Mutasi Gen embB Isolat Klinis L16 dan L21

Multidrug Resistant Mycobacterium tuberculosis

Icha Isana Febriana / 10506067

Pembimbing : Achmad Saifuddin Noer, Ph.D

19 November 2014

Seminar Tugas Akhir

1 of 21

AGENDA PRESENTASI
PENDAHULUAN
METODE
PENELITIAN
HASIL

PEMBAHASAN

KESIMPULAN
2 of 21

19 November 2014
Seminar Tugas Akhir

PENDAHULUAN

Mycobacterium tuberculosis
(M. tb) adalah bakteri
penyebab tuberkulosis (TB)
pada manusia

Setiap tahun, TB menginfeksi

9 juta jiwa dan membunuh 1,5
juta jiwa di dunia (WHO, 2008)
Salah satu faktor
meningkatnya infeksi TB di
dunia disebabkan oleh mutasi
M. tb di tingkat genotipe
19 November 2014

Seminar Tugas Akhir

3 of 21

Mycobacterium tuberculosis
M. tb adalah bakteri patogen utama
yang menyerang sistem pernafasan
mamalia
Bakteri M. tb berbentuk basil (batang)
dan bersifat tahan asam
Bakteri ini mampu bertahan beberapa
jam di tempat gelap, lembab, dan dapat
bersifat dormant (tidur) di dalam tubuh
manusia.
19 November 2014

Seminar Tugas Akhir

4 of 21

Peta Genom M. tb

Genom M.tb berukuran 4,4 x 106 pb dan memiliki >> 4000

gen
Operon embCAB 10 kb
19 November 2014

Seminar Tugas Akhir

5 of 21

Tuberkulosis
Tuberkulosis adalah salah satu penyakit mematikan
(www.TBCindonesia.or.id)

19 November 2014

Seminar Tugas Akhir

6 of 21

Obat Anti Tuberkulosis

OAT yang tersedia untuk menangani TB terdiri dari 2
jenis :
a. lini pertama : isoniazid, rifampisin, pirazinamid,
etambutol dan streptomisin
b. lini kedua :
etionamid, kanamisin, quinolones, dll.
Etambutol bekerja dengan
cara menghalangi
Struktur Etambutol
pembentukan dinding sel bakteri

19 November 2014

Seminar Tugas Akhir

7 of 21

Etambutol
Sasaran etambutol adalah protein
arabinosiltransferase yang dikode oleh gen embB pada
operon embCAB
gen embB memiliki ukuran 3297 pb
Diketahui bahwa sebagian besar mutasi yang
mengakibatkan resistensi terhadap etambutol terjadi
pada kodon 306 dari gen embB (Sreevatsan dkk.,
1997)
19 November 2014

Seminar Tugas Akhir

8 of 21

Diagram Alir Penelitian

Koleksi Isolat
MDR-M. tb

Isolat L16
dan L21

Pemilihan Sampel

Isolat M. tb Koleksi Laboratorium Biokimia, ITB

Amplifikasi
Berhasil

Elektroforesis Gel
Agarosa

R3,
R11, R12, fragmen
R13, L13, L15,
Amplifikasi
gen
R9, L14 (STR, KN, ETM,
embB dengan PCR
PYR)
L1, L6, L9, L16, L10, L19, L25, L26
(STR, ETM)

Sequencing

Urutan
Nukleotida
Fragmen
Gen embB

L21, R4, L2, L28, R2, L3, L5,

L11, L12 (ETM)

Analisis In Silico

Lainnya

Kode L : BPLK ; Kode R : RS. Rotinsulu, Bandung

Sampel L16 : Mutasi C1594T pada gen rpoB (Ser Leu) (Noviana, 2007)
Data(Noviana, 2007)
Sampel
L21
: Mutasi pada gen katG294T884C (mutasi bisu)
19
November
2014
9 of 21
Akhir
Mutasi C1594TSeminar
pada Tugas
gen rpoB
(Ser Leu) (Noviana, 2007)

Metode Penelitian
PCR

ELEKTROFORESIS
GEL AGAROSA

Pembuatan master mix PCR

Amplifikasi fragmen gen embB dengan kondisi PCR
yang telah ditentukan

Pembuatan gel agarosa (agarosa, TAE 1x, EtBr)

= 312 nm, dengan marker pUC19/HinfI

SEQUENCING

Metode dideoksi Sanger dan mengikuti

prosedur BigDye Terminator oleh Macrogen
Inc., Korea

ANALISIS IN SILICO

Analisis in silico menggunakan program EditSeq dan

SeqMan dari DNASTAR versi 4.0.0

19 November 2014

Seminar Tugas Akhir

10 of 21

Polymerase Chain Reaction

19 November 2014

Seminar Tugas Akhir

11 of 21

Kondisi PCR

95,0
5,00

95,0
1,00

72,0

72,0

1,00

1,00

72,0
4,00

4,0

19 November 2014

Seminar Tugas Akhir

12 of 21

Posisi Penempelan Primer

Urutan primer yang digunakan (Clemente dkk., 2008):
embF : 5 GGTGCGCGCCATGCCACC 3 (261-278)
embR : 5 GGTCTGGCAGGCGCATCC 3 (1046-1063)
Posisi Penempean Primer

261

1063

embR
3

embF

0,8 kb
19 November 2014

Seminar Tugas Akhir

13 of 21

HASIL : Pita Elektroforesis

1419

(-)

H37Rv
(+)

L21

pUC19/HinfI

Isolat L21
H37Rv
(+)
(-)

L16

L16

pUC19/HinfI

Isolat L16

1419
0,8 kb

519

519

397

397

214

214

75

0,8 kb

75

19 November 2014

Seminar Tugas Akhir

14 of 21

Elektroforegram Isolat L16

19 November 2014

Seminar Tugas Akhir

15 of 21

Analisis Hasil Sequencing Isolat L16

Isolat L16

19 November 2014

16 of 20
Seminar Tugas Akhir

Analisis Hasil Sequencing Isolat L21

19 November 2014

Seminar Tugas Akhir

17 of 21

Terjemahan Ke Bahasa Protein

19 November 2014

Seminar Tugas Akhir

18 of 21

PEMBAHASAN
Pada isolat L16, tidak terdapat mutasi di kodon
306 dari gen embB. Sifat resistensi etambutol
dapat melibatkan beberapa gen lain, selain embB
(Telenti dkk., 1997).
Clemente (2008) : hanya 70% dari keseluruhan
EMB resisten menunjukkan mutasi embB

19 November 2014

Seminar Tugas Akhir

19 of 21

PEMBAHASAN
Pada isolat L21, perubahan urutan nukleotida pada kodon
306 :
ATG GTG

Kodon 306 dan sekitarnya menjadi lebih hidrofob. Hal

inilah yang diduga menjadi penyebab EMB sulit terikat dan
tidak mampu menginhibisi pembentukan dinding sel
bakteri.
19 November 2014

Seminar Tugas Akhir

20 of 21

KESIMPULAN
Sifat resistensi M. tb terhadap etambutol tidak selalu
akibat adanya mutasi pada kodon 306.
Kodon 306 merupakan hot spot penyebab resistensi
etambutol.
Daerah kodon 306 dapat digunakan untuk
pengembangan diagnostik kit untuk deteksi M. tb yang
resisten etambutol

19 November 2014

Seminar Tugas Akhir

21 of 21