Penentuan Kadar Tablet Asetosal dengan Menggunakan Metode

HPLC (High Performance Liquid Chromatography)

Maura Syafa Islami

260110150163

Jurusan Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Padjadjaran, Jatinangor,

Sumedang

Abstrak
Telah dilakukan optimasi sistem dan penetapan kadar sampel tablet asetosal
dengan metode HPLC. HPLC (High Performance Liquid Chromatography)
merupakan teknik pemisahan yang paling sering digunakan untuk menetapkan
kadar senyawa-senyawa tertentu, salah satunya adalah zat aktif dalam obat. Dari
hasil optimasi, diketahui sistem yang baik untuk sampel adalah fasa gerak
metanol:air (62:38), laju alir 1mL/menit dan menggunakan fasa diam silika C18,
sedangkan dari pengujian, didapatka sampel asetosal sebesar 107% per tablet. Hal
ini sesuai dengan syarat yang ditetapkan oleh Farmakope Indonesia.
Kata kunci: HPLC, asetosal, fasa gerak, optimasi

Qualitative and Quantitative Analysis of Raw Materials

Amoxicillin
Abstract
System optimization has been done and the assay samples acetosal tablets by
HPLC method. HPLC (High Performance Liquid Chromatography) is a separation
technique that is most commonly used to define the levels of certain compounds,
one of which is the active ingredient in the drug. From the results of the
optimization, it is known that a good system for the sample is the mobile phase of
methanol: water (62:38), flow rate 1mL / min and using a silica C18 stationary
phase, while of testing, the sample didapatka asetosal by 107% per tablet. This is
in accordance with the conditions set by the Indonesian Pharmacopoeia.
Keyword: HPLC, acetosal, mobile phase, optimization

PENDAHULUAN HPLC (High Performance Liquid

Chromatography) merupakan teknik
Banyak obat-obat familiar
pemisahan yang paling sering
yang mengandung struktur aromatik
digunakan untuk menetapkan kadar
yang umumnya merupakan gugus
senyawa-senyawa tertentu seperti
kromofor, termasuk analgesik OTC
asam-amino, asam-asam nukleat, dan
(Over The Counter) seperti aspirin
protein-protein dalam cairan
(Snape, 2013). Kromofor merupakan
fisiologis; menentukan kadar
kelompok atom yang bertanggung
senyawa-senyawa aktif obat; dan
jawab terhadap absorbsi sinar UV/Vis
lain-lain (Gandjar dan Rohman,
yang secara prinsip akan memberikan
2012).
warna terhadap molekul (Bayne dan
Carlin, 2010). Fasa terbalik adalah bentuk
yang paling umum digunakan pada
Aspirin atau asam 2-
metode HPLC. Pada umumnya fasa
(asetiloksi)-benzoat merupakan
terbalik ini memiliki ukuran kolom
inhibitor siklooksigenase yang
yang sama, namun silika dibuat
digunakan sebagai agen antipiretik,
menjadi nonpolar dengan
analgesik, antiinflamasi, dan
menambahkan rantai hidrokarbon
antitrombotik (Gujarathi, 2010).
panjang (biasanya 8-18 atom karbon)
Beberapa metode yang dapat pada permukaannya. Kemudian
diterapkan untuk pengestimasian pelarut polar akan digunakan sebagai
aspirin baik tunggal maupun dalam fasa gerak, misalnya air dan alkohol
kombinasi dengan obat lainnya seperti metanol (Clark, 2016).
seperti UV, HPLC fasa terbalik,
Zat dengan kepolaran berbeda
HPTLC, spektrofluorometrik, dan
dapat dipisahkan dengan HPLC
spektrometri (Jain, et.al, 2012).
berdasarkan partisi cair-cair. Prinsip
Kromatografi cair kinerja HPLC menggunakan prinsip
tinggi (KCKT) atau biasa juga disebut kromatografi adsorbsi dan banyak
digunakan dalam industi farmasi dan glasial terlebih dahulu. Kemudian
pestisida (Khopkar, 1990). baku asetosal dilarutkan dengan
metanol (larutan pengencer) hingga
Photodiode Array Detector
mencapai konsentrasi 500ppm.
(PDA, atau yang dikenal dengan
deodearray detector (DAD), Penyesuaian sistem dilakukan,
menyediakan spektrum UV dari meliputi variasi perbandingan serta
puncak elusi juga sebagai detektor variasi laju alir. Perbandinga
absorbansi UV/Vis multiwavelength metanol:air yang dilakukan adalah
(Dong, 2006). (100:0; 90:10; 80:20; 70:30; 60:40;
50:50: 40:60; 30:70; 20:80; 10:90;
METODE
dan 0:100), dan variasi laju alir adalah
a. Alat 9,75mL/min; 0,80mL/min;

