LAPORAN PRAKTIKUM

ISOLASI -1,3-GLUKANASE DARI BACILLUS

LICHEMIFORMIS STRAIN HSA3-1a

NAMA

: RIFAATUL MAHMUDAH M.

NIM

: H 311 08 272

KELOMPOK

: II (DUA)

HARI/TGL PERC. : SENIN/29 NOVEMBER 2010

ASISTEN

: NURLAIDA

LABORATORIUM BIOKIMIA
JURUSAN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS HASANUDDIN
MAKASSAR

2010
LEMBAR PENGESAHAN

Makassar, 10 Desember 2010

Asisten

Praktikan

(NURLAIDA)

(RIFAATUL MAHMUDAH M.)

BAB I
PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Enzim merupakan biokatalisator atau katalisator organik yang dihasilkan
oleh sel. Enzim mengatur kecepatan dan kekhususan ribuan reaksi kimia yang
berlangsung di dalam sel. Walaupun enzim dibuat di dalam sel, tetapi untuk
bertindak sebagai katalis tidak harus berada di dalam sel. Reaksi yang
dikendalikan oleh enzim antara lain ialah respirasi, pertumbuhan dan
perkembangan, kontraksi otot, fotosintesis, fiksasi, nitrogen, dan pencernaan.
Teknologi produksi enzim perlu menggunakan mahluk hidup (agen biologi
mulai dari organisme tingkat rendah seperti bakteri, jamur, fungi, dan ragi hingga
ke tingkat tinggi seperti tanaman, binatang, dan manusia) sebagai pabrik
pemroses yang layak secara ekonomi. Enzim-enzim yang secara ekonomi telah
masuk pasar kebanyakan berasal dari golongan enzim-enzim hidrolitik, yang
masih diproduksi secara konvensional dan belum optimal atau diimport dari
negara luar.
Enzim-enzim hidrolitik yang banyak digunakan adalah golongan
karbohidrase

(seperti

-amilase,

-amilase,

glukoamilase,

-glukosidase,

glukosidase, pullulanase, glukose isomerase, invertase, laktase, selulase,

sellobiase, -glukanase, xilanase, hemiselulase, lakase, dan pektinase), golongan
protease (seperti protease asam, protease netral, dan protease basa), dan golongan
lipase.

Dalam percobaan ini berusaha untuk mengisolasi jenis enzim -1,3glukanase dari mikroba penghasil enzim ekstraseluler yaitu isolate dari Bacillus
Lichemisformis. Adapun produksi enzim dari mikroba ini dilakukan karena
memiliki keunggulan dari pada isolasi melalui produksi non enzim yaitu produksi
enzim dapat ditingkatkan dalam skala besar dalam ruang yang relatif terbatas,
waktu produksi singkat, tempat produksi di mana saja, mudah dikontrol, dan lainlain. Atas dasar inilah maka dilakukan percobaan ini.
1.2. Maksud dan Tujuan Percobaan
1.2.1. Maksud Percobaan
Untuk mengetahui dan mempelajari teknik isolasi enzim dari mikroba.
1.2.2. Tujuan Percobaan
Untuk mengetahui teknik isolasi enzim

-1,3-Glukanase dari mikroba

Bacillus Lichemiformis Strain HSA3-1a.

1.3. Prinsip Percobaan
Mengisolasi

enzim

Lichemiformis Strain HSA3-1a

-1,3-Glukanase

dari

mikroba

Bacillus

dalam suatu medium padat dengan cara

menginokulasi pada agar cawan dengan jarum ose melalui metode penyebaran
kultur mikroba di atas agar pada kondisi optimum yaitu suhu 55 oC dan pH 7.

