ANALISIS DENGAN TEKNIK HPLC

SUNARDI

Departeman Kimia FMIPA-UI

sunardi1@ui.ac.id

Kromatograf

Kromatograf merupakan metode pemisahan yang

mengandalkan perbedaan perilaku interaksi analit
antara fase gerak dan fase diam untuk memisahkan
komponen dalam campuran.
Komponen yang berinteraksi sangat kuat ke fase diam
memerlukan waktu lama di dalam kolom dan
terpisahkan dari komponen yang berinteraksi kuat di
fase gerak yang melewati kolom lebih cepat.
2

Kromatograf
Komponen yang keluar dari ujung kolom
dideteksi dan diukur oleh detektor.
Instrumen analitis dapat dikombinasikan antara
metode pemisahan dengan analisis on-line.
Contoh:

Kromatograf

gas dan cair dengan spektrometri

massa (GC-MS dan LC-MS) atau GCMSMS,
LCMSMS
Fourier-transform spektroskopi inframerah (GCFTIR).
Diode-array UV-VIS absorpsi spektroskopi(HPLCUV- VIS).

Kromatograf
Mekanisme interaksi dalam kromatograf
Mekanisme

Fasa diam

Adsorpsi

padat

Partisi

cair

Ion exchange

anion atau kation yang berikatan

kovalen pada resin

Molekul Size

gel

Afnitas

zat aktif yang melekat pada zat

padat pendukung

HPLC (High Performance

Liquid Chromatography).
Kromatograf

padat-cair dan cair-cair.

Fasa diam (stationer) permukaan aktifnya dapat

berupa padat, cairan, resin penukar ion atau
polimer

Proses

pemisahan komponen sampel

berdasarkan pada interaksi komponen
sampel dan fasa diam.

Interaksi dapat berupa absorpsi (fasa diam

padat) atau partisi (fasa diam cairan), pertukran
ion, molekuler eksklusi atau afnitas.

Perkembangan LC
UHPLC : Ultra High Performance Liquid
Chromatography
FHPLC : Fast High Performance Liquid
Chromatography
UPLC : Ultra Performance Liquid
Chromatography
Pilih HPLC atau UHPLC ?
6

Peralatan :

Pemilihan Fasa Gerak (mobil)

Fasa

gerak mengatur interaksi fasa terlarut dan fasa

diam, maka pemilihan fasa gerak adalah penting.

Fasa

mobil yang digunakan harus berkualitas

HPLC atau minimal Spektrofotometri

Untuk

mencegah rusaknya peralatan (pompa,

detector atau kolom pakcing dll), tidak boleh
digunakan sebagai fasa mobil :
asam

kuat,
basa dan
larutan halida.

Pemilihan Fasa Gerak

Fasa mobil di saring dengan ukuran flter
0,2 m
Tujuan penyaringan Pelarut :
Menghilangkan partikulat dan bakteri
agar :
Membantu kerja pompa agar awet
Membantu kerja kolom agar awet
tidak tersumbat.

Pemilihan Fasa Gerak

Pelarut

harus dilakukan degassing untuk

mencegah kemungkinan terbentuknya
gelembung gas didalam kolom atau aliran ke
detektor.
Oksigen pada tekanan tinggi dapat
mengakibatkan hal yang serius dalam sistem
ini, karena dapat merusak kolom.
Cara melakukan degassing :
Diaerasi

dengan gas lain yang kelarutannya kecil

Divakum
Dipanaskan

10

Pemilihan Fasa Gerak

Volatilitas harus dipertimbangkan jika tujuan

utamanya adalah recovery sampel.
Viskositas harus rendah (kurang dari 0,5
sentipoise), agar tekanan pompa tidak terlalu
tinggi dan tidak mengurangi transfer massa
antara fasa pelarut dan fasa diam.
Jika digunakan untuk fasa mobil pada LC / MS
atau MSMS harus dipilih larutan buffer yang
mudah menguap volatile.

