FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS ANDALAS

VALIDASI METODE ANALISIS

Harrizul Rivai

PENDAHULUAN
Validasi metode analisis adalah proses pengujian karakter kinerja metode
analisis melalui serangkaian uji laboratorium.

Tujuan: untuk menjamin bahwa metode analisis yang digunakan mampu

memberikan hasil yang cermat dan handal hingga dapat dipercaya.
Parameter validasi metode analisis yang harus diuji:
1. Kecermatan (akurasi)
2. Keseksamaan (presisi)
3. Selektivitas (Spesifisitas)
4. Linearitas dan rentang
5. Batas deteksi dan batas kuantitasi
6. Ketangguhan metode (Ruggedness)
7. Kekuatan (Robustness)

KECERMATAN (ACCURACY)
Kecermatan adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analisis dengan
kadar analit yang sebenarnya.
Cara penentuan kecermatan:
1.

Metode simulasi (spiked-placebo recovery): Analisis kadar analit yang

ditambahkan ke dalam matriks sampel (plasebo) yang dianalisis

2.

Metode penambahan baku (standard addition method): Jika matriks dan eksipien
tidak tersedia, maka akurasi dinyatakan sebagai persen perolehan kembali kadar
analit yang ditambahlkan pada produk jadi yang sudah mengandung analit.

3.

Analisis kadar analit dengan metode yang divalidasi terhadap sampel yang telah
diketahui kadarnya. Sampel yang digunakan adalah sampel acuan baku yang
dikeluarkan badan resmi ( SRM dari NIST, dll)

4.

Membandingkan hasil analisis analit dengan metode yang divalidasi terhadap hasil
dengan metode standar (cara grafik)

KRITERIA PENERIMAAN AKURASI *)

Jenis uji

Level
konsentrasi

Rentang

Kriteria

Penetapan
kadar dalam
bahan baku
atau sediaan
jadi

3 level, dengan
3 kali pengujian

70%, 100%,
130 %
(80%, 100%,
120%)

Bias : + 2%
Rekoveri:
98,0 102,0%

Disolusi

3 level dengan 3 20 35 %
kali pengujian
50 80 %
100 130 %

Bias : + 5%
Rekoveri:
95,0 105,0 %

Penetapan
kadar Cemaran

1 level dengan 3 LOQ 1%

kali pengujian

Bias : + 20,0%
Rekoveri:
80,0 120,0 %

*) Handbook of Pharmaceutical analysis by HPLC

% RECOVERY YANG MASIH DAPAT DITERIMA TERGANTUNG

JUMLAH ANALIT DALAM MATRIKS CONTOH

No
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

Konsentrasi analit
dalam matriks contoh
100 %
10 %
1%
0.1 %
100 ppm
10 ppm
1 ppm
100 ppb
10 ppb
1 ppb

Rentang
% Recovery rata-rata
98 102
98 102
97 103
95 - 105
90 107
80 110
80 110
80 110
60 115
40 - 120

Perhitungan Recovery

1. Spiked placebo recovery

% Rec = Ch/Cs x 100%
Ch = kadar analit yang dihitung dari metode yang divalidasi,
Cs = kadar analit teoritis
2. Standard addition method

Ch = {(R2 R1)/R1}x C
% Rec = {Ch/Ca} x 100
Ch = Analit baku (SRM) yang ditambahkan pada produk jadi

C = kadar analit dalam sampel produk jadi

R2, R1 = respon R1 oleh sampel produk jadi, respon R2 oleh sampel yang telah ditambah analit baku
Ca = kadar analit yang sebenarnya ditambahkan

KESEKSAMAAN (PRESISI)

Presisi adalah tingkat kesesuaian antara hasil analisis individual jika prosedur dilakukan
berulang kali terhadap sampel ganda atau beberapa sampel yang homogen

Presisi metode analisis dinyatakan sebagai simpangan baku relatif (RSD) atau koefisien
variasi (KV).
Ada tiga jenis presisi, yaitu: repeatability (keterulangan), presisi antara dan reprodusibilitas
(ketertiruan)
a. Repeatability (keterulangan)

Keterulangan adalah kemampuan metode untuk memberikan hasil analisis yang sama untuk beberapa
sampel yang kadarnya sama yang dilakukan oleh satu orang analis pada waktu tertentu terhadap
beberapa sampel yang sama
Keterulangan diukur terhadap 6 jenis sampel dengan konsentrasi sama (100% dari konsentrasi aktual)
atau 3 jenis sampel dengan konsentrasi 80, 100, 120% dari konsentrasi aktual yang ditetapkan masingmasing tiga kali (triplikasi) (menurut ICH).