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

Enzim adalah katalis. Enzim menurunkan energi pengaktifan suatu proses

dengan jalan menempatkan seluruh gugus reaktif dalam orientasi yang tepat serta
membantu berlangsungnya reaksi bersama gugus-gugus asam dan basa. Pada
beberapa kasus, enzim menstabilkan (berikatan hingga tercapai keefektifan)
keadaan transisi suatu reaksi (Bresnik, 2003).
Fungsi suatu enzim adalah sebagai katalis untuk proses biokimia yang
terjadi dalam sel maupun luar sel. Suatu enzim dapat mempercepat reaksi 10 8
sampai 1011 kali lebih cepat apabila reaksi tersebut dilakukan tanpa katalis. Jadi
enzim dapat berfungsi sebagai katalis yang sangat efisien, di samping itu
mempunyai derajat kekhasan yang tinggi. Seperti juga katalis lainnya, maka
enzim dapat menurunkan energi aktivasi suatu reaksi kimia. Reaksi kimia ada
yang membutuhkan enenrgi (reaksi endergonik) dan ada pula yang menghasilkan
energi atau mengeluarkan energi (eksergonik) (Poedjiadi dan Supriyanti, 2006).
Mikroba dapat tumbuh lebih baik pada media yang memenuhi persyaratan
untuk pertumbuhannya. Beberapa persyaratan media pertumbuhan mikroba antara
lain kandungan nutrisi dalam media, pH, suhu, dan tidak tercemar (tidak terpolusi)
oleh toksin, dan lain-lain (Nurwantoro dan Djarijah, 1997).
Enzim

-1,3-glukanase dari filtrat kultur Trichoderma harzianum BIO

10671 telah berjaya dimurnikan dengan 80 % aseton, diikuti kromatografi

penukaran ion menggunakan Neobar AQ dan pemfokusan kromatografi
menggunakan kolum Mono P HR 5/20. Dua

-1,3-glukanase berukuran 32

kDa dan 66 kDa telah dimurnikan dan ditunjukkan pada SDS-PAGE. pH aptimum
bagi aktivitas enzim ini ialah pada pH 4,5 dan aktivitas maksimum diserap pada
45C. Manakala aktivitas enzim dihalangi 20 45 % oleh 20mM Zn 2+, Ca2+, C02+,
Mi+, Cu2+, Mn2+ dan Fe2+. Aktivitas hidrolisis

-1,3-glukanase tertinggi

didapati pada laminarin disebabkan persamaan ikatan

-glikosidik dan diikuti

masing-masing pada pustulan, glukan dan selulosa (Mustafa dkk, 2005).

Apabila suatu sel mikroba (misalnya, bakteri) ditumbuhkan pada suatu
medium yang memenuhi syarat untuk tumbuh, maka mikroba tersebut akan
mengadakan multiplikasi secara aseksual dengan pembelahan sel menjadi dua sel
vegetatif yang serupa dan selanjutnya proses tersebut berlangsung terus-menerus
selama nutrisi, energi, dan persyaratan lingkungan lain masih memenuhi syarat
tumbuh (Nurwantoro dan Djarijah, 1997).
Prinsip perhitungan cawan yaitu, jika sel mikroba yang masih hidup
ditumbuhkan pada medium agar, maka sel mikroba tersebut akan berkembang
biak dan akan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dengan mata tanpa
menggunakan mikroskop. Metode hitung cawan merupakan metode atau cara
yang paling sensitive untuk menghitung jumlah mikroba karena alasan-alasan
berikut (Fardiaz, 1989):
1.

Hanya sel yang masih hidup yang dihitung

2.

Beberapa jenis mikroba dapat dihitung sekaligus

3.

Dapat digunkan untuk isolasi dan identifikasi mikroba

Selain keuntungan-keuntungan

tersebut,

metode

hitungan

mempunyai kelemahan-kelemahan sebagai berikut (Fardiaz, 1989):

cawan

1.

Hasil perhitungan tidak menunjukkan jumlah sel mikroba yang

sebenarnya, karena beberapa sel yang berdekatan mungkin membentuk satu
koloni

2.

Medium dan kondisi yang berbeda dapat menghasilkan silai yang berbeda

3.

Mikroba yang ditumbuhkan harus dapat tumbuh pada medium padat dan
membentuk koloni yang kompak dan jelas, tidak menyebar

4.