11

Pengendalian Fasa Gerak

Isokratik cara penggunaan aliran fasa mobil

yang hanya memerlukan 1 macam komposisi
pelarut baik palarut tunggal maupun pelarut
campuran selama dilakukan analisis.
Gradien elusi cara penggunaan aliran fasa
mobil 2 jenis pelarut atau lebih yang diprogram
secara otomatis sehingga komposisinya berubah
sesuai Program yang telah dirancang, agar
diperoleh pemisahan yang lebih baik
12

Sistem Pompa

Pompa Reciprocating

13

Sistem Pompa
Pompa jenis ini banyak digunakan
Biasanya digunakan dua buah pompa
Satu pompa bergerak menghisap sedangkan pompa
yang lain bergerak mendorong pelarut
Dengan cara ini fluktuasi tekanan menjadi sangat
kecil

14

Sistem injeksi sampel

Sistem dalam HPLC mempunyai tekanan yang sangat

tinggi 300 atm cara menginjeksikan sampel yang
paling sesuai yaitu Sampling Loop

15

Sistem injeksi sampel

Diagram Valve

16

Sistem injeksi sampel

Diagram Valve

17

Sistem injeksi sampel (manual)

18

Sistem injeksi sampel (automatic)

19

Sistem injeksi sampel (automatic)

20

Kolom

Merupakan bagian yang sangat penting dalam HPLC

Kolom HPLC

21

Penggunaan Kolom

Kromatografi fasa normal (normal phase).

Dalam sistem ini digunakan fasa gerak non
polar misalnya Heksana atau isopropil- eter, dan
fasa diamnya lebih polar misalnya Trietilenglikol atau air.
Kromatografi fasa terbalik (Reversed
phase).
Dalam sistem ini digunakan fasa gerak lebih
polar misalnya, air, metanol atau asetonitril,
sedangkan fasa diamnya non polar misalnya
Hidrokarbon (C-18) oktadekana.

22

Jenis kolom HPLC dan kegunaannya

Jenis sampel
Mode
1. Kepolaran Reverse
rendah &
phase
larut
dalam
hidrokarbon
2. Kepolaran Normal
medium
phase
&
larut
dalam
alkaloid

Reverse
phase

Tipe
Fasa mobil
-C18 Metanol/air,asetoni
tril/ air, asetonitril/
THF, THF/metylen
klorida

Contoh
Polinuklear hidrokarbon
aromatik, trigliserida lipid,
ester, vitamin dalam lemak,
steroid, hidroquinon, alkaloid.

-CN

Asetonitril, metilen
klorida, heksana,
karbontetra klorida

Vitamin larut dalam lemak,

steroid, alkohol, aromatik,
amina, ester, lipid.

-NH2

Heksana, metilen
klorida, asetonitril

Amina aromatik, ester,

pestisida klorinasi, asam
karboksilat, nukleotida, asam
phtalat, polinuklear aromatik.
Steroid, bahan alam yang larut
dalam alkohol, vitamin, asam
aromatik, xanthin, antibiotik,
anti oksidant, zat aditif
23
karbohidrat.

-ODS Metanol, air,

-C8 asetonitril
-CN
-TMS
-NH2

Jenis kolom HPLC dan kegunaannya

3. Kepolaran Reverse
tinggi & phase
larut
dalam
lemak
Penukar
kation

-C8
-CN
-TMS

Metanol, air,
asetonitril, larutan
buffer.

-SO3

Air, larutan buffer

Penukar
anion

-NR3+

Sitrat, buffer phosfat

pH 2-7.

Pasangan
ion

-NH2

-ODS Air, metanol,

-C8 setonitril.

Vitamin larut dalam air,

amina, alkohol
aromatik, analgesik,
antibiotik, aditif
makanan.
Kation anorganik,
karbamat, vitamin,
asam amino,
nukleotida, glikosida.
Nukleotida, anion
anorganik, gula, asam
organik.
Asam, katekol, amina,
sulfonat.

24

Jenis kolom HPLC dan kegunaannya

4. Kepolaran
Reverse
tinggi &
phase
larut dalam
lemak

-C8
-CN
-TMS

Metanol, air,
asetonitril, larutan
buffer.

Vitamin larut dalam air,

amina, alkohol aromatik,
analgesik, antibiotik,
aditif makanan.

Penukar
kation

-SO3

Air, larutan buffer

Kation anorganik,
karbamat, vitamin, asam
amino, nukleotida,
glikosida.

Penukar
anion

-NR3+

Sitrat, buffer phosfat

pH 2-7.

Nukleotida, anion
anorganik, gula, asam
organik.

