Disusun oleh :

YELMIDA A.

Analytical HPLC

HPLC preparative

Pendahuluan

HPLC secara mendasar merupakan

perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi
kolom
Selain dari pelarut yang menetes melalui
kolom dibawah pengaruh gravitasi, pelarut
pada HPLC didukung melalui tekanan tinggi
sampai sekitar 400 atm. Ini membuatnya lebih
cepat.
HPLC menggunaan partikel yang berukuran
sangat kecil untuk material terpadatkan dalam
kolom, yang akan memberi luas permukaan
yang lebih besar pada interaksi antara fase
diam dan molekul-molekul yang melintasinya

Bila zat larut dengan pelarut yang cocok, zat

tersebut dapat dianalisis.
Ciri teknik ini adalah penggunaan tekanan tinggi
untuk mengirim fasa mobil kedalam kolom.
Dengan memberikan tekanan tinggi, laju dan
efisiensi pemisahan dapat ditingkatkan dengan
besar.
Kolom yang digunakan untuk HPLC jauh lebih
pendek dibandingkan dengan kolom GC.
Sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal
4.6 mm (dan mungkin kurang dari nilai ini) dengan
panjang 150 sampai 250 mm.

KEUNGGULAN UTAMA ANALISIS

High Pressure Liquid Chrom.

RESOLUSI TINGGI
CEPAT
SENSITIVITAS DETEKTOR TINGGI
LUWES
KOLOM YANG DAPAT DIGUNAKAN
KEMBALI
IDEAL UNTUK ZAT BERBERAT
MOLEKUL TINGGI DAN BERIONIK

HPLC KROMATOGRAFI CAIR

FASE MOBIL (GERAK)

: CAIR

FASE STATIONER (DIAM)

: - CAIR (LLC)
- PADAT (LSC)

DASAR PEMISAHAN :
LLC
PROSES PARTISI
LSC
PROSES ADSORPSI
PERTUKARAN ION
FILTRASI GEL

Diagram alir HPLC

Prinsip Kerja HPLC

Sama halnya dengan GLC, dasar pemisahan

dari HPLC adalah proses partisi atau perbedaan
distribusi sample antara dua fase yaitu fase
mobil (bergerak) dan fase stasioner (diam).
Semakin lama suatu komponen terdistribusi
dalam fasa diam semakin lama waktu
retensinya
Fase mobil disebut juga eluen yang membawa
sampel
sementara fase stasioner akan menghambat
sampel.

Pemisahan juga terjadi atas dasar kelarutan selektif.

Cairan yang teradsorpsi pada fase stasioner bersifat
melarutkan secara selektif dan mempengaruhi
terjadinya pemisahan sempurna menjadi komponenkomponennya.
Komponen yang mempengaruhinya yang mempunyai
kelarutan besar menyebabkan pergerakannya
disepanjang kolom menjadi lambat,
sebaliknya komponen yang kelarutannya rendah akan
bergerak lebih cepat.
Akibatnya komponen sampel akan keluar dari kolom
tidak bersamaan, dengan demikian komponen
sampel akan terpisah.

FASA GERAK

Di dalam kromatografi cair, komposisi solven atau

fasa gerak adalah salah satu variabel yang
mempengaruhi pemisahan. Terdapat variasi yang
sangat luas untuk solven HPLC, tetapi ada beberapa
sifat umum yang harus dipunyai fasa gerak :
1. Murni, tidak terdapat kontaminan
2. Tidak bereaksi dengan wadah (packing)
3. Sesuai dengan detektor
4. Melarutkan sampel
5. Memiliki visikositas rendah
6. Bila diperlukan, memudahkan "sample recovery"
7. Diperdagangan dapat diperoleh dengan harga
murah (reasonable price)

Berdasarkan kekuatan / kepolaran fasa geraknya

HPLC dibagi menjadi:
- Fase normal : Fasa gerak kurang polar
dibandingkan fasa diam
- Fase Terbalik (Reversed Phase) : Fasa gerak
lebih polar dibandingkan fasa diam
FASE NORMAL
Kolom diisi dengan partikel silika yang sangat kecil
dan pelarut non polar, misalnya heksan.
fase mobil
: NONPOLAR
fase stasioner
: POLAR
Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui
kolom akan melekat lebih lama pada silika yang
polar dibanding dengan senyawa-senyawa non
polar. Oleh karena itu, senyawa yang non polar
kemudian akan lebih cepat melewati kolom.

