Kromatografi PDF
Kromatografi PDF
KROMATOGRAFI
Sejarah Kromatografi
Seorang ilmuwan botani dan Rusia, Michael Tswett, pada tahun 1906
dengan suatu percobaan dapat mernisahkan zat warna hijau yang terdapat
pada daun menjadi beberapa komponen. Karoten (kuning oranye/pucat),
feofitin (him keabu-abuan, kadang-kadang tidak tampak), klorofil-b (hijau tua),
klorofil-a (biru kehijauan), dan xantofil (kuning) dapat dipisahkan melalui tabung
yang diisi dengan bubuk kalsium karbonat dan dielusi dengan petroleum eter.
Teori Dasar
1. Polaritas: sifat yang menunjukkan kecenderungan suatu senyawa untuk
mengumpul/mengelompok pada satu kutub.
2. Besarnya polaritas dinyatakan dengan konstanta dielektrika (suatu tetapan
yang menunjukkan besarnya gaya saling tarik antara dua muatan elektrik
pada suatu jarak tertentu di dalam ruang vakum atau di dalam suatu
medium pada suhu tertentu).
3. Seri eluotropik berbagai pelarut, suatu daftar yang menunjukkan besarnya
konstanta dielektrika berbagai senyawa. Udara = 1,00 ; Heksan = 1,874 ;
klorobenzena = 5,9 ; ammonia cair = 15,5 ; air = 80,2 ; asam sianida = 95.
4. Dua atau lebih pelarut organik dapat dicampur untuk mendapatkan
polaritas tertentu. Micible (misibel) adalah pelarut-pelarut yang dapat
bercampur satu sama lain tetapi tidak saling melarutkan. Immicible
(imisibel) adalah pelarut-pelarut yang tidak dapat bercampur dan tidak
saling melarutkan satu terhadap yang lain.
Jenis/Tipe Kromatografi
1. Kromatografi kertas adalah kromatografi yang menggunakan kertas dengan
sifat-sifat tertentu sebagai alat sekaligus media untuk memisahkan
campuran komponen dalam pelarut.
2. Kromatografi lapis tipis ialah kromatografi yang menggunakan matrik yang
dibentuk berupa lapisan tipis pada permukaan lempeng benda padat seperti
kaca, aluminium, atau plastik sebagai media untuk memisahkan campuran
komponen dalam pelarut.
3. Kromatografi kolom yaitu kromatografi yang menggunakan matrik yang
dimasukkan ke dalam tabung sehingga membentuk kolom yang digunakan
sebagai media untuk memisahkan campuran komponen dalam pelarut. Tipe
kromatografi kolom di dalam praktek dapat merupakan:
a. Kromatografi kolom partisi yaitu kromatografi yang menggunakan fase
diam berupa cairan yang diadsorpsikan pada permukaan partikel-
partikel matrik dalam kolom dan menggunakan fase bergerak berupa
cairan.
b. Kromatografi kolom adsorpsi yaitu kromatografi yang menggunakan
fase diam berupa padatan sekaligus sebagai matrik yang dimasukkan
ke dalam suatu tabung dan menggunakan fase bergerak berupa cairan.
c. Kromatografi gel yaitu kromatografi yang menggunakan bahan
penyangga padatan sebagai penyaring molekuler komponen.
d. Kromatografi gas cairan yaitu kromatografi kolom yang mengunakan
fase diam berbentuk cairan dan fase bergerak berbentuk gas.
Hukum Distribusi
Rf dapat diekspresikan sebagai rasio jarak tempuh solut (Am) dan jarak tempuh
fase bergerak/larutan pengelusi (Am+KAs) pada kertas atau lapis tipis, yaitu:
Waktu Retensi
Waktu retensi (tr) = lamanya solut tinggal di dalam sistem kromatografi = waktu
yang diperlukan untuk mengeluarkan solut dan dalam ke luar kolom = waktu
Jika nilai ekivalensi pelat teoritis kecil maka menguntungkan karena akan
menghasilkan kromatogram yang ideal.