Pasangan
Ion

-ODS
-C8

-NH2

Air, metanol, setonitril. Asam, katekol, amina,

sulfonat.

25

Detektor

Indek Refraksi

26

Detektor

Detektor UV-Vis

27

Kromatogram 2D
Conditions:
Cartridge

column
20x2.1mm HAISIL HL
C18

200L/min
15%

acetonitrile/ 10mM
phosphate buffer (pH
2.2)
Detector: 210nm

Contoh : Analisis minuman ringan

28

Detektor

29

Kromatogram 3D

Contoh : Kromatogram 3D

30

Kromatogram 3D

31

MS ATAU MSMS

32

Total Ion Chromatogram (TIC)

33

Kromatogram Massa Q1

34

Kromatogram Massa Q1 dan Q3

35

Pemecahan Massa Terpilih

36

Kromatogram Massa Q3

37

Analisis Sampel

Sampel

sering merupakan campuran dari banyak

komponen dalam matriks yang kompleks.

Sampel

mengandung banyak senyawa yang tidak

diketahui, metode analisis yang digunakan harus
dapat memisahkan satu sama lain sehingga
setiap komponen individual dapat diidentifkasi.

Campuran

dapat dipisahkan dengan mengguna

kan perbedaan sifat fsik atau sifat kimia dari
komponen individu.

38

Analisis Sampel
Beberapa

sifat senyawa yang dapat digunakan

untuk pemisahan adalah kelarutan, titik didih,
tekanan uap, adsorbsi, ukuran partikel dan
lain-lain

Sifat

komponen dalam campuran adalah tetap

jika kondisinya konstan, sehingga campuran
dapat dipisahkan dan diidentifkasi.

Pemisahan

dan identifkasi adalah cara khas

dalam teknik analisis kromatograf dan
elektroforesis

39

Prosedur analisis
Dalam analisis dengan teknik kromatograf agar
didapatkan hasil yang optimal perlu dilakukan dalam
beberapa tahapan.
Tahap 1 Ekstraksi
Tahap 2 Clean Up (Pembersihan)
Tahap 3 Analisis

40

Tahap1 : Ekstraksi

Setelah sampel diukur berat atau volumenya lalu

dilakukan ekstraksi.
Ekstraksi sampel berfungsi untuk pemekatan atau
merubah dari satu fasa (padat) ke fasa yang lain
(cair)
Memisahkan analit dengan matrik pengotornya agar
beban kolom lebih ringan dan gangguan matrik
menjadi berkurang.
Karena sampel lebih bersih, analisis menjadi lebih
cepat, teliti dan akurat.

41

Macam Ekstraksi
Jenis

ekstraksi yang dapat dilakukan

pada sampel:
Ekstraksi

Cair-cair (Liquid-Liquid
Extraction)
Soxhlet
Ekstraksi Fasa Padat/Solid Phase
Extraction (SPE)
Ekstraksi Fluida Superkritis
42

Ekstraksi Cair-Cair

Ekstraksi cair-cair menggunakan dua pelarut yang

tidak saling melarutkan, untuk memisahkan analit
dari satu pelarut ke pelarut yang lain.
Menurut teori partisi, distribusi dari zat terlarut
antara dua fase adalah kondisi kesetimbangan.
Dilaboratorium, biasanya ekstraksi senyawa organik
dari fase air masuk ke fasa organik.

43

Ekstraksi Cair-Cair

Jika sampel berbentuk padatan biasanya perlu

dilarutkan dulu atau dihaluskan.
Analisis Organik seringkali jauh lebih rumit.
Sampel dapat berada dalam matriks yang sangat
rumit sehingga memerlukan prosedur ekstraksi
berhati-hati untuk mendapatkan analit dalam bentuk
yang dapat dianalisis.

44

Ekstraksi Cair-Cair

Ekstraksi dengan corong pisah

45

Ekstraksi Cair-Cair

46

Ekstraksi Cair-Cair

47

Ekstraksi Soxhlet
Dalam metode ini, sampel ditempatkan dalam
kantong kertas saring.
Kantong ditempatkan di ruang ekstraksi (2), yang
ditempatkan di atas tabung yang berisi pelarut (1)
dan di bawah kondensor (3).
Labu ini dipanaskan, pelarut menguap dan
bergerak naik ke kondensor.
Uap diubah menjadi cairan yang menetes ke
ruang ekstraksi yang berisi sampel.
Ruang ekstraksi dirancang sedemikian rupa
sehingga ketika pelarut sekitar sampel melebihi
tingkat tertentu akan melimpah dan mengalir
kembali ke dalam labu didih.
48
Proses ekstraksi dapat berlangsung beberapa jam.