Alat yang digunakan dalam 0,85mL/min; 0,90mL/min;

praktikum antara lain perangkat 0,95mL/min; dan 1,00mL/min.

HPLC, pH meter, beaker gelas, gelas Langkah selanjutnys adalah

ukur, vial, kertas saring dan pipet dilakukan uji kesesuaian sistem
volume. dengan cara menginjeksian baku

b. Bahan asetosal sebanyak 6 kali dan

menghitung hasil AUC serta standar
Bahan-bahan yang digunakan
deviasinya.
adalah metanol, tablet asetosal,
asetosal baku, asam asetat glasial, dan Setelah diketahui sistem yang

aquadest. sesuai dengan asetosal, dibuat kurva

baku dengan mengencerkan larutan
c. Prosedur
stok asetosal menjadi 80ppm, 60ppm,
40ppm, dan 20ppm.

Setelah alat dan bahan disiapkan, Preparasi sampel asetosal

dibuat fasa gerak yang terdiri dari dilakukan dengan menimbang 20
metanol:air (30:70) dengan pH air tablet asetoal lalu digerus dan diambil
dibuat 2,98 menggunakan asam asetat 100mg lalu diencerkan dengan
metanol hingga 20mL dan disonikasi. metanol:air (62:38), laju alir
Setelah semuanya selesai dilakukan, 1mL/min, dan detektor UV 278nm.
pengujian kadar asetosal dengan Dari hasil AUC yang didapat,
menggunakan HPLC dilakukan. Fasa dihitung kadar asetosal dalam tablet.
gerak yang digunakan adalah

HASIL

a. Pembuatan Fase Gerak

No. Perlakuan Hasil Gambar

1. Dicampurkan 30 bagian Didapatkan campuran
metanol dengan 70 air dan metanol (70:30)
bagian air.
2. Asam asetat pH air 2,98
ditambahkan ke
sebagian besar volume
air hingga pH 2,98
3. Ditambahkan air hingga Didapatkan fase gerak
volume menjadi 70 bagian air dan metanol (70:30)
(Waliszewski, et.al, 2007)

b. Pembuatan Larutan Pengencer

No. Perlakuan Hasil Gambar

1. Digunakan larutan Didapatkan larutan
pengencer berupa metanol pengencer metanol
(Dhaneshwar, 2012)

c. Preparasi Baku Asetosal

No. Perlakuan Hasil Gambar

1. Asetosal dilarutkan dengan
larutan pengencer hingga Didapatkan larutan
konsentrasinya 500ppm baku asetosal 500ppm
(Depkes RI, 1995)

d. Optimasi Sistem (Variasi Perbandingan Metanol Air)

No. Perlakuan Hasil Gambar

1. Larutan asetosal 20ppm Didapatkan optimasi
diinjeksikan ke dalam sistem fase gerak
sistem dengan metanol-air dengan
menggunakan fase gerak berbagai variasi
metanol:air dalam perbandingan
beberapa perbandingan
(100:0; 90:10; 80:20;
70:30; 60:40; 50:50:
40:60; 30:70; 20:80;
10:90; dan 0:100)
(Bhusari & Dhaneswar, 2012)

e. Optimasi Sistem (Variasi Laju Alir)

No. Perlakuan Hasil Gambar

1. Pengujian laju HPLC Didapatkan optimasi
dilakukan berulang dengan sistem fase gerak
membuat variasi laju alir metanol-air dengan
yakni, 9,75mL/min; berbagai variasi laju
0,80mL/min; 0,85mL/min; alir
0,90mL/min; 0,95mL/min;
dan 1,00mL/min
(Siyakumar, et.al, 2007)
 f. Uji Kesesuaian Sistem

