Pengecatan Gram merupakan salah satu teknik pengecatan yang dikerjakan di laboratorium

mikrobiologi untuk kepentingan identifikasi mikroorganisme. Morfologi mikroskopik mikroorganisme

yang diperiksa dan sifatnya yang khas terhadap pengecatan tertentu (pengecatan Gram) dapat
digunakan untuk identifikasi awal. Pemeriksaan ini dapat dilakukan dengan cepat dan biaya murah serta,
dalam kasus tertentu, dapat membantu dokter untuk memulai terapi suatu penyakit tanpa menunggu
hasil kultur. Metode pengecatan tersebut pertama kali ditemukan oleh Christian Gram pada tahun 1884.
Dengan metode pengecatan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif
dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri
tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya. Oleh karena itu, pengecatan Gram tidak bisa
dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp.

PERSIAPAN

Sebelum dilakukan pengecatan Gram, tentu harus disiapkan bahan (spesimen) yang akan diperiksa.
Bahan yang akan diperiksa, dapat berasal dari : 1) langsung dari penderita dapat berupa sputum (dahak),
pus (nanah), discharge telinga, discharge hidung, urin dan cairan serebrospinal.

Spesimen yang akan dicat, sebelumnya dibuat sediaan atau preparat (smear) terlebih dulu. Pengertian
preparat adalah sampel spesimen yang diletakkan atau dioleskan pada permukaan gelas obyek (object
glass) atau slides, dengan atau tanpa pewarnaan, yang selanjutnya dapat diamati di bawah mikroskop.
Pembuatan preparat

Alat dan bahan yang diperlukan adalah :

Alat :
Ose atau kapas lidi steril
Gelas obyek
Lampu spiritus

Bahan :
Bahan yang akan diperiksa.

Untuk bahan yang berbeda, memerlukan cara pembuatan preparat yang berbeda pula. Berikut cara
pembuatan preparat untuk berbagai sumber bahan.

a.1. Bahan langsung dari penderita

Bahan disentrifuge terlebih dulu, kemudian endapannya dibuat preparat. Bahan yang berupa endapan
(pellet) hasil sentrifuge tersebut diambil dengan ose steril atau kapas lidi steril kemudian digoreskan
pada gelas obyek setipis mungkin. Panaskan gelas obyek di atas nyala api lampu spiritus sambil
diayunkan secukupnya (jarak preparat sampai nyala api kira-kira 20 cm), sampai preparat tersebut
kering. Setelah kering, teteskan formalin 1 % tunggu selama 5 menit dan keringkan sekali lagi. Setelah
betul-betul kering, preparat siap dicat.

a.2. Bahan dari biakan cair

Ambil gelas obyek yang bersih dan steril, bebaskan dari lemak dengan memanaskan di atas nyala api
spiritus. Ambil kuman dari biakan cair (yang sebelumnya telah diaduk secara steril) dengan
menggunakan ose steril, ratakan pada gelas obyek sehingga membentuk diameter kira-kira 1-2 cm.
Preparat yang sudah dibuat kemudian dikeringkan dan ditetesi formalin dengan cara seperti pembuatan
preparat langsung.

a.3. Bahan dari media pertumbuhan padat

Ambil gelas obyek yang bersih dan steril, bebaskan dari lemak dengan memanaskan di atas nyala api
spiritus. Teteskan satu ose kaldu atau NaCl pada gelas obyek tersebut. Dengan ose steril, ambil satu
koloni kuman dan ratakan pada gelas obyek sehingga membentuk diameter 1 – 2 cm, campur dengan
kaldu tadi sampai homogen kemudian tipiskan. Selanjutnya dikerjakan sebagaimana membuat preparat
dengan bahan berasal dari penderita.

Prinsip yang selalu harus diingat dan dipatuhi adalah :

Selalu mensterilkan ose, pada saat akan dipakai dan setelah dipakai.
Letakkan ose pada tempatnya, jangan diletakkan di sembarang tempat (misal di atas meja)
Jangan memegang mata (ujung) ose dengan tangan.
Usahakan tidak banyak bicara pada saat kerja.

Cat Gram

Cat Gram yang digunakan terdiri dari 4 macam, yaitu cat Gram A, B, C dan D. Masing-masing mempunyai
komposisi dan fungsi yang berbeda. Komposisi dan fungsi masing-masing cat Gram, adalah sebagai
berikut :
Cat Gram A

Cat ini terdiri atas :

Kristal violet : 2 gram

Etil alkohol 95 : 20 ml
Ammonium oksalat : 0,8 gram

Akuades : 80 ml

Cat Gram A berwarna ungu (karena mengandung kristal violet). Cat Gram A merupakan cat primer yang
akan memberi warna mikroorganisme target. Pada saat diberi cat ini, semua mikroorganisme akan
berwarna ungu sesuai warna cat Gram A.
Cat Gram B

Cat ini terdiri atas :

Yodium : 1 gram

Kalium Yodida : 2 gram

Akuades : 300 ml

Cat Gram B berwarna coklat. Cat Gram B merupakan cat Mordan, yaitu cat atau bahan kimia yang
berfungsi memfiksasi cat primer yang diserap mikroorganisme target. Akibat pemberian cat Gram B,
maka pengikatan warna oleh bakteri akan lebih baik (lebih kuat).
Cat Gram C

Cat ini terdiri atas :