FASE TERBALIK (Reversed Phase)

fase mobil
: POLAR
fase stasioner
: NONPOLAR
Ukuran kolom sama, tetapi silika dimodifikasi
menjadi non polar melalui pelekatan rantairantai hidrokarbon panjang pada
permukaannya secara sederhana baik
berupa atom karbon 8 atau 18.
Sebagai contoh, pelarut polar digunakan
campuran air dan metanol.

Senyawa-senyawa non polar dalam campuran akan

cenderung membentuk atraksi dengan gugus
hidrokarbon karena adanya dispersi gaya van der
Waals.
Senyawa-senyawa ini akan menghabiskan waktu
dalam larutan lebih lama dan akan bergerak lambat
dalam kolom
Ini berarti bahwa molekul-molekul polar akan
bergerak lebih cepat melalui kolom.
Fase terbalik HPLC adalah bentuk yang lebih biasa
digunakan dalam HPLC

POLARITAS PELARUT
UNTUK FASE MOBIL
HEPTANA (paling nonpolar),
heksana,
metanol
sikloheksana, asetonitril
toluena,
formamida
benzena,
AIR (paling polar)
kloroform,
dietil eter,
etil asetat,
aseton,
isopropanol,
etanol,
asam asetat

Komponen peralatan
HPLC
Komponen dasar peralatan HPLC terdiri
dari :
(1) eluen/ fase mobil,
(2) pompa,
(3) injector,
(4) Kolom ,
(5) detector,
(6) rekorder.

Komponen peralatan HPLC

(1) Eluen

Eluen akan membawa sampel sepanjang kolom.

Botol tempat eluen tidak boleh bereaksi dengan
pelarut dan dilengkapi penyaring Semua pelarut
harus disaring sebelum digunakan.
Eluen yang digunakan harus bebas dari udara
(Solvents degassed - "sparging). Udara yang
terbawa ke dalam pompa akan menyebabkan laju
alir eluen tidak stabil.
Untuk mengatasinya eluen disaring dengan kertas
saring milipore 0,45m kemudian diaerasi.
Eluen yang umum digunakan misalnya methanol,
air (hi-pure), dan asetonitril.

Skema HPLC : Eluen dan komponen -komponennya

(2) Pompa

Pompa untuk mengalirkan fase mobil atau eluen

dengan tekanan tinggi dan laju yang konstan.
Dikenal dua sistem pompa pada proses elusidasi
yaitu isokratik (internal) dan gradien (eksternal).
Pada sistem isokratik, hanya satu buah pompa
yang digunakan dan konsentrasi dari eluen
tertentu, misalnya larutan asetonitril 1%.
Pada sistem gradien digunakan campuran
pelarut, dalam hal ini diperlukan dua buah pompa
yang masing-masing mengatur laju alir dari
larutan yang berbeda, misalnya buffer A dan
buffer B. Mula-mula eluen dengan konsentrasi 0%
B kemudian meningkat sedikit demi sedikit
sampai 100% B selama waktu elusi.

Skema HPLC :

System delivery pelarut, dapat menggunakan :

Pompa reciprocating (Untuk laju alir konstan)
Syring (Menggunakan motor stepper untuk
mendorong pelarut dalam wadah)
Hydraulik/Pneumatik (Pompa dengan gigi
pemutar/gir untuk mendorong)
Pompa, terbuat dari stainlessteel,
seal terbuat dari grafit atau tefln,
tekanan sampai 400 bar,
memberikan laju alir sampai 5 ml/menit.
Tak memberikan pulsa dan keberulangan
pemompaan <1%

(3) Injektor /injection port

Injector digunakan untuk memasukkan

sampel.
Pada alat HPLC biasanya dilengkapi
dengan penyampel otomatis (automatic
sampler).
Penyampel otomatis dapat diprogram untuk
mereaksikan atau menginjeksikan sampel.
Volume sampel berkisar dari 1 - 5 l.
Injektor yang baik harus mudah digunakan
dan dapat bekerja walaupun ada tekanan
balik

Injeksi sample
seluruhnya otomatis
Karena proses ini
meliputi tekanan, tidak
sama halnya dengan
kromatografi gas ,
maka tidak akan
diketahui apa yang
terjadi pada tingkat
dasar.