Ekstraksi Soxhlet

49

Ekstraksi fluida Superkritis

Teknik

ini relatif baru sebagai metode

ekstraksi

Ekstraksi fluida superkritis (SFE) telah diterapkan

untuk persiapan sampel pada skala analitis.
Teknik ini mirip ekstraksi Soxhlet kecuali bahwa
pelarut yang digunakan adalah cairan superkritis.
(material pada suhu dan tekanan kritis).
Keuntungan utama menggunakan SFE adalah tidak
digunakan pelarut organik, sehingga mengurangi
masalah limbah di laboratorium.

50

Ekstraksi fluida Superkritis

Diagram fasa sistem tiga komponen

51

Ekstraksi fluida Superkritis

Critical properties of various solvents (Reid et al, 1987)
Solvent

Molecular
weight g/mol

Critical
temperature K

Critical pressure
MPa (atm)

Critical density
g/cm3

Carbon dioxide (CO2)

44.01

304.1

7.38 (72.8)

0.469

Water (H2O)

18.02

647.3

22.12 (218.3)

0.348

Methane (CH4)

16.04

190.4

4.60 (45.4)

0.162

Ethane (C2H6)

30.07

305.3

4.87 (48.1)

0.203

Propane (C3H8)

44.09

369.8

4.25 (41.9)

0.217

Ethylene (C2H4)

28.05

282.4

5.04 (49.7)

0.215

Propylene (C3H6)

42.08

364.9

4.60 (45.4)

0.232

Methanol (CH3OH)

32.04

512.6

8.09 (79.8)

0.272

Ethanol (C2H5OH)

46.07

513.9

6.14 (60.6)

0.276

Acetone (C3H6O)

58.08

508.1

4.70 (46.4)

0.278

52

Ekstraksi fluida Superkritis

Ekstraksi

ini memanfaatkan sifat khas dari CO 2

dimana gas ini bersifat nonpolar dan mudah mencair
dengan memberikan tekanan.

Sifat

nonpolar gas CO2 menyebabkan mudah

melarutkan banyak senyawa organik yang pada
umumnya bersifat nonpolar.

Daya

larut CO2 dapat ditingkatkan atau dikurangi

dengan memvariasikan tekanan dan temperatur.

Kepolaran

CO2 dapat ditingkatkan dengan

menambahkan sedikit pelarut lain (modifer) seperti
metanol, isopropanol, asetonitril, air atau benzena.

53

Ekstraksi fluida Superkritis

Keutungan cara ekstraksi fluida super kritis :
Ekstraksi hanya memerlukan waktu yang sangat singkat
antara 30 menit sampai 2 jam.Dapat menghasilkan persen
ekstraksi yang mendekati 100 % sehingga seluruh zat dapat
terekstrak seluruhnya dari matriknya.
Cara

(teknik) analisis lebih sederhana dan biaya relatif

murah karena harga CO2 yang murni jauh lebih murah
dibandingkan pelarut-pelarut yang lain.

Sangat
Tidak

cocok untuk megekstraksi zat yang tidak tahan panas.

membahayakan lingkungan karena CO2 tidak beracun.

54

Ekstraksi fluida Superkritis

Zat yang diekstraksi

Waktu ekstraksi
Soxhlet

Fluida Super Kritis

Poli Hidrokarbon

24 jam

15 menit

aromatik/ PAH
Lilin (Wax)

16 jam

45 menit

Lemak

7 jam

10 menit

Alkana

48 jam

15 menit

dioksin

20 jam

2 jam

55

Ekstraksi fluida Superkritis

Prinsip Instrumentasi Ekstraksi SFE

56

Tahap 2 : Clean Up
Ekstraksi Fasa Padat/SPE

Ekstraksi fasa padat/Solid phase extractions (SPE) adalah

metode ekstraksi yang menggunakan fase padat dan fase cair
untuk mengisolasi satu, atau satu jenis analit dari
larutannya.
Hal ini biasanya digunakan untuk membersihkan sampel
sebelum menggunakan metode analisis kromatograf atau
lainnya.
Prosedur umum: memasukan larutan ke fase SPE, mencuci
komponen dari yang tidak diinginkan, kemudian membilas
dengan pelarut analit yang diinginkan dan ditampung ke
57
dalam tabung koleksi.