No. Perlakuan Hasil Gambar

1. Sistem yang telah
dioptimasi diuji
kesesuaiannya dengan
melakukan 6 kali
penginjeksian
2. Hasil AUC tiap Didapatkan AUC tiap
penginjeksian dicatat penginjeksian dan
lalu dihitung standar standar deviasinya
deviasinya
(Depkes RI, 1995)
g. Pembuatan Kurva Baku

No. Perlakuan Hasil Gambar

1. Dipipet larutan stok Didapatkan larutan
asetosal 200ppm asetosal 80ppm
sebanyak 4mL, lalu
diencerkan dengan
metanol hingga 10mL
2. Dipipet larutan stok Didapatkan larutan
asetosal 200ppm asetosal 60ppm
sebanyak 3mL, lalu
diencerkan dengan
metanol hingga 10mL
3. Dipipet larutan stok Didapatkan larutan
asetosal sebanyak 2mL, asetosal 40ppm
lalu diencerkan dengan
metanol hingga 10mL
4. Dipipet larutan stok Didapatkan larutan
asetosal 100ppm asetosal 20ppm
 sebanyak 1mL, lalu
diencerkan dengan
metanol hingga 10mL

h. Preparasi Sampel Asetosal

No. Perlakuan Hasil Gambar

1. 20 tablet asetosal digerus Didapatkan berat total
lalu ditimbang 20 asetosal 5,3735g,
sehingga berat rata-rata
per tablet adalah 0,27g.
2. Ditimbang 100mg Didapatkan 100mg
asetosal yang sudah sebuk asetosal dalam
menjadi serbuk dan labu ukur 20mL
dimasukkan ke dalam
labu ukur
3. Ditambahkan sebagian Didapatkan larutan
larutan pengencer asetosal dalam labu
ukur 20 mL
4. Larutan disonikasi, Didapatkan larutan
kemudian ditambahkan asetosal 20mL dengan
larutan pengencer konsentrasi 5000ppm
hingga volumenya
20mL
5. Selanjutnya dilakukan Didapatkan variasi
pengenceran pada larutan asetosal
konsentrasi 500, 100,
dan 60 ppm
(Depkes RI, 1995)
 i. Penetapan Kadar Asetosal

No. Perlakuan Hasil Gambar

1. Sistem HPLC dibuat Didapatkan sistem
dengan fase gerak HPLC dengan fasa
metanol: air (62:38) gerak metanol:air
dengan laju alir (62:38) dengan laju alir
1mL/min dan detektor 1mL/min.
UV 278nm
2. Lalu, larutan baku dan Didapatkan larutan
larutan sampel baku dan larutan sampel
diinjeksikan secara diinjeksikan ke dalam
terpisah ke dalam kromatografi.
kromatografi sebanyak
1 L.
3. Kemudian diukur Didapatkan kadar
respon puncak utama, asetosal per tablet
dan dihitung jumlah sebesar 107%.
mg asetosal dalam
bagian tablet
(Depkes RI, 1995)
j. Data Optimasi HPLC
k. Perhitungan

A. Optimasi Kondisi HPLC Terhadap Zat Aktif Asetosal

Fase gerak metanol : air (30 : 70), laju alir 1 mL/menit pada
panjang gelombang 227 nm

1) Jumlah Lempeng Teoritis

GRAFIK 1 GRAFIK 2
2
2
= 16 ( ) = 16 ( )

87,3 2 88,8 2
= 16 ( ) = 16 ( )
1,2 1
= 84.681 = 126.176,04

2) Faktor Kapasitas
GRAFIK 1 GRAFIK 2
10
K =
10 K = 0
0
88,871,28
K =
87,362,34 K = 71,28
62.34

K = 0,40 K = 0,24

3) Resolusi
GRAFIK 1 GRAFIK 2
2 (2 1 ) 2 (2 1 )
Rs = (1 +2 )
Rs = (1 +2 )