KESEKSAMAAN (PRESISI)
b. Presisi antara (intermediate precision)
Presisi antara adalah pengukuran kinerja metode di mana sampel-sampel diuji dan dibandingkan,
dilakukan oleh analis yang berbeda, menggunakan peralatan berbeda dan pada hari yang berbeda.
Presisi antara tidak perlu diuji jika kajian reprodusibilitas telah dilakukan. Nama lain presisi antara
adalah Ruggedness
c. Reprodusibilitas (ketertiruan)

Uji ketertiriuan merupakan pengujian presisi yang terakhir dan tuntas.

Reprodusibilitas diuji dengan cara menyiapkansampel yang homogen dan stabil, lalu diuji oleh
beberapa laboratorium (studi kolaboratif). Hasil ini akan memperlihatkan adanya galat acak yang
disebabkan oleh sampel dan laboratorium, serta galat sistematik. Datanya diolah dengan uji ANOVA
d. Presisi sistem atau instrumen
Keragaman dalam pengukuran menggunakan suatu instrumen akan memberikan kontribusi pada
presisi sistem. Oleh karena itu sistem yang digunakan harus diuji kesesuaiannya meliputi misalnya
keterulangan penyuntikan pada Kromatografi

Kriteria penerimaan presisi *)

Repeatabilitas dan presisi antara

Pengujian

Level dan
Rentang konsentrasi

Kriteria

Penetapan
kadar/keseragaman
kandungan

3 level dengan 3 kali

(70, 100, 130%)
atau
6 penetapan pada
100%

RSD < 2,0%

Disolusi

12 sampel kadar
rendah

RSD < 20%

Penetapan kadar
Cemaran

6 replikat pada LOQ

dan batas toleransinya

RSD < 20,0%

*) Handbook of Pharmaceutical Analysis by HPLC

Dasar Perhitungan Presisi

RSD

SD
100%
x

SD

2
( xi x )
n 1

xi
n

PRESISI DAPAT DIPEROLEH DENGAN MENGGUNAKAN SAMPEL OTENTIK

YAITU SAMPEL YANG DIBUAT DENGAN MENCAMPURKAN ANALIT (BAHAN
ACUAN) DENGAN MATRIKS ATAU PLASEBO.

PARAMETER YANG DIPERGUNAKAN UNTUK MENYATAKAN PRESISI ADALAH

SIMPANGAN BAKU (SD) , SIMPANGAN BAKU RELATIF (SBR ATAU RSD),
KEOFISIEN VARIASI (KV).

KURVA TEROMPET HORWITZ

Nilai simpangan baku relatif atau disebut juga koefisien variasi (SBR, RSD, KV ) akan
meningkat dengan menurunnya konsentrasi analit. HORWITZ telah melakukan
kajian terhadap 3000 hasil analisis yang diambil dari studi kolaboratif AOAC dan
memberikan hasil sebagai berikut :
SBR atau KV = + 2(1-0,5 log C)
Di mana C adalah konsentrasi yang dinyatakan sebagai fraksi desimal
Misalnya untuk kadar C = 100%, maka fraksi desimalnya = 100/100 = 1
SBR atau KV = + 2(1-0,5 log 1) = 2%

 Hubungan RSD terhadap C digambarkan sebagai kurva berupa terompet. Oleh

karena itu kurva tersebut dinamakan kurva terompet HORWITZ
Jika nilai RSD dari percobaan dibandingkan terhadap RSD yang dihitung dari
persamaan terompet HORWITZ akan diperoleh HORWITZ RATIO atau
HORRAT:
HORRAT = SBRobs/SBRcalc

Jika nilai HORRAT <2 menandakan metode analisis mempunyai presisi yang
memadai

Harga RSD yang dihitung dari persamaan HORWITZ

Konsentrasi relatif

RSD (%)

100 (100%)
10-1 (10%)
10-2 (1%)
10-3 (0,1 %)
10-4
10-5
10-6 (ppm)
10-7
10-8
10-9 (ppb)
10-10
10-11
10-12 (ppt)

2,00
2,83
4,00
5,66
8,00
11,31
16,00
22,63
32,00
45,25
64,00
90,51
128,00

Kurva Terompet HORWITZ

Selektivitas (Spesifisitas)
Selektivitas atau spesifitas suatu metode analisis adalah kemampuannya yang hanya
mengukur zat tertentu saja secara cermat dan seksama dengan adanya komponen lain
yang mungkin ada dalam matriks sampel
Selektivitas dapat dinyatakan sebagai derajat penyimpangan (degree of bias) metode
analisis yang dipakai untuk menganalisis sampel yang mengandung bahan yang
ditambahkan berupa cemaran, hasil urai, senyawa sejenis, senyawa asing lainnya, dan
dibandingkan dengan hasil analisis sampel yang tidak mengandung bahan lain yang
ditambahkan
Dalam spektrofotometri, selektivitas dapat ditingkatkan dengan reaksi kimia
menggunakan reagen yang selektif.