Aseton : 50 ml

Etil alkohol 95 % : 50 ml

Cat Gram C tidak berwarna. Cat ini berfungsi untuk melunturkan cat sebelumnya. Akibat pemberian cat
C akan terjadi 2 kemungkinan :
Mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu, karena tahan terhadap alkohol. Ikatan antara cat
dengan bakteri tidak dilunturkan oleh alkohol. Bakteri yang bersifat demikian disebut bakteri Gram
positif.
Bakteri akan tidak berwarna, karena tidak tahan terhadap alkohol. Ikatan antara cat dengan bakteri
dilunturkan oleh alkohol. Bakteri yang bersifat demikian dikelompokkan sebagai bakteri Gram negatif.
Cat Gram D

Cat Gram D terdiri atas :

Safranin : 0,25 gram

Etil alkohol 95 % : 10 ml
Akuades : 90 ml

Cat ini berwarna merah. Cat ini merupakan cat sekunder atau kontras. Cat ini berfungsi untuk
memberikan warna mikroorganisme non target. Cat sekunder mempunyai spektrum warna yang
berbeda dari cat primer. Akibat pemberian cat Gram D, akan terjadi 2 kemungkinan :
Bakteri Gram positif akan tetap berwarna ungu, karena telah jenuh mengikat cat Gram A sehingga tidak
mampu lagi mengikat cat Gram D.
Bakteri Gram negatif akan berwarna merah, karena cat sebelumnya telah dilunturkan oleh cat Gram C
maka akan mampu mengikat cat Gram D.

Dasar teori cat Gram

Berdasarkan sifat terhadap cat Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi 2 yaitu bakteri Gram positif
dan Gram negatif. Terdapat dua teori yang dapat menjelaskan dasar perbedaan ini yaitu :
Teori Salton

Teori ini berdasarkan kadar lipid yang tinggi (20 %) di dalam dinding sel bakteri Gram negatif. Zat lipid ini
akan larut selama pencucian dengan alkohol. Pori-pori pada dinding sel membesar, sehingga zat warna
yang sudah diserap mudah dilepaskan dan bakteri menjadi tidak berwarna.

Bakteri Gram positif mengalami denaturasi protein pada dinding selnya akibat pencucian dengan
alkohol. Protein menjadi keras dan beku, pori-pori mengecil sehingga kompleks kristal yodium yang
berwarna ungu dipertahankan dan bakteri akan tetap berwarna ungu.
Teori permeabilitas dinding sel

Teori ini berdasarkan tebal tipisnya lapisan peptidoglikan dalam dinding sel. Bakteri Gram positif
mempunyai susunan dinding yang kompak dengan lapisan peptidoglikan yang terdiri dari 30 lapisan.
Permeabilitas dinding sel kurang, dan kompleks kristal yodium tidak dapat keluar.

Bakteri Gram negatif mempunyai lapisan peptidoglikan yang tipis, hanya 1 – 2 lapisan dan susunan
dinding selnya tidak kompak. Permeabilitas dinding sel lebih besar sehingga masih memungkinkan
terlepasnya kompleks kristal yodium.

CARA PENGECATAN GRAM

Sebelum melakukan pengecatan Gram, siapkan alat dan bahan yang diperlukan.

Pastikan semua alat dan bahan yang diperlukan serta tempat untuk mencuci terletak di tempat yang
terjangkau. Jangan sampai terlalu jauh sehingga menyulitkan dan memakan waktu.
Alat dan bahan yang diperlukan adalah :

Alat :
Rak pengecatan
Kran/sumber air yang mengalir

Bahan :
Cat Gram A, B, C dan D
Preparat yang telah siap untuk dicat

Skema cara pengecatan Gram :

Preparat yang telah siap dicat, digenangi dengan cat Gram A selama 1 – 3 menit

Cat dibuang, lalu preparat dicuci dengan air mengalir

Preparat digenangi cat Gram B selama 0,5 – 1 menit

Cat dibuang, lalu preparat dicuci dengan air mengalir

Preparat ditetesi dengan cat Gram C sampai warna cat tepat dilunturkan.

Cat dibuang, lalu preparat dicuci dengan air mengalir

Preparat digenangi dengan cat Gram D selama 1 – 2 menit

Sisa cat dibuang lalu preparat dikeringkan di udara

Preparat siap diamati dibawah mikroskop

Nirwati, Hera, _______, Pembuatan Preparat dan Pengecatan dalam Petunjuk Praktikum
Mikrobiologi, Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada,
Yogyakarta

Strohl, William A, Rouse,H, Fish

materi referensi:

http://72.14.235.132/search?q=cache:n6ND…
http://www.google.co.id/search?hl=id&cli…

KELEBIHAN DAN KEKURANGAN PENGECATAN GRAM

Kelebihan :
Pengecatan Gram penting sebagai pedoman awal untuk memutuskan terapi antibiotik, sebelum tersedia
bukti definitif bakteri penyebab infeksi (kultur dan tes kepekaan bakteri terhadap antibiotik). Hal ini
karena bakteri Gram positif dan negatif mempunyai kepekaan yang berbeda terhadap berbagai jenis
antibiotika.
Kadang-kadang morfologi bakteri yang telah dicat Gram mempunyai makna diagnostik. Misalnya pada
pemeriksaan Gram ditemukan Gram negatif diplococci intraseluler dari spesimen pus (nana) uretral,
maka memberikan presumptive diagnosis untuk penyakit infeksi gonore.

Kekurangan :

Pengecatan Gram memerlukan mikroorganisme dalam jumlah banyak yakni lebih dari 104 per ml.
Sampel yang cair dengan jumlah kecil mikroorganisme misalnya cairan serebrospinal, memerlukan
prosedur sentrifuge dulu untuk mengkonsentrasikan mikroorganisme tersebut. Pellet (endapan hasil
sentrifuge) kemudian dilakukan pengecatan untuk diperiksa secara mikroskopis.