PRINSIP TEKNOLOGI

DNA REKOMBINAN
DEBBIE S. RETNONINGRUM
SEKOLAH FARMASI
INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG

Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 1
 PUSTAKA

1. Glick, BR and JJ Pasternak, 2003, Molecular

Biotechnology: Principles and Applications of
Recombinant DNA,hal. 47-89 dan 101-110
2. Groves MJ, 2006, Pharmaceutical
Biotechnology, hal. 44-55
3. Brown TA, 2006, Gene Cloning & DNA analysis,
hal. 3-6 dan 8-12; 54-80 dan 87-97

Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 2
 TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN

Rekombinasi antara molekul DNA dari organisme

berbeda: fenomena umum di alam.
Corynebacterium diphtheriae yang diinfeksi oleh virus
menghasilkan toksin yang bertanggung jawab terhadap
gejala difteri.
Perubahan genetik dalam bakteri ini disebabkan oleh
virus dan merupakan suatu rekayasa genetik dalam
alam.

Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 3
 TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN

Duplikasi fenomena alam di laboratorium

Mengembangkan metode introduksi berbagai informasi
genetik ke dalam suatu organisme.
Manipulasi genetik
E. coli dan Bacillus subtilis (bakteri)
Saccharomyces cerevisiae (ragi)
Produksi bahan mahal atau tidak mungkin dibuat secara
tradisional.

Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 4
 CONTOH PRODUK REKOMBINAN

ANTIBODI REKOMBINAN
PROTEIN TERAPEUTIK: insulin, interferon, albumin serum
manusia, hormon pertumbuhan manusia, aktivator plasminogen
jaringan, antithrombin, faktor pembekuan darah, limfokin, faktor
nekrosis tumor, dismutase superoksida, dan gonadotropin
manusia
VAKSIN: hepatitis B, herpes, influenza, malaria
VAKSIN DNA
TERAPI GEN

Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 5
 CONTOH PRODUK REKOMBINAN

PRODUK PERTANIAN: tanaman tahan penyakit,

resistensi pestisida, bioinsektisida, fiksasi nitrogen

PRODUK BIOREMEDIASI: pengurai lemak/minyak,

penghilangan herbisida, pendegradasi pestisida

Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 6
TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN (KLONING GEN)

PENYEDIAAN DNA: SISIPAN DAN VEKTOR (Ex: PLASMID)

LIGASI: PENGGABUNGAN DNA SISIPAN DAN VEKTOR
(= VEKTOR REKOMBINAN)
TRANSFORMASI: TRANSFER INFO GENETIK KE SEL INANG
& PERBANYAKAN DNA
SELEKSI: SEL YG MENGANDUNG PLASMID/ VEKTOR
REKOMBINAN
DETEKSI: KEBERADAAN DNA SISIPAN, KEBENARAN DNA
SISIPAN (UKURAN DAN URUTAN NUKLEOTIDA)

1972 Stanley Cohen dan

Herbert Boyer

Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 7
TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN (KLONING GEN)
DNA
kromosom
DNA Potong dengan enzim restriksi
plasmid

ligasi
DNA rekombinan

transformasi sel

transforman
1 sel tumbuh jadi 1 koloni

klon
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 8
 Kloning DNA ke Plasmid

Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 9
 SUMBER DNA SISIPAN

TIGA PENDEKATAN:
KEPUSTAKAAN DNA (DNA LIBRARY): DNA
GENOMIK
PRODUK PCR
mRNA cDNA (eukariot)

Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 10
 Kepustakaan genomik (genomic library)

Koleksi klon yang jumlahnya cukup mencakup

semua gen dari suatu organisme
Contoh ukuran genom:
Bacillus anthracis: 5,1 5,2 Megabasa
Escherichia coli: 4 Megabasa
Pseudomonas putida: 6,0 6,1 Megabasa
Staphylococcus aureus: 2,9 Megabasa

Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 11
 KROMOSOM vs PLASMID

Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 12
 PLASMID

DNA UNTAI GANDA

BERBENTUK LINGKARAN
BERSALINAN TINGGI
BERUKURAN KECIL (MUDAH DIMANIPULASI)
DAPAT BEREPLIKASI SENDIRI DI DALAM SEL
DAPAT DISISIPI DNA ASING (DNA SISIPAN)
ADA DUA GEN MARKER:
UNTUK MENDETEKSI ADANYA VEKTOR
UNTUK MENDETEKSI ADANYA DNA SISIPAN

Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 13
 VEKTOR (Plasmid)

VEKTOR KLONING
HANYA UNTUK MENDAPATKAN DNA

VEKTOR EKSPRESI
UNTUK MENDAPATKAN PROTEIN (tambahan
komponen untuk mempermudah proses downstream/pemurnian)

Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 14
 Beberapa contoh vektor kloning

Nama Tipe Sel inang Keterangan

pBR322 Plasmid E. coli Resistensi terhadap ampisilin, tetrasiklin.
Vektor untuk tujuan umum
pUC8 Plasmid E. coli Resistensi terhadap ampisilin, skrining
lac. Vektor untuk tujuan umum
pBluescript Plasmid E. coli Resistensi terhadap ampisilin, skrining
lac.
gt10 Bakteriofaga E. coli Kloning cDNA

