijarkan bahan yg larut air
dalam krus di dalam oven pada suhu >450 °C selama 15
menit hingga bobot tetap, dinginka dlm desikator 30 menit
dan ditimbang
 Hitung kadar abu yang tidak larut asam terhadap bahan yang
telah dikeringkan
 5. Penetapan Kadar Abu
(lanjutan)
c. Kadar abu tidak larut dalam asam
Tujuan: ukur keberadaan cemaran silika dari pasir/tanah
 Abu yang diperoleh dari kadar abu total, didihkan dengan 25
ml H2SO4 / HCl encer P (tutup dgn kaca arloji) selama 5
menit
 Kumpulkan bagian yang tidak larut dalam asam, saring
dengan kertas saring bebas abu
 Cuci dgn air panas, pijarkan kertas saring yang mengandung
bahan yg tidak larut asam dalam krus di atas hotplate hingga
bobot tetap, dinginka dlm desikator 30 menit dan ditimbang
 Hitung kadar abu yang tidak larut asam terhadap bahan yang
telah dikeringkan
6. Penetapan Cemaran Mikroba
 Definisi: menentukan adanya mikroba patogen
secara analisis mikrobiologi
 Tujuan: memberikan jaminan bahwa ekstrak tidak
boleh mengandung mikroba patogen dan non
patogen melebihi batas yang ditetapkan  akan
berpengaruh pd stabilitas ekstrak dan berbahaya
bagi kesehatan
 Mikroba patogen : Salmonella thypi, E. Coli,
Bacillus subtilis, Aspergillus flavus, S.aureus
 Batasan cemaran mikroba:
a) ALT : < 104 kol/g
b) Angka kapang /kamir : < 103 kol/g
c) MPN coliform : < 3 kol/g
d) Mikroba patogen : negatif
 Prosedurnya :
1. Uji Angka Lempeng Total
2. Uji Nilai Duga Terdekat (MPN) Coiliform
 Sterilisasi Ekstrak
1. Merendam semua ekstrak ke dalam etanol 70%
semalam kemudian diuapkan dengan tangas air
stainless
2. Semua ekstrak disterilkan dengan sinar UV - 18
jam
Penetapan Angka Lempeng Total (ALT)
 Prinsip: pertumbuhan koloni bakteri aerob mesofil
setelah cuplikan diinokulasikan pada media
lempeng agar dengan cara tuang dan diinkubasi
pada suhu yang sesuai.
 Media : Plate Count Agar (PCA)
 Pereaksi : Pepton dilution Fluid (PDF), Fluid
Casein Digest Soy Lecithin Polysorbat (FCDSLP),
minyak mineral (parafin cair), tween 80 dan 20
 Prosedur : Monografi ekstrak tumbuhan obat
Indonesia, 2006 hal 219
 Penghitungan : dipilih cawan petri yang
menunjukkan jumlah koloni 30 - 300. Jumlah
koloni dihitung kemudian dirata-rata dan dikalikan
dengan faktor pengencerannya. Hasil dinyatakan
dengan ALT dalam tiap gram.
Prosedur ALT

Sumber gambar : google image

Uji Nilai Dugaan Terdekat (MPN) Coliform
 Prinsip: melihat adanya pertumbuhan bakteri coliform
setelah cuplikan diinokulasi pada media yang sesuai.
 Adanya reaksi fermentasi dan pembentukan gas di
dalam tabung durham menandakan adanya bakteri
coliform
 Media dan Pereaksi : PDF, MCB/LB, BGLB, EMBA,
VRBA, MR-VP, Trypton Broth, Simmon’s Citrate Agar,
Nutrient agar
 Ada 3 tahap :
1. Uji Prakiraan / Presumtive Test  memakai media Mac
Conkey Broth (MCB) atau Lactosa Broth (LB) dalam
tabung reaksi yg didalam nya ada tb durham  inokulasi
sample dan inkubasi 24 - 48 jam pd suhu 37oC  yg
positif lanjut ke uji konfirmasi
2. Uji Konfirmasi  memakai media BGLB dalam tabung
reaksi yg didalam nya ada tb durham  inokulasi sample
dan inkubasi 24 - 48 jam pd suhu 37oC  jumlah tabung
yg positif dirujuk dalam tabel MPN (Tabel MPN
menyatakan jumlah bakteri coliform dalam tiap gram
contoh yg diuji
3. Uji Lengkap : dg media selektif

Complete Test pada

Presumptive Test Confirmed Test media selektif
pada media LB pada media BGLB
Sumber gambar : google image
• Dari sample
dipipetkan ke
tabung reaksi yg
berisi media & tb
durham
• Inkubasi pada
suhu 37C selama
24 – 48 jam