2 (127,9887,3) 2 (136,8 88,8)

Rs = Rs = (60+12)
(72+51)

Rs = 0,661 Rs = 1,33

4) % RSD
GRAFIK 1 1379,21+ 144258
X= = 761,7
1 2
AUCasetosal = 2 x W x T (X1-X2) = (1379,21-761,7)2
2

AUCasetosal = 1379,21 = 381318,6

(X1-X2)2 = (144,258-761,7)2
GRAFIK 2 = 381234,62
1 100 762553,2 1/2
AUCasetosal = 2 x W x T SR(%) = 761,7 [ ]
21
AUCasetosal = 144,258 SR(%) = 0,13 x 873,24
SR(%) = 113,5%
100 ( )2 1/2
SR(%) = [ ]
1 113,5
%RSD = 761,7 x 100%

%RSD = %RSD =15%
Grafik Rs K N %RSD
I 0,66 0,40 84.681
15%
II 1,33 0,24 126.176,04

Fase gerak metanol : air (30 : 70), laju alir 1 mL/menit pada
panjang gelombang 278 nm

1) Jumlah Lempeng Teoritis

GRAFIK 1 GRAFIK 2
2 2
= 16 ( ) = 16 ( )

1,455 2 1,480 2
= 16 ( ) = 16 ( )
26,36 26,17
87,3 2 88,8 2
= 16 ( ) = 16 ( )
26,36 26,17
= 175,5 = 184,22

2) Resolusi
GRAFIK 1 GRAFIK 2

2 (2 1 ) 2 (2 1 )
Rs = (1 +2 )
Rs = (1 +2 )
2 (1,455 0,909) 2 (1,480 1,188)
Rs = (20,55+ 26,36)
Rs = (21,35+26,17)
2 (87,3 54,54) 2 (88,8 71,28)
Rs = (20,55+ 26,36)
Rs = (21,35+26,17)

Rs = 1,397 Rs = 0,73

3) AUC
GRAFIK 1 GRAFIK 2

1 1
AUC asetosal = 2 AUC asetosal = 2
1 1
224206 = 2 17010 226496 = 2 17311

W = 26,36 W = 26,17

1 1
AUC noise= 2 AUC noise= 2
 1 1
1398 = 2 136 3213 = 2 301

W = 20,55 W = 21,35

4) % RSD
1/2
100 ()2
SD = [ ]
1
100
SD = 225351
1/2
(224206225351)2 + (226496225351)2
[ ]
21

1311025+ 1311025 1/2

SD = 4,437 x 10-4 [ ]
1

SD = 4,437 x 10-4 (2622050

SD = 0,71845

Grafik Rs N
I 0,0232 0,0488
II 0,0123 0,0512

Kromatogram Kurva Baku

 AUC
C AUC 1 AUC 2
Rata"
20 64368 69666 67017
40 126332 121729 124030.5
60 186838 160643 173740.5
80 225350 241560 233455

278 nm
90
80 y = 0,0004x - 4,4217
70 R = 0,9989
60
50
40
30
20
10
0
0 50000 100000 150000 200000 250000

B. Proses Penentuan Kadar Tablet Asetosal Dengan Metode HPLC

Perhitungan pengenceran kurva baku
1) 80 ppm, 10 mL 2) 60 ppm, 10 mL
1 x 1 = 2 x 2 1 x 1 = 2 x 2
10 x 80 = 2 x 200 10 x 60 = 2 x 200
2 = 4 mL 2 = 3 mL
 3) 40 ppm, 10 mL 4) 20 ppm, 10 mL
1 x 1 = 2 x 2 1 x 1 = 2 x 2
10 x 40 = 2 x 200 10 x 20 = 2 x 200
2 = 2 mL 2 = 1 mL

Perhitungan pengenceran larutan sampel

1) 5000 ppm 1 = 1 mL
100 mg serbuk asetosal 3) 100 ppm, 10 mL
dalam 20 mL larutan 1 x 1 = 2 x 2
pengencer. 1 x 500 = 10 x 100
100 100
= 5000 ppm 1 = 2 mL
20