Memerlukan persipan dan waktu inkubasi beberapa hari sehingga

pertumbuhan koloni dapat dihitung.
Untuk metode tuang, inkubasi dilakukan pada suhu dan waktu tertentu

sesuai dengan jenis mikroba yang akan dihitung. Medium agar yang digunakan
juga disesuaikan dengan jenis mikroba yang akan ditumbuhkan. Selama inkubasi
sel-sel yang masih hidup akan tumbuh dan membentuk koloni (Fardiaz, 1989).
Faktor-faktor

yang

mempengaruhi

kehidupan

dan

pertumbuhan

mikroorganisme (Buckle dkk, 1987) adalah:

1.

Suplai zat gizi

Seperti halnya makhluk lain, mikroorganisme juga membutuhkan suplai

makanan yang akan menjadi sumber energi dan menyediakan unsur-unsur kimia
dasar untuk pertumbuhan sel. Unsure-unsur dasar tersebut adalah karbon,
nitrogen, hidrogen, oksigen, sulfur, fosfor, magnesium, zat besi dan sejumlah kecil
logam lainnya.
2.

Waktu
Waktu antara masing-masing pembelahan sel berbeda-beda tergantung dari

spesies dan kondisi lingkungannya.

3.

Suhu

Suhu adalah salah satu factor lingkungan terpenting yang mempengaruhi

kehidupan

dan

pertumbuhan

organisme.

Suhu

dapat

mempengaruhi

mikroorganisme dalam dua cara yang berlawanan.

a.

Apabila suhu naik, kecepatan metabolisme naik dan pertumbuhan

dipercepat. Sebaliknya apabila suhu turun, kecepatan metabolisme juga turun
dan pertumbuhan diperlambat.

b.

Apabila suhu naik atau turun, tingkat pertumbuhan mungkin

terhenti, komponen sel menjadi tidak aktif dan sel-sel dapat mati.

4.

Nilai pH
Setiap organisme mempunyai kisaran nilai pH di mana pertumbuhan

masih memungkinkan dan masing-masing biasanya mempunyai pH optimum.

5.

Aktivitas air
Semua organisme membutuhkan air untuk kehidupannya. Air berperan

dalam reaksi metabolit dalam sel dan merupakan alat pengangkut zat-zat gizi atau
bahan limbah ke dalam dan ke luar sel. Semua kegiatan ini membutuhkan air
dalam bentuk cair dan apabila air tersebut mengalami kristalisasi dan membentuk
es atau terikat secara kimiawi dalam larutan gula atau garam, maka air tersebut
tidak dapat digunakan oleh mikroorganisme. Jumlah air yang terdapat dalam
bahan pangan atau larutan dikenal sebagai aktivitas air (water activity = a w). air
murni mempunyai nilai aw = 1,0. Jenis mikroorganisme yang berbeda
membutuhkan jumlah air yang berbeda pula untuk pertumbuhannya.
6.

Ketersediaan oksigen

Tidak seperti bentuk kehidupan lainnya, mikroorganisme berbeda nyata

dalam kebutuhan oksigen guna metabolismenya. Beberapa kelompok dapat
dibedakan sebagai:
a.

Organisme aerobik, di mana tersedianya oksigen

dan penggunaannya dibutuhkan untuk pertumbuhan.

b.

Organisme anaerobik, tidak dapat tumbuh dengan

adanya oksigen dan bahkan oksigen ini dapat meruapakan racun bagi
organisme tersebut.

c.

Organisme anaerobik fakultatif, di mana oksigen

akan dipergunakan apabila tersedia, organisme tetap dapat tumbuh dalam
keadaan anaerobik.

d.

Organisme

mikroerofilik

(microaerophilic

organisms), yaitu mikroorganisme yang lebih dapat tumbuh pada kadar oksigen
yang lebih rendah daripada kadar oksigen dalam atmosfer.
7.

Faktor-faktor kimia
Telah diketahui banyak zat kimia yang dapat menghambat pertumbuhan

mikroorganisme atau membunuh mikroorganisme yang telah ada.

8.