Sumber gambar : google image

• Tabel MPN

Jika semua tabung

positif (3 3 3) maka
nilai MPN > 2400

Sumber gambar : google image

 Penetapan Angka Kapang dan
Khamir
 Prinsip: menentukan adanya jamur secara
mikrobiologis
 Tujuan: memberikan jaminan bahwa ekstrak tidak
mengandung cemaran jamur melebihi batas yang
ditetapkan
 Media : Potato Dextrosa agar (PDA), Czapek Dox
Agar (CDA) atau malt agar, air suling agar 0,05%
(ASA)
• Prosedur : Monografi ekstrak tumbuhan obat
Indonesia, 2006 hal 222
• Penghitungan : jika pada pengenceran 10-4
terdapat sebanyak 40 koloni, maka nilai AKK
adalah 40 x 10-4 = 40.10-4 koloni per gram
 Penetapan Keberadaan
Aspergillus flavus
• Aspergillus flavus adalah jamur
penghasil metabolit aflatoksin
(bersifat hepatotoksik)
• Media: Potato Dekstrosa Agar (PDA),
Czapex Dox Agar (CDA), dan Air
suling agar (ASA)
• Inkubasi: 5-7 hari pada suhu ruang.
• Keberadaannya ditandai dengan
koloni berwarna hijau kekuningan Sumber gambar : google image
sangat cerah
 Penetapan Cemaran Aflatoksin
 Prinsip : pemisahan isolat aflatoksin secara KLT
 Metode: KLT (kualitatif)
 fase diam = silika gel
 Fase gerak = kloroform:aseton:heksana (85:15:20)
 pembanding: aflatoksin B1, B2, dan G1, G2
 deteksi: sinar UV 366 bercak berwarna biru/hijau
kebiruan
 jika positif (secara kualitatif), maka dapat ditetapkan
kadarnya dengan metode KLT-densitometer atau HPLC
 Hasil Reaksi IMVIC Bakteri E.coli
V
I M
VOGES C
INDO METIL- BAKTERI
PROSKAU CITRAT
L MERAH
ER
+ + - - E. Coli tipikal
- + - - E. Coli atipikal
+ + - + Intermediat
tipikal
- + - + Intermediat
atipikal
- - + + E. aerogenes
tipikal
+ - + + E. aerogenes
Sumber gambar : google image atipikal

Uji IMViC merupakan sebuah uji biokimia yang berguna dalam

mengidentifikasi bakteri enterobacteriaceae.
IMViC terdiri dari Indole, Methyl Red, Voges Praskauer, dan Citrat.
 Uji Salmonella sp
 Pada TSIA (Triple Sugar Iron Agar) :
warna merah pada permukaan agar,
warna kuning pada dasar tabung dengan
atau tanpa pembentukan hidrogen
sulfida
 Pada LIA (lysine Iron Agar) : terlihat
warna ungu, bila permukaan berwarna
ungu sedangkan bagian dasar warna
kuning, dianggap negatif Sumber gambar : google image
 Uji serologi : terjadi aglutinasi
untuk melihat ada atau tidaknya paparan antigen
yang menyebabkan gumpalan partikel dalam darah
7. Penetapan Kadar Cemaran Logam Berat
 Prinsip: menentukan kandungan logam berat dg SSA
(Spektrofotometri Serapan Atom)
 Kadar logam berat dalam sisa abu total meliputi Pb, Cd, Hg, As,
dsb.
 Penetapan kadar dengan menggunakan digesti basah sistem
terbuka:
1.Timbang 200-250 mg simplisia yang dikering anginkan,
masukkan ke dalam krus silika. Tambahkan 1,0 ml campuran
digesti ( 2 bagian asam nitrat (1000g/L) dan 1 bagian asam
perkolat (1170 g/L) )
2. Tutup krus silika tanpa menggunakan tekanan dan
masukkan kedalam tanur yang mempunyai pengatur suhu
dan waktu
3. Panaskan perlahan lahan hingga 102o C selama 2 jam
4. Naikkan suhu pelan-pelan hingga 240o C, pertahankan
selama 4 jam
5. Larutkan residu inorganik dalam 2,5 ml asam nitrat (1000
g/L) LP dan gunakan untuk uji penetapan kadar logam
berat.
6. Bandingkan dengan larutan blanko
7. Penetapan kadar dengan spektrofotometri serapan atom (AAS)
8. Penetapan Cemaran Residu Pestisida
 prinsip: menentukan kandungan sisa pestisida yang
mungkin pernah ditambahkan atau mengkontaminasi pada
bahan simplisia yang dibuat menjadi ekstrak
 tujuan: memberikan jaminan bahwa ekstrak tidak
mengandung pestisida melebihi batas yang ditetapkan
 METODE I : metode analisis multiresidu pestisida organoklor
(DDT) dan organofosfat (diazinon)  kadar < 5g/kg sampel
 Metode: GC-MS atau GC-FID
 METODE II : dengan KLT menggunakan fase diam
alumina dan deteksi fotokimiawi
 Fase diam : Aluminium oksida (AL2O3) netral atau
lempeng KLT alumina dengan ketebalan 0,25 cm
 Fase gerak :
 Pestisida organoklor = campuran aseton : n –
heptana (2:98 v/v)
 Pestisida organofosfat = metilsikloheksana
 Pereaksi semprot :
 Pestisida organoklor : pereaksi kromogenik ( 0,1 gram AgNO3
dalam 1 ml air, ditambah 20 ml 2-fenoksietanol dan encerkan
dengan aseton ad 200 ml, campur tambahkan 1 tetes H2O2 30%.
Simpan ditmepat gelap semalam kemudian dienaptuangkan
kedalam botol penyemprot
 Pestisida organofosfat : pereaksi kromogenik a. 1 g tetrabromo-
fenolftalein etil ester dalam 100 ml aseton. Encerkan 10 ml larutan
ini dengan aseton ad 50 ml
 Larutan perak nitrat : Larutkan 0,5 gram AgNO3 dalam 25 ml air dan
encerkan dengan aseton ad 100 ml
 Larutan asam sitrat : 5 gram sitrat granil dalam 50 ml air dan
encerkan dengan aseton ad 100 ml
 Pemaparan
 Pestisida organoklor : dengan UV dan baku
pembanding terlihat jelas setelah 15-20 menit
 Pestisida organofosfat : bercak biru muda atau
ungu diatas dasar kuning
TERIMAKASIH