YEp24 Plasmid E. coli/ragi Resistensi ampisilin. Vektor ragi shuttle

Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 15
 PETA PLASMID

Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 16
 ENZIM RESTRIKSI

MEMBATASI PERTUMBUHAN VIRUS PADA

INFEKSI VIRUS PADA BAKTERI
TIPE II: DIGUNAKAN PADA DNA
REKOMBINAN
MEMOTONG IKATAN FOSFODIESTERASE
MENGENALI URUTAN PALINDROM
5 GAATTC 3
3 CTTAAG 5

Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 17
 ENZIM RESTRIKSI & LIGASE
DNA (enzim restriksi) DNA (ligase)
5- NNNGAATTCNNN -3 5- NNNGOH PAATTCNNN -3
3- NNNCTTAAGNNN -5
3- NNNCTTAAP OHGNNN -5

EcoRI
ligase
5- NNNGOH PAATTCNNN -3 5- NNNGAATTCNNN -3
3- NNNCTTAA P OHGNNN -5 3- NNNCTTAAGNNN -5

Sisi pengenalan enzim restriksi

Urutan nukleotida rantai atas =
Urutan nukleotida rantai bawah

Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 18
 CONTOH ENZIM RESTRIKSI

EcoRI (Escherichia coli galur R): GAATTC (ujung lancip)

BamHI (Bacillus amyloliquefaciens): GGATCC (ujung lancip)
BglII (Bacillus globigii): AGATCT (ujung lancip)
SalI (Streptomyces albus): GTCGAC (ujung lancip)
PstI (Providencia stuartii 164): CTGCAG (ujung lancip)
HindIII (Haemophilus influenzae): AAGCTT (ujung lancip)
KpnI (Klebsiella pneumonia): GGTACC (ujung lancip)
XbaI (Xanthomonas bradii): TCTAGA (ujung lancip)
HaeIII (Hemophilus aegyptius): GGCC (ujung tumpul)

Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 19
 Kloning Produk PCR

PCR Ligasi

S. pyogenes M12 Gen ska pGEMT

rekombinan

SDM

Transformasi

E. coli XL-Blue pGEMT/ska

Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 20
 LIGASI PRODUK PCR KE pGEM-T
ligasi Transformasi
A A +

Gen ska
pGEM-T pGEM-T E. coli JM109
REKOMBINAN

Streptococcus pyogenes

Kontrol Kontrol + E. coli pGEM-T REK

LB/Amp LB/Amp LB/Amp/X-Gal/IPTG

Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 21
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 22
 Transformasi

info genetik ditransfer ke sel inang dengan

metode transformasi
Sel inang dibuat kompeten (siap menerima
DNA asing) modifikasi struktur dinding sel
Metode transformasi : heat shock/elektroporasi

Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 23
 Seleksi Transforman

Sel kompeten

Transformasi

Seleksi Biru-Putih

Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 24
 SELEKSI BIRU PUTIH

MENGETAHUI APAKAH DNA SISIPAN SUDAH ADA?

PADA MCS TERDAPAT GEN lacZ (MENGKODE
GALAKTOSIDASE)
X-GAL BIRU
DNA SISIPAN AKAN MERUSAK GEN lacZ
GALAKTOSIDASE TIDAK DIPRODUKSI
X-GAL TIDAK DIURAIKAN PUTIH

Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 25
 Deteksi keberadaan DNA sisipan

Analisis migrasi
Analisis restriksi Elektroforesis gel
PCR
Penentuan urutan DNA sisipan (sekuensing)

Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 26
 ELEKTROFORESIS GEL

Gel agarosa atau poliakrilamid

DNA bermuatan negatif (ada gugus fosfat):
bergerak dari kutub negatif ke kutub positif
DNA bermigrasi tergantung dari ukurannya:
migrasi DNA ukuran kecil > ukuran besar
Visualisasi:
etidium bromida / Syber Green (DNA berfluorosensi
dengan pemaparan UV)

Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 27
 Elektroforesis Gel Agarosa

Joe Sambrook dan Bill Sugden: elektroforesis gel agarose untuk DNA

Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 28
 KONFIRMASI pGEM-T REKOMBINAN

1 2
Isolasi pGEM-T/ska
(kit Qiaprep, Qiagene)

Ukuran plasmid tanpa DNA sisipan < 1 = pGEM-T rekombinan

ukuran plasmid dengan DNA sisipan 2 = pGEM-T tanpa DNA sisipan

Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 29
 KONFIRMASI pGEM-T REKOMBINAN

Isolasi Plasmid Rekombinan Analisis Restriksi pGEM-T

rekombinan
1 2 3
1 2

Koloni Putih
Koloni pGEM-T (3000 bp)
Koloni Biru
Biru
1419 pb
881 pb
517 pb DNA sisipan

Elektrogram hasil isolasi plasmid

koloni biru dan putih :
1. Koloni biru
2. Koloni putih
3. Koloni biru Elektrogram hasil restriksi Nde/BamHI
1. Marka pUC19/HinfI
2. Hasil Pemotongan NdeI/BamHI

Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 30
HASIL PENENTUAN URUTAN NUKLEOTIDA
DNA SISIPAN (DNA Sequencing)

Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 31
 HASIL SEKUENSING

Bandingkan urutan hasil sekuensing dg urutan DNA sisipan asal

(Analisis homologi/kesamaan program BLAST dari NCBI)

Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 32