Efisiensi Kromatografi
Resolusi
R = resolusi
Atr = jarak antara dua puncak yang memisah
WA = lebar garis dasar puncak A
WB = lebar garis dasar puncak B
Peralatan
Kromatografi kolom partisi menggunakan suatu tabung yang terbuat dari
kaca, nilon, fiberglass, atau logam tahan karat. Pada bagian bawah (dasar)
Peralatan
Pada kromatografi kolom adsorpsi juga digunakan tabung seperti halnya pada
kromatografi kolom partisi dan cara penyiapannya juga tidak berbeda dengan
penyiapan kolom partisi. Partikel-partikel penyangga dibuat sluri dengan
menggunakan pelarut yang akan digunakan sebagai fase bergerak, kemudian
dimasukkan ke dalam tabung dan dibiarkan beberapa waktu lamanya supaya
partikel-partikel penyangga mengendap. Cara memuatkan sampel, teknik
mengelusi, dan pengumpulan fraksifraksi, serta cara-cara analisisnya sama
dengan yang telah diterangkan pada kromatografi kolom partisi. Komponen
yang keluar kolom terlebih dahulu tergantung pada sistem kromatografi yang
digunakan. Pada kromatografi adsorpsi dengan sistem fase normal, maka yang
keluar kolom lebih awal adalah komponen yang mempunyai sifat lebih nonpolar
daripada komponen-komponen yang membentuk puncak kromatogram lebih
akhir. Sebaliknya pada kromatografi adsorpsi dengan sistem fase sungsang,
maka yang membentuk puncak kromatogram lebih awal adalah komponen
yang bersifat lebih polar danpada yang kemudian.
Penggunaan
Pada umumnya kromatografi gel digunakan untuk mengestimasi berat molekul
komponen-komponen bahan. Untuk ini diperlukan beberapa standar dengan
berat molekul yang bervariasi dan diketahui. Dalam praktek, yang sering
dikerjakan adalah menggunakan standar dengan berat molekul 103-106 dalton.
Standar dilarutkan dalam pelarut kemudian dielusikan ke dalam kolom. Standar
dengan berat molekul tinggi akan keluar membentuk puncak kromatogram
terlebih dahulu, makin kecil berat molekulnya akan lama membentuk puncak-
puncak kromatogram, dan yang paling kecil berat molekulnya akan keluar
membentuk puncak kromatogram paling akhir. Dengan demikian akan dapat
dibuat suatu kurva yang menunjukkan hubungan antara waktu retensi dengan
berat molekul.
Ada dua macam kromatografi gas, yaitu kromatografi gas cairan (gas liquid
chromatography, GLC) dan kromatografi gas padatan (gas solid
chromatography, GSC). Fase diam pada kromatografi gas cairan adalah cairan
yang mempunyai titik didih tinggi yang ditahan/diikatkan pada penyangga.
Pemisahan komponen pada kromatografi gas cairan asarkan pada proses
sorpsi partisi. Pada kromatografi gas padatan diam yang digunakan adalah
padatan yang sekaligus berfungsi gai bahan penyerap.
Fase Diam
Persyaratan untuk fase diam harus innert terhadap sampel, bahan penyangga,
dan bahan tabung, dan tidak mudah menguap (nonvolatile), stabil pada suhu
operasi kromatografi, mempunyai kemurnian tinggi, tidak tercampur oleh bahan
lain. Fase diam ada yang bersifat polar misalnya poliester yang berat
molekulnya tinggi, golongan ester, carbowax, amin, dan yang berisfat non-polar
misalnya hidrokarbon, minyak (lemak), silikon. Pada penggunaannya sebaiknya
digunakan fase diam yang mempunyai sifat kimiawi mirip dengan komponen-
komponen yang dipisahkan. Perbedaan polaritas akan menyebabkan tailing
atau fronting. Pemisahan hidrokarbon dengan menggunakan squalane atau
lemak siikon DC200, Pemisahan komponen-komponen yang mempunyai
polaritas yang bervariasi, diperlukan beberapa kali uji coba fase diam dengan
menggunakan fase bergerak yang berbeda-beda sebelum digunakan untuk
sampel.