2) 500 ppm, 10 mL 4) 60 ppm, 10 mL

1 x 1 = 2 x 2 1 x 1 = 2 x 2

1 x 5000 = 10 x 500 1 x 100 = 10 x 60

1 = 6 mL

Perhitungan penentuan AUCrata-rata =

1 + 2
=
2
kadar tablet asetosal 86902+69308
= 78105
2

y = 2754,1x + 12305
 78105 = 2745,1x + 12305 = 107 mg
65800 107
x = 2745,1 = 23,97 % dalam tablet = 100 x
500
23,97
6
20 100% = 107%
= = 0,3994
100000

% Kadar per tablet =

0,3994 5,3735
= 0,107 gram
20

PEMBAHASAN

Telah dilakukan penetapan polar ketika terionisasi. Sifat

kadar asetosal dengan menggunakan
HPLC (High Performance Liquid
Chromatography). Sebelum
dilakukan penetapan kadar sampel,
perlu dilakukan optimasi dengan
menggunakan baku asetosal terlebih
dahulu. Tujuannya adalah agar
diperoleh sistem yang sesuai dengan
sampel sehingga dapat diperoleh hasil
pemisahan yang baik.
Asetosal atau aspirin
merupakan asam yang sangat lemah,
yang berarti iti zat ini tidak banyak
terdisosiasi. Aspirin memiliki tiga
gugus yaitu gugus asam karboksilat,
ester, dan aromatik (cincin benzen).
Menurut DeLorenzo (1981), aspirin
bersifat sedikit polar (karena terdapat
gugus yang dapat berikatan hidrogen)
ketika tidak terionisasi dan relatif non
kepolaran inilah yang membuat
asetosal dapat dipisahkan dengan
HPLC karena prinsip kerja dari HPLC
adalah pemisahan senyawa
berdasarkan polaritas. HPLC yang
digunakan adalah fasa terbalik yang
dimana fasa diam merupakan silika
yang dilapisi oleh senyawa yang
terdiri dari 18 atom karbon (Silika
C18), sehingga senyawa yang bersifat
lebih nonpolar dari asetosal akan
teradsorbsi di permukaan fasa diam.
Adsorpsi menurut Day dan
Underwood (2002) merupakan
kecenderungan suatu senyawa untuk
berkumpul di permukaan zat padat.
Asetosal atau asam asetil
salisilat memiliki gugus autokrom (-
OH) dan gugus kromofor (- CO)
sehingga bisa menyerap sinar UV
yang merupakan detektor yang yang dipakai semakin tidak efektif.
umumnya digunakan dalam HPLC. Ukuran efisiensi kolom adalah
jumlah lempeng yang didasarkan
pada konsep lempeng teoritis pada
distilasi. Faktor kapasitas
merupakan ciri khas suatu analit pada
kondisi tertentu, yaitu pada komposisi
Parameter optimasi tersebut fase gerak, suhu dan jenis kolom
antara lain resolusi (daya pisah) yang (panjang kolom, diameter kolom dan
didefinisikan sebagai perbedaan ketebalan lapisan film) tertentu.
antara waktu retensi 2 puncak yang
Dari baku asetosal dan
saling berdekatan. Nilai Rs yang baik
pengujian kesesuaian sistem,
adalah yang mendekati atau lebih dari
didapatkan hasil bahwa perbandingan
1,5 karena akan memberikan
metanol : air (62: 38) dan laju alir
pemisahan puncak yang baik (base
1mL/menit adalah yang terbaik
line resolution). Selain itu ada pula
dilihat dari parameter yang telah
simpang baku relatif (Relative
disebutkan. Sedangkan perbandingan
Standar Deviation, RSD) yang di
fasa gerak metanol:air (70:30)
mana menurut USP selain dinyatakan
memiliki %RSD yang terlalu besar
lain, untuk injeksi sebannyak 5 kali
yaitu 15% di mana nilai ini sangat
nilai RSD harus lebih kecil atau sama
jauh dari syarat yang ditentukan untuk
dengan 2%, dan untuk injeksi di atas.
penginjeksian 6 kali, dan nilai Rs di
Faktor pengekoran atau tailing
bawah 1,5 menjadikan perbandingan
factor yaitu terjadinya pengekoran
fasa gerak ini kurang baik untuk
pada kromatogram menjadi tidak
digunakan.
simetris. Kromatogram yang
memberikan nilai TF=1 menunjukkan Setelah didapatkan kondisi
bahwa kromatogram tersebut optimum, barulah sampel dapat diuji
simetrsis, namun jika TF>1 artinya dengan menggunakan HPLC. Dari
kromatogram tersebut asimetris. hasil kromatogram yang dihasilkan
Semakin besar nilai TF maka kolom oleh detektor, dapat diketahui AUC
sampel. Kemudian dengan
memasukkan nilai AUC sebagai y
ke dalam persamaan linier, dapat
diketahui konsentrasi dari sampel
asetosal tersebut.