Radiasi
Sinar ultraviolet dengan panjang gelombang tertentu dan radiasi ionisasi

seperti sinar X dan sinar gamma dapat mudah terserap oleh sel mikroorganisme.
Sinar-sinar tersebut dapat mengganggu metabolisme sel dan umumnya dapat cepat
mematikan.

DAFTAR PUSTAKA

Buckle, K.A., Edwards, R.A., Fleet, E., dan Wootton, M., 1987, Ilmu Pangan, di
terjemahkan oleh Nawangsari Sugiri, UI-Press, Jakarta.
Bresnick, S., 2004, Intisari Kimia Organik, diterjemahkan oleh Hadian Kotong,
Hipokrates, Jakarta.
Fardiaz, S., 1989, Analisis Mikrobiologi Pangan, Departemen Pendidikan dan
Kebudayaan Dirjen Perguruan Tinggi Pusat Antar Universitas dan Gizi
IPB, Bogor.
Mustafa, M., Ramli, S., Ithnin, N., Tohfan, N. F., 2005, Purification and
Characterisation of -1,3-glucanase from Trichoderma Harzianum
BIO 10671, Jurnal Pertanian J. Trop. Agric. Sci., 28 (1), 23-31, (online)
(http://psasir.upm.edu.my/3653/1/Purification_and_Characterisation_of_,B
-l,3-giucanase_from.pdf), di akses tanggal 29 November 2010, pukul
07.12 WITA.
Nurwantoro dan Djarijah, A.S., 1997, Mikrobiologi Pangan Hewan-Nabati,
Kanisus, Yogyakarta.
Poedjiadi, A. dan Supriyanti F. M. T., 2006, Dasar-Dasar Biokimia edisi revisi,
UI-Press, Jakarta.

BAB III
METODE PERCOBAAN

3.1. Bahan
Bahan-bahan yang digunakan pada percobaan ini, yaitu bakto agar 1,5 %,
yeast ekstrak 0,05 %, NaCl 0,1 %, pepton, 0,01 %, CMC 0,1 %, ammonium sulfat
0,7 %, K2HPO4, MgSO4.7H2O 0,01 %, akuades, alkohol, korek api, aluminium
foil, spiritus, sabun dan tissue roll.
3.2. Alat
Alat-alat yang digunakan pada percobaan kali ini, yaitu cawan petri,
erlenmeyer, ose, spoit 10 mL, batang pengaduk, sendok tanduk, botol semprot,
gelas ukur 100 mL, gelas kimia, kaki tiga, kawat kasa, neraca analitik, stirrer bar,
magnetik stirrer, autoclave, oven, spektronik 20 D+, kuvet, sentrifus dingin,
parafilm dan kertas pH indikator.
3.3. Prosedur Percobaan
3.3.1. Medium Padat
Mula-mula ditimbang bakto agar 1,5 gram, yeast ekstrak 0,05 gram, NaCl
0,1 gram, pepton 0,01 gram, dan CMC 0,1 gram dengan menggunakan neraca
analitik dan dimasukkan dalam erlenmeyer. Setelah itu, campuran dilarutkan
dengan 100 mL akuades. Setelah tercampur, larutan distirrer sampai tercampur
sempurna lalu dipanaskan menggunakan spiritus sampai mendidih. Setelah
mendidih, larutan dimasukkan dalam autoclave setelah 30 menit, lalu dituang
kedalam cawan petri yang sebelumnya telah disterilkan dengan cara dicuci bersih,
dibungkus kertas dan dimasukkan kedalam oven. Larutan dituang di dalam enkas