Fase Bergerak
Merupakan gas pembawa yang ditempatkan dalam tabung bertekanan tinggi
(rata-rata 40 psi) untuk menghasilkan kecepatan aliran gas 10-100cm3/menit.
Gas pembawa harus murni (tidak mengandung uap air, hidrokarbon, atau gas-
gas lain). Yang populer adalah nitrogen, gas argon, gas helium, dan gas
hidrogen. Penggunaanya tergantung pada jenis detektor yang digunakan,
ketersediaan gas, dan biaya/harga.
Bahan Penyangga
Fungsi bahan penyangga untuk kromatografi gas cairan adalah sebagai bahan
yang mengikat/menahan fase diam berbetuk cairan atau gas, sedangkan pada
kromatografi gas padatan berfungsi sebagai fase diam. Persyaratan untuk
bahan penyangga adalah innert, murni (tidak tercampur bahan lain, dan logam,
Kolom
Kolom yang dapat digunakan pada kromatografi gas ada dua macam, yaitu
kolom tertutup (packed column) dan kolom terbuka(open-tubular column atau
capillary column). Kolom tertutup berukuran panjang 1- 20m, diameter 3-10mm
atau 0,125-0,375in. Garis tengah kolom sangat menentukan
kapasitas/kemampuannya. Kolom tertutup umumnya mempunyai lapisan
teoritis kurang daripada 10.000 (rata-rata 1000- 3000/ 1m). Kolom terbuka
berukuran panjang 10-50m, diameter 0,2-1,2mm. Cara preparasi kolom terbuka
ada dua macam, yaitu wallcoated open tubular (WCOT, melapisi langsung
dinding bagian dalam tabung dengan fase diam berbentuk cairan) dan support-
coated open tubular (SCOT, melapisi dinding bagian dalam tabung dengan
sluri campuran bahan penyangga dengan fase diam). WCOT bergaris tengah
0,25mm, panjang 50- 150m, ketebalan lapisan fase diam 1pm. SCOT bergaris
tengah rata-rata 0,5mm, panjang 16m, jumlah lapisan teoritis 600.000 (rata-rata
Injection Port
Tempat untuk memasukkan sampel (cair) dinamakan injection port. Cara
memasukkan sampel dapat secara on-column injection atau secara flash
evaporation (biasanya hanya digunakan untuk sampel yang mempunyai titik
didih sangat tinggi). Hexaport adalah ijection port untuk sampel berbentuk gas,
sedangkan injection splitter adalah injection port untuk kolom kapiler. Jumlah
sampel tergantung pada kemampuan/kapasitas kolom dan kepekaan detektor.
Kapasitas kolom kapiler rata-rata 0,01l. Sampel berbentuk cairan (larutan)
encer cukup 0,1-10l, sedangkan sampel berbentuk gas : 1-10ml. Jika
digunakan kolom kapiler, maka jumlah sampel cairan cukup 10-3 - 10-2pl.
Prekolom dapat menampung sampel sampai 20l. Splitter dapat memasukkan
sampel ke dalam kolom kapiler 0,05-0,0001 dan banyaknya sampel yang
diinjeksikan. Untuk memasukkan sampel ke dalam kolom dapat digunakan
automatic sampler. Keuntungannya dapat menghindari terjadinya gelembung
udara dalam siring yang jika diinjeksikan adanya gelembung udara dapat
menyebabkan kromatogram tidak sempurna, dapat mengurangi sisa sampel
yang tertinggal, mengukur jumlah sampel lebih tepat, dapat menghasilkan
kromatogram yang reprodusibel dan lebih presisi daripada jika dilakukan secara
manual. Dengan alat ini juga dapat dilakukan pekerjaan lainnya sementara
pemuatan sampel berlangsung.