Ada tiga tipe dasar injektor yang dapat

digunakan :
a.Stop-Flow : Aliran dihentikan, injeksi
dilakukan pada kinerja atmosfir, sistem
tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi.
b.Septum : Septum yang digunakan pada
HPLC sama dengan yang digunakan
pada GC. Injektor ini dapat digunakan
pada kinerja sampai 60 -70 atmosfir.
c.Loop Valve : Tipe injektor ini umumnya
digunakan untuk menginjeksi volume
lebih besar dari 10 dan dilakukan
dengan cara automatis

(4) Column

Kolom digunakan untuk

memisahkan sampel
menjadi komponenkomponennya. Saat ini
tersedia berbagai jenis
kolom seperti
kolom ODS
(oktadesilsilan),
kolom asam organic,
kolom fermentasi, dsb.
Kolom ditempatkan dalam
oven yang dipanaskan dan
dipertahankan agar suhu
kolom konstan.

Kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok :

1.

2.

Kolom analitik : Diameter dalam 2 -6 mm.

Panjang kolom tergantung pada jenis material
pengisi kolom. Untuk kemasan pellicular,
panjang yang digunakan adalah 50 -100 cm.
Untuk kemasan poros mikropartikulat, 10 -30
cm. Saat ini ada yang 5 cm.
Kolom preparatif : umumnya memiliki
diameter 6 mm atau lebih besar dan panjang
kolom 25 -100 cm.
Kolom biasanya dioperasikan pada
temperatur kamar, tetapi bisa juga digunakan
temperatur lebih tinggi, terutama untuk
kromatografi penukar ion dan kromatografi
eksklusi.

Column HPLC/ analitik :

Stainless steel
Panjang column10-30 cm
diameter internal 4-10 mm
Ukuran partikel 1-10 mm, teoritical plate
40,000 - 60,000 plates/m
Guard column , kolom pendek berisi partikel
dengan bahan yang sama dengan kolom
analisis,tapi ukuran partikel lebih besar.
Guard column diletakkan antara injektor
dengan kolom analis untuk menangkap
partikulat atau senyawa yang kemungkinan
akan mengotori kolom.

Standard compression fitting pada HPLC

Pemeliharan Kolom :
Saring

eluen dengan saringan membran

Hindari pengaliran eluen dari arah
sebaliknya
Gunakan kolom pengaman
Simpan kolom pada pelarut yang sesuai
Cuci kolom sesudah digunakan

(5) Detektor
Detector merupakan alat untuk
mendeteksi komponen yang keluar
dari kolom.
Jenis-jenis detektor pada HPLC :
DETEKTOR

ULTRAVIOLET (UVD)
DETEKTOR FLUORESENSI (FD)
DETEKTOR INDEKS REFRAKSI
(RID)
DEKTEKTOR DIODE ARRAY (DAD)

Metode yang umum dipakai & mudah untuk

menjelaskan yaitu penggunaan detektor
serapan ultra-violet (UVD)
Banyak senyawa-senyawa organik menyerap
sinar UV dari beberapa panjang gelombang
( umumnya pada 254 nm). Jika diberikan sinar
UV pada larutan yang keluar melalui kolom dan
sebuah detektor berada pada sisi yang
berlawanan, maka akan kita dapatkan
pembacaan langsung berapa besar sinar yang
diserap
Jumlah cahaya yang diserap akan bergantung
pada jumlah senyawa tertentu yang melewati
melalui berkas pada waktu itu.

Skema detektor UV

Detektor indeks bias ( RID )merupakan detektor

yang juga luas penggunaannya setelah detektor
ultraviolet.
RID biasa digunakan untuk memisahkan
komponen gula,
Dasarnya ialah pengukuran perbedaan indeks
bias fase gerak murni dengan indeks bias fase
gerak yang berisi komponen sampel,
Detektor ini kurang sensitif dibanding dengan
detektor ultraviolet dan sangat peka terhadap
perubahan suhu.