lalu dibungkus parafilm dan didiamkan selama 1 hari. Kemudian dibuat 4 kuadran
pada cawan petri.
3.3.2. Peremajaan Mikroba
Setelah terbentuk medium padat, digoreskan bakteri Bacillus pada medium
tersebut. Mula-mula, ose dicelupkan dalam etanol lalu dibakar menggunakan
spiritus sampai membara. Dalam keadaan membara, ose ditempelkan pada
medium padat lalu digoreskan pada bakteri kemudian digoreskan kembali pada
medium padat dan jangan sampai mengenai bagian yang telah ditempelkan tadi.
Lakukan berulang-ulang sampai kuadran keempat. Setelah itu, dibungkus kembali
dengan parafilm dan dimasukkan kedalam inkubator pada suhu 50 0C.
3.3.3. Inokulum
Pembuatan inokulum dimulai dengan penimbangan yeast ekstrak 0,05 gram,
ammonium sulfat 0,7 gram, pepton 0,01 gram, NaCl 0,1 gram, K 2HPO4
0,01 gram, MgSO4.7H2O 0,01 gram, dan CMC 0,1 gram dengan menggunakan
neraca analitik dan dimasukkan dalam erlenmeyer. Setelah itu dilarutkan dalam
100 mL akuades kemudian distirrer sampai tercampur sempurna. Setelah
tercampur, larutan kemudian dimasukkan ke dalam autoclave. Setelah 30 menit,
larutan dimasukkan ke dalam enkas dan dicelupkan bakteri sebanyak 3 ose.
Bakteri yang telah terbentuk pada medium padat di ambil menggunakan ose yang
sebelumnya dicelupkan pada etanol dan dipanaskan dengan spiritus sampai
membara. Setelah bakteri digores dengan ose, kemudian dicelupkan pada larutan
inokulum. Setelah itu, di shaker selama 1 hari.

3.3.4. Medium Produksi

Pembuatan inokulum dimulai dengan penimbangan yeast ekstrak
0,045 gram, ammonium sulfat 0,63 gram, pepton 0,009 gram, NaCl 0,09 gram,
K2HPO4 0,009 gram, MgSO4.7H2O 0,009 gram, dan CMC 0,09 gram dengan
menggunakan neraca analitik dan dimasukkan dalam erlenmeyer. Setelah itu
dilarutkan dalam 90 mL akuades kemudian distirrer sampai tercampur sempurna.
Setelah tercampur, larutan kemudian dimasukkan ke dalam autoclave. Setelah 30
menit, larutan dimasukkan ke dalam enkas dan di tambahkan 10 mL larutan
inokulum yang sebelumnya telah distirrer selama 1 hari. Setelah tercampur, di
ambil 30 mL dari medium produksi dan dimasukkan kedalam botol, lalu
dimasukkan kedalam lemari es, kemudian 70 mL dari larutan tersebut di shaker
selama 72 jam.
3.3.5. Pengukuran Uji Aktivitas

-1,3-Glukanase

Dua larutan yang memiliki perlakuan berbeda, diukur pHnya menggunakan

kertas pH, kemudian di ukur absorbannya menggunakan spektrofotometer pada
panjang gelombang 660 nm dan diukur dengan menggunakan sentifus dingin
(4 0C) selama 30 menit. Setelah itu, di amati perubahan yang terjadi.

BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Hasil Pengamatan

Tabel
No

Waktu Fermentasi (jam)

pH

1
2

0
72

7
8

Optical Density
(660 nm)
0,042
0,756

4.2. Pembahasan
Enzim -1,3-glukanase secara luas ditemukan pada sebagian besar
bakteri, jamur, dan tanaman tingkat tinggi. Berdasarkan pada aktivitas hidrolitik
dari -1,3-glukanase dan hubungannya dengan infeksi pathogen, -1,3-glukanase
dinyatakan sebagai komponen penting dalam mekanisme pertahanan melawan
pathogen. Percobaan ini difokuskan pada isolasi enzim dari mikroba, dalam hal
ini digunakan isolate Bacillus lichemiformis sebagai penghasil enzim -1,3glukanase.
Medium yang digunakan pada percobaan ini adalah medium padat karena
bakteri yang akan diremajakan dan diamati berupa pertumbuhan koloni. Medium
padat dibuat dengan komposisi yang sesuai dengan semua kebituhan unsur hara
yang diperlukan untuk pertumbuhan dan perkembangbikan mikroba yang akan
diisolasi. Adapun komponen yang digunakan antara lain bakto agar sebagai
pemadat substrat dan komponen media lain, ammonium sulfat sebagai komponen
penyedian unsur nitrogen, yeast ekstrak sebagai sumber energi atau unsur karbon,
NaCl sebagai sumber mineral Na yang dibutuhkan untuk pertumbuhan, K 2HPO4

