Diterjemahkan dari bahasa Inggris ke bahasa Indonesia - www.onlinedoctranslator.

com

molekul
Artikel

Studi Banding Beberapa Prosedur Isolasi DNA

Buah SuffiKualitas untuk Pengujian Berbasis
PCR
Lenka Fialova *, Denisa Romanovska dan Ivana Marova

Fakultas Kimia, Universitas Teknologi Brno, 612 00 Brno, Republik Ceko;

xcromanovska@fch.vut.cz (DR); marova@fch.vut.cz (IM)
* Korespondensi: xcfialoval@fch.vutbr.cz

Editor Akademik: Carmen Cuadrado ---- -

---
Diterima: 11 Agustus 2020; Diterima: 18 September 2020; Diterbitkan: 20 September 2020

Abstrak:Penipuan makanan telah dan masih menjadi masalah di industri makanan. Ini dapat dideteksi dengan
beberapa pendekatan, seperti kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT), uji kemometrik, atau teknik berbasis DNA,
masing-masing dengan kekurangannya sendiri. Karya ini membahas satu kelemahan utama dari metode berbasis
DNA, khususnya sensitivitasnya terhadap inhibitor yang terkandung dalam matriks tertentu dari mana DNA diisolasi.
Kami menguji lima kit komersial dan satu metode internal yang dicirikan oleh berbagai cara homogenisasi sampel
serta penangkapan dan pemurnian DNA. Dengan menggunakan metode ini, DNA diisolasi dari 10 spesies buah
berbeda yang biasa digunakan dalam bahan makanan nabati. Kualitas DNA dievaluasi dengan spektrofotometri UV-
VIS. Dua jenis uji qPCR digunakan untuk pengujian kualitas DNA: (i) Metode khusus untuk wilayah ITS2 tanaman, (ii)
metode khusus untuk spesies buah individu. Berdasarkan terutama pada hasil pengujian PCR waktu nyata, kami
dapat menemukan dua kit berbasis kolom dan satu kit berbasis pembawa magnetik, yang secara konsisten
menyediakan isolat DNA buah dengan kualitas yang cukup untuk pengujian berbasis PCR yang berguna untuk
analisis dan identifikasi rutin. spesies buah individu dalam produk makanan.

Kata kunci:isolasi DNA; PCR waktu nyata; kit komersial; buah merah;Prunus; buah tropis

1. Perkenalan

Penipuan makanan, baik yang disengaja, seperti penggantian buah yang mahal dengan yang lebih murah,
maupun yang tidak disengaja, seperti kontaminasi produk dengan spesies buah yang tidak dideklarasikan melalui
pembersihan jalur pemrosesan yang tidak memadai, telah dan masih menjadi masalah dalam makanan. industri [1,2].
Contoh penipuan makanan yang dapat dideteksi dengan teknik berbasis PCR termasuk dua jenis penipuan makanan
yang disebutkan di atas. Sudah ada metode yang ditetapkan untuk mendeteksi jenis pemalsuan makanan ini dalam
jus dan pure buah, seperti HPLC atau uji kemometrik. Namun demikian, metode ini memiliki beberapa keterbatasan
karena perbedaan kandungan beberapa metabolit antara varietas dari spesies buah yang sama dan pengaruh jenis
pengolahan dan penyimpanan bahan pangan nabati.1-3]. Karena fakta ini, masih masuk akal untuk juga
mengeksplorasi pendekatan berbasis PCR karena spesifisitasnya yang tinggi, dan stabilitas termal DNA dibandingkan
dengan senyawa lain yang ada dalam makanan nabati.4].
Sementara metode berbasis PCR tidak mengalami kekurangan yang sama yang disebutkan dalam paragraf
sebelumnya, mereka juga menunjukkan beberapa kelemahan. Mirip dengan prosedur berbasis enzim lainnya, mereka
sensitif terhadap inhibitor yang ada dalam matriks biologis. Selanjutnya, untuk hasil yang dapat diandalkan, DNA
dengan konsentrasi dan kemurnian yang cukup diperlukan [5]. Namun, makanan, dan terutama buah-buahan, kaya
akan zat yang dapat menghambat PCR.5,6]. Polisakarida seperti pektin dapat mengendap bersama DNA selama
pemurniannya dan menghambat resuspensinya. Setelah resuspensi DNA, polisakarida dapat meniru sifat-sifatnya dan
menghambat PCR. Polifenol mampu membentuk ikatan silang dengan asam nukleat, sehingga berubah