Dari perhitungan, didapatkan

kadar asetosal sebesar 107,36% pada
setiap tablet, kadar asetosal ini
memenuhi syarat karena menurut
Farmakope Indonesia IV, kadar
asetosal dalam tablet adalah antara
90% hingga 110%. Sehingga dapat
dikatakan tablet sampel memiliki
kualitas yang baik.

KESIMPULAN

Dengan menggunakan metode HPLC,

didapatkan kadar asetosal sebesar
107,36% yang di mana hal ini sesuai
dengan pernyaratan Farmakope
Indonesia IV yaitu 90-110%.
Optimasi sistem HPLC yang
digunakan adalah fasa gerak
metanol:air (62:38) dengan laju alir
1mL/menit dan diukur dengan
detektor UV 278nm.
DAFTAR PUSTAKA Departemen Kesehatan RI. 1995.
Farmakope Indonesia. Edisi IV.
Bayne, S., dan M. Carlin. 2010.
Jakarta: Departemen Kesehatan
Forensic Applications of High
RI
Performance Liquid
Chromatography. US: CRC Dong, M. W. 2006. Modern HPLC
Press for Practicing Scientists.
Canada: John WIley
Bhusari, V., dan S. Dhaneshwar.
2012. Validated HPLC Method Gandjar, I. G., dan A. Rohman. 2012.
for Simultaneous Quantitation Kimia Farmasi Analisis.
of Amlodipine Besylate, Yogyakarta: Pustaka Pelajar
Atenolol and Aspirin in Bulk
Gujarathi, S. C., A. R. Shah, S. C.
Drug and Formulation. J. of
Jagdale, P. A. Datar, V. P.
Pharmaceutical and
Choudhari, B. S. Kuchekar.
Biomedical Sciences, 17(1), 1-
2010. Spectrophotometric
6.
Simultaneous Determination of
Clark, Jim. 2016. High Performance Aspirin and Ticlopidine in
Liquid Chromatography Combined Tablet Dosage Form
HPLC. by First Order Derivative
http://www.chemguide.co.uk/an Spectroscopy, Area Under
alysis/chromatography/hplc.ht Curve (AUC) and Ratio
ml [diakses pada 19 Maret 2017 Derivaive Spectrophotometric
pukul 12.44] Methods. Int. J. Of
Pharmaceutical Sciences
Day, R. A., dan A. L. Underwood.
Review and Research, 3(1),
2002. Analisis Kimia
115-119
Kuantitatif. Jakarta: Erlangga
Jain, D. K., N. Jain, dan J. Verma.
DeLorenzo. R. A. 1981. Problem
2012. RP-HPLC Method for
Solving in General Chemistry.
Simultaneous Estimation of
Dubuque: W.C. Brown
Aspirin and Prasugrel in Binary
Publishers
 Combination. International Waliszewski, K., V. Pardio, dan S.
Journal of Pharmaceutical Ovando. 2007. A Simple and
Sciences and Drug Research, Rapid HPLC Technique for
4(3), 218-221 Vanillin Determination in
Alcohol Extract. Food
Khopkar, S.M. (1990). Konsep Dasar
Chemistry, 101(3), 1059-1062
Kimia Analitik. Jakarta : UI
Press

Snape, Tim. 2013. Pharmaceutical

Chemistry. UK: Oxford
University Press