Detektor
Fungsi detektor adalah mendeteksi komponen-komponen yang dipisahkan
setelah melalui kolom. Berbagai macam detektor dapat digunakan, antara lain:
Kelemahan pada kromatografi kolom, baik yang partisi, adsorpsi, atau pun
kromatografi gel, adalah waktu operasinya yang lama. Selain itu waktu yang
lama dapat memberikan peluang kemungkinan terjadinya perubahan sifat pada
komponen atau sampel. Dengan memberikan tekanan yang tinggi, maka aliran
eluen melewati kolom dapat dipercepat sehingga waktu operasi dapat
diperpendek. HPLC sangat fleksibel penggunaannya, dapat digunakan untuk
memisahkan dan menganalisis hampir semua komponen atau senyawa dalam
bahan. Berdasarkan tekanan yang tinggi yang dipergunakan pada HPLC, maka
Peralatan
Teknik kromatografi dapat dilakukan pada pelat yang dilapisi dengan bahan
penyangga. Sebagai pelat dapat digunakan kertas, kaca, lembaran aluminium,
atau fiberglass. Khusus jika kertas yang digunakan, maka kertas berfungsi
ganda, yaitu sebagai pelat sekaligus sebagai bahan penyangga. Kertas
merupakan selulosa yang dapat menyerap eluen sehingga sistem yang terjadi
adalah partisi. Meski pun demikian peristiwa adsorpsi juga terjadi pada
kromatografi kertas. Jenis kertas yang digunakan pada umumnya adalah kertas
Whatman No. 4, 54, 540, 31, dan No. 17, atau jenis kertas lainnya yang
semacam. Perlu diketahui bahwa kerapatan dan ketebalan kertas akan
berpengaruh pada kecepatan aliran eluen, sehingga juga akan berpengaruh
pada kesempurnaan pemisahan komponen-komponen. Ukuran kertas yang
Pemuatan Sampel
Sampel sebelum diaplikasikan pada kertas atau lapis tipis harus dibuat larutan
dahulu. Larutan sampel kemudian diteteskan pada kertas atau lapis tipis pada
salah satu tepinya dengan jarak kurang lebih 2, 5 cm dan tepi. Tetesan sampel
diusahakan sekecil mungkin, maka sebaiknya menggunakan pipa kapiler, pipet
Visualisasi Hasil
Setelah perrnukaan eluen mencapai batas yang ditentukan, kertas atau lapis
tipis diambil (diangkat) dan dikeluarkan dari dalam tangki, kemudian
dikeringkan pada suhu kamar sampai semua eluen menguap. Tempat
komponen yang memisah dapat diketahui dengan visualisasi. Ada beberapa
teknik visualisasi yang dapat dikerjakan tergantung pada jenis dan sifat
komponen yang dipisahkan. Visualisasi secara fisik dapat dilakukan dengan
sinar ultra violet atau dengan pengeringan pada suhu tinggi. Visualisasi dengan
penyinaran atau dengan pengeringan menyebabkan timbulnya warna pada
komponen. Aflatoksin misalnya akan tampak bersinar putih kehijauan dengan
sinar ultra violet. Visualisasi dapat pula secara kimiawi yang dapat dilakukan
dengan nyemprotkan suatu larutan atau senyawa yang dapat mengadakan
reaksi dengan komponen sehingga timbul wama. Kombinasi visualisasi secara
kimiawi dan secara fisik sering kali juga dilakukan, misalnya pada suhu 100oC,
maka warna ungu akan timbul.
Tabel 3.
Reagent kromogenat untuk visualisasi kromatogram pada teknik kromatografi
kertas dan lapis tipis