Molekul2020,25, 4317; doi:10.3390/molekul25184317 www.mdpi.com/journal/molecules

Molekul2020,25, 4317 2 dari 15

sifat mereka dan membuat mereka tidak mampu amplifikasi. Fenolik juga mengkelat ion logam, termasuk ion
magnesium, yang juga dapat menyebabkan penghambatan amplifikasi.5-7]. Kondisi selama pengolahan
makanan juga mempengaruhi kualitas DNA yang diisolasi dari matriks makanan. Misalnya, pada pH asam,
purin dihidrolisis dari untai DNA. Hal ini menyebabkan hidrolisis ikatan fosfodiester terdekat, yang pada
gilirannya menyebabkan pemecahan untai DNA menjadi fragmen yang lebih pendek.6].
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk membandingkan beberapa protokol untuk isolasi DNA dari matriks
buah matang yang berbeda untuk mendapatkan DNA dengan kualitas yang cukup untuk metode berbasis PCR.
Sebelumnya, beberapa penelitian yang membandingkan kit isolasi DNA dan protokol in-house telah dilakukan.
Namun demikian, studi ini difokuskan baik pada DNA bakteri dari sampel klinis [8], tanah [9], anggur dan cuka [
10], atau DNA tanaman dari matriks selain buah matang, seperti produk kedelai [11] atau produk olahan tomat
[6]. Sejauh pengetahuan terbaik kami, penelitian serupa menggunakan buah matang dari spesies yang
berbeda dan komposisi kimia yang bervariasi belum dilakukan sejauh ini. Dalam penelitian ini, lima kit
komersial dan satu protokol internal dipilih dan dibandingkan. Prosedur ini berbeda dalam cara homogenisasi
sampel, isolasi DNA, dan pemurnian. Untuk membandingkan seluruh protokol isolasi DNA, bukan hanya tahap
pemurniannya, langkah-langkah homogenisasi yang berbeda yang direkomendasikan oleh produsen yang
berbeda digunakan. Untuk pengujian protokol isolasi dan pemurnian ini, 10 spesies buah yang biasa
digunakan dalam makanan nabati dan makanan untuk bayi digunakan. Untuk pengujian PCR waktu nyata,
pewarna interkalasi digunakan. Untuk mengimbangi kelemahan utamanya, pengujian khusus untuk spesies
buah individu digabungkan dengan analisis kurva leleh digunakan. Pekerjaan ini dianggap sebagai langkah
penting untuk pengembangan metode kompleks berbasis PCR untuk analisis keaslian rutin pure buah dan jus.
Karena dalam metode ini cara deteksi amplikon yang dipilih adalah pewarna interkalasi, kami juga
menggunakannya dalam penelitian ini.

2. Hasil

Strategi eksperimental diusulkan sebagai berikut:

(i) Isolasi DNA dengan 5 metode komersial dan 1 metode in-house.

(ii) Penentuan konsentrasi dan kemurnian DNA dengan spektrofotometri UV-VIS.
(iii) Analisis kualitas masing-masing isolat DNA secara real-time PCR menggunakan primer spesifik untuk wilayah ITS2
tanaman.
(iv) Analisis kualitas masing-masing isolat DNA secara real-time PCR menggunakan primer spesifik untuk masing-
masing spesies buah. Setiap amplikon juga dianalisis dengan elektroforesis gel agarosa.

Bagan alur kerja penelitian ini juga dapat ditemukan di file S15.