Ekstraksi Fasa Padat/SPE

Ekstraksi Fasa Padat menggunakan jenis fasa diam

yang sama seperti yang digunakan dalam
kromatograf kolom cair.
Fasa diam ditempatkan didalam kolom gelas atau
kolom plastik di atas wol atau kaca berpori.
Ujung kolom mungkin berlobang atau memiliki kran
(stopcock) untuk mengontrol aliran pelarut melalui
kolom.
SPE komersial kapasitas kartridnya 1-10 mL dan
dibuang setelah digunakan..

58

Ekstraksi Fasa Padat/SPE

Tahapan prosedur SPE

59

Ekstraksi Fasa Padat/SPE

Cartridge SPE
60

Ekstraksi Fasa Padat/SPE

Cartridge SPE komersial sekali pakai

61

Ekstraksi Fasa Padat/SPE

Gambar di bawah menunjukkan cartridge yg

dipasang pada vacuum manifold, untuk
meningkatkan laju alir pelarut yang melalui
cartridge.
Sebuah tabung koleksi ditempatkan di bawah
kartrid SPE (di dalam vacuum manifold untuk
contoh pada gambar) untuk mengumpulkan
cairan yang keluar dari ujung cartridge.
62

Ekstraksi Fasa Padat/SPE

63

Vacuum manifold SPE

Analisis Kualitatif

Tingkat kompleksitas sampel ditunjukkan dengan

jumlah puncak yang muncul.
Informasi kualitatif tentang komposisi sampel
diperoleh dengan membandingkan posisi puncak
dengan senyawa standar (dengan membandingkan
waktu retensi)
Jika digunakan detektor MS atau MSMS, analisis
kualitatif dapat diperoleh dari :
Waktu

retensi, Q1 dan Q2
Dirujuk dari data spektrum senyawa yang tersimpan di
Komputer.

64

Analisis Kualitatif

65

Analisis Kualitatif

66

Analisis Kualitatif

67

Analisis Kualitatif

68

Analisis Kuantitatif

Penilaian kuantitatif, konsentrasi relatif dari

komponen diperoleh dari perbandingan luas puncak
terhadap senyawa standar yang kadarnya diketahui.
Ada 4 metode penentuan kuantitatif
Normalisasi

luas puncak
Eksternal standar
Internal standar
Standar addisi

69

70

Normalisasi luas puncak

Suntikkan

campuran dengan jumlah yang sama

dari semua komponen

Luas

masing-masing puncak diukur tepat

Replikasi (5 +) suntikan
Perlu presisi yang baik
Salah satu komponen dipilih sebagai acuan

Luas

puncak yang satu dinormalisasikan

terhadap luas puncak yang lain
Didapatkan faktor Respon detektor (DRF)

71

NORMALISASI LUAS PUNCAK

72

External Standard

Injeksikan standar sebelum dan / atau setelah

menganalisis sampel
Standar akan berada pada kromatogram yang
berbeda
Tergantung pada kemampuan bereproduksi
injeksi yang baik
Kadar sampel dihitung dengan membanding kan
luas puncak sampel dengan puncak senyawa
standar.

73

External Standard

74

Internal Standard

Menghilangkan kesalahan yang disebabkan

penyuntikan yang tidak akurat
Sebuah senyawa standar sebagai acuan
disertakan dalam setiap sampel dengan
konsentrasi yang diketahui secara akurat
Kadar sampel dihitung dengan membanding kan
luas puncak sampel dengan puncak senyawa
standar.
75

Standar Addisi

Sampel dianalisis
Senyawa standar yang diketahui kadarnya
ditambahkan ke dalam sampel, dilakukan analisis
ulang
Kadar sampel dihitung dengan membanding kan
luas puncak sampel dengan puncak senyawa standar.
Dapat digunakan untuk verifkasi linearitas
76

Standar Addisi

77

Standar Addisi

78

TERIMAKASIH

79