sebagai garam yang mempertahankan pH media dalam keadaan netral,

MgSO4.7H2O sebagai sumber mineral dalam media. Keberadaan suatu substrat
dapat memacu suatu mikroorganisme untuk mensekresi metabolit sekundernya.
Media sebelum digunakan disterilkan dalam autoclave untuk mencegah
medium tidak ditumbuhi oleh mikroba lain yang tidak diharapkan. Sebelum media
dituangkan ke dalam cawan petri bagian mulut dari erlenmeyer dipanaskan dalam
nyala api lampu spritus dan pengerjaan dilakukan dalam keadaan aseptik sehingga
kontaminasi dan mikroba yang tidak diharapkan dapat dihindari.
Pada tahap peremajaan ini dilakukan dengan mengisolasi kembali biakan
murni isolate Bacillus Lichemiformis. Isolasi dilakukan dengan jarum ose. Jarum
ose yang akan digunakan sebelumnya dicelupkan dalam etanol 70 % dan
dipanaskan dalam nyala api hingga membara, supaya memastikan jarum ose bebas
dari mikroba atau dalam keadaan steril sehingga siap digunkan untuk
memindahkan biakan mikroba. Setelah dipanaskan ose diletakkan dalam medium,
sebagai tanda awal penggoresan. Bagian penggoresan pada cawan Petri dibagai
menjadi dua bagian, sehingga area penggoresan lebih luas dan mencegah bila
bagian tertentu tidak tumbuh. Jarum ose yang steril digunakan untuk mengambil
koloni mikroba pada biakan murni selanjutnya dinokulasi pada bagian mediu yang
baru dengan menggoreskan secara zig zag pada medium yang telah dibuat.
Penggoresan seara zig zag dimaksudkan agar pertumbuhan koloni yang baru bisa
menyebar sehingga kemungkinan tumbuhnya lebih besar oleh karena keberadaan
substrat yang cukup. Setiap langkah dalam tahap ini dilakukan secara aseptik agar
tidak terjadi kontaminasi, oleh karena itu setiap membuka dan menutup cawan
Petri harus dipanaskan dahulu dalam nyala api. Setelah digores media dimasukkan

dalam inkubator pada suhu 55 oC selama 3 hari, agar pengeraman mikroba dapat
dilakukan secara maksimal pada media tersebut dan juga karena karena isolate
Bacillus Lichemiformis merupakan mikroba termofilik yang optimum tumbuh
pada suhu tersebut.
Selanjutnya mikroba tersebut dipindahkan ke dalam medium produksi
untuk memperbesar ruang bagi mikroba untuk berkembang biak. Pada tahap
terakhir ialah pengukuran pH dan optical density dengan menggunakan
spektrofotometer 20 D+ untuk melihat pertumbuhan mikroba dan disentrifuge
untuk mengetahui sifat mikroba. Pengukuran absorbansi pada medium dengan
waktu fermentasi 0 jam ialah 0,042, sedangkan pada medium dengan waktu
fermentasi 72 jam ialah 0,756s. Hal ini menunjukkan bahwa semakin lama waktu
fermentasi, medium semakin keruh, yang menandakan mikroba yang tumbuh
semakin banyak. Mikroba tersebut adalah jenis mikroba ekstraseluler, hal ini
ditandai dengan larutnya tersebut dalam air.

BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan
Dari percobaan dapat disimpulkan bahwa enzim -1,3-glukanase dapat
diisolasi dari mikroba Bacillus lichemiformis strain HSA3-1a.
5.2 Saran
5.2.1 Untuk Percobaan
Agar pada percobaan selanjutnya waktu yang digunakan tidak terlalu
lama.
5.2.2 Untuk Laboratorium
Bahan-bahan dan alat yang akan digunakan dalam praktikum lebih
dilengkapi agar praktikan dapat memperoleh data yang akurat.

Lampiran : Foto Hasil Pengamatan