Dalam hal-hal yang sangat spesifik dapat

digunakan detektor-detektor fluorometer dan
elektrokimia.
FD digunakan bila senyawa yang keluar dari
kolom dapat memancarkan fluoresensi,
DAD untuk mendeteksi komponen-komponen
sehingga kromatogram berbentuk tiga dimensi.
Detektor indeks bias merupakan detektor HPLC
yang universal, tetapi kurang sensitiv dan
sangat peka tehadap perubahan suhu.
Detektor ultraviolet dengan panjang gelombang
yang bervariasi merupakan pilihan yang paling
baik bagi sekelompok besar obat-obatan.

Ciri-ciri detektor yang baik antara lain :

memiliki sensitifitas yang tinggi,
gangguan (noise) yang rendah,
kisaran respons linier yang luas,
memberi respons untuk semua tipe
senyawa.
stabilitas dan keterulangan tinggi
waktu respon pendek sehingga tidak
bergantung kecepatan alir
tidak merusak cuplikan
Suatu kepekaan yang rendah terhadap aliran
dan fluktuasi temperatur sangat diinginkan,
tetapi tidak selalu dapat diperoleh.

(6) Rekorder

Pada alat HPLC yang canggih selain

menggunakan rekorder untuk merekam
data juga dilengkapi dengan pengolah data
(data station) yang dihubungkan dengan
computer.
Pada alat ini signal dari rekorder diubah
menjadi kromatogram dimana setiap
puncak menunjukkan komponen sample
yang dapat digunakan untuk identifikasi dan
analisis kuatitatif.

Waktu retensi

Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk

bergerak melalui kolom menuju detektor disebut
sebagai waktu retensi.
Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana
sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan
ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu.
Untuk beberapa senyawa, waktu retensi akan
sangat bervariasi dan bergantung pada:
tekanan

yang digunakan (karena itu akan

berpengaruh pada laju alir dari pelarut)
kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari
material apa, tetapi juga pada ukuran partikel)
komposisi yang tepat dari pelarut
temperatur pada kolom

KEGUNAAN HPLC

HPLC digunakan untuk analisis senyawa nonvolatile termasuk sampel ionik dan polimerik.
HPLC dengan prinsip kromatografi adsorpsi
banyak digunakan pada industri farmasi dan
pestisida.
Zat-zat dengan kepolaran berbeda, yaitu antara
sedikit polar sampai polar dapat dipisahkan
dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair.
Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan
kolom penukar ion yang dikombinasikan dengan
kolom butiran berlapiskan zat berpori.Penukar
ion gel silica yang dimodifikasi secara kimia dan
penukar ion klasik.

Morfin, heroin dan semacamnya telah

dapat dipisahkan pada resin Zipax-SAX.
Penukar ion gel silica yang dimodifikasi
secara kimia mempunyai kapsitas tukar
tinggi, vitamin-vitamin yang larut dalam
air misalkan telah dapat dipisahkan.
Pemakaian HPLC pada kromatografi
eksklusi dilakukan dengan kolom
panjang, tujuan utama kerjanya tetap
sama yaitu penentuan berat molekul
polimer dan masalah-masalah biokimia.

SAMPEL YANG DAPAT

DIANALISIS DENGAN HPLC :

Asam amino
Asam organik
Anion anorganik & organik
Hidrokarbon aromatik
Protein
Karbohidrat
Sirup jagung
Aflatoksin
Vitamin

Kromatogram HPLC asam amino standar

Retention time (minutes)

Jenis dan luas area asam amino standard

No
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15

Jenis asam amino

Aspartat
Glutamat
Serina
Histidina
Glysina
Threonina
Arginina
Alanina
Tyrosina
Methionina
Valina
Fenillatanina
Isoleusina
Leusina
Lysina

Luas area
503743
531325
508152
392231
513530
500060
541136
496585
471684
453239
535105
397982
483905
457746
227927

Kromatogram HPLC asam amino tepung jangkrik

Retention time (minutes)

Kromatogram HPLC asam amino bulu ayam

Retention time (minutes)

Kromatogram dua sampel yang

berbeda

Chromatogram HPLC dari Extract Ethanol Kava Fiji