2.1. Karakterisasi Isolat DNA dengan Spektrofotometri UV-VIS

Kemurnian isolat DNA dinilai berdasarkan rasio absorbansi A260/A280 dan A260/A230. Untuk yang pertama,
nilai 1,8 menunjukkan DNA murni, nilai yang lebih rendah menunjukkan kontaminasi protein, dan nilai yang lebih
tinggi dari 2,0 menunjukkan kontaminasi RNA. Rasio absorbansi yang terakhir harus lebih tinggi dari 1,5 dan, idealnya,
mendekati atau sama dengan 1,8 [5]. Meja1merangkum konsentrasi dan kemurnian DNA yang diisolasi dari masing-
masing spesies buah individu.
Dalam kasus pisang, protokol cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) dan kit 3 (Invitrogen)
memberikan sampel paling murni (Tabel1), bagaimanapun, spektrum penyerapan isolat DNA yang
diperoleh dengan protokol CTAB menunjukkan puncak yang khas pada 270 nm, yang menunjukkan
kemungkinan kontaminasi polisakarida. Puncak ini ditentukan pada semua isolat DNA buah yang
diperoleh dengan protokol CTAB, tetapi tidak pada isolat DNA yang diperoleh dengan kit komersial.
Kinerja kit 3 diikuti oleh kit 2 (Elisabeth Pharmacon), yang menghasilkan DNA, yang rasio A260/A280 tidak
menunjukkan kontaminasi protein, sedangkan A260/A230 menunjukkan kemungkinan kontaminasi
dengan residu garam, EDTA, atau senyawa fenolik ( Meja1). Performa kit 1 (Qiagen), 4 (PerkinElmer), dan
5 (Alat) sebanding.
Molekul2020,25, 4317 3 dari 15

Tabel 1.Nilai rata-rata jumlah total DNA hasil isolasi, konsentrasi DNA, dan rasio absorbansi. c—
konsentrasi DNA, A260/A280 dan A260/230—rasio absorbansi, m—jumlah total DNA yang diisolasi.

Buah metode c (ng·µL−1) A260/A280 A260/A230 m (ng)

1 5.0±1.7 1.40±0,09 0.36±0,05 500±167

2 3.5±1.0 1.95±0,07 1.04±0,06 350±101
3 5.4±0.8 2.13±0,15 1.46±0.63 540±78
pisang
4 4.6±1.5 1.23±0,05 0.27±0.16 460±150
5 4.1±11.6 1.81±0.34 0.27±0.16 410±1164
6 227.5±37.5 1.59±0,04 1.66±0.16 22.750±3747
1 23.2±21.3 1.18±0.17 0,43±0,10 2320±2134
2 1.7±0.2 1.65±0,47 0,28±0.35 170±21
3 48.5±14.7 0.63±0,26 0.14±0,06 4850±1468
bilberry
4 3.0±1.0 0,99±0,07 0,30±0,03 300±103
5 4.3±6.7 1.96±0,25 0.33±0.82 430±668
6 80.5±26.4 1.39±0,03 1.66±0,22 8050±2644
1 41.3±23.5 1.39±0.14 0,57±0.19 4.130±2,353
2 5.6±1.2 2.60±0.14 0,55±0,07 560±121
3 5.7±0.4 1,54±0,07 0,59±0,04 570±36
Pir
4 4.1±0,5 1.10±0.13 0,28±0,03 410±50
5 5.6±3.0 1.73±0.31 0.32±0,77 560±303
6 54.9±11.0 1.36±0,01 1.61±0,15 5490±1104
1 11.8±3.1 1.21±0,04 0.37±0,06 1180±305
2 1.6±1.3 2.37±2.32 0,22±0,06 160±126
3 3.9±0,7 1.43±0,03 0,51±0,04 390±66
apel
4 15.7±1.7 1.19±0,02 0.21±0,03 1570±168
5 3.3±1.9 1.59±0.24 0,53±2.97 330±193
6 67.5±7.4 1.39±0,02 1.48±0,08 6750±745
1 7.0±0.4 1.25±0,10 0.39±0,04 700±35
2 6.0±2.9 2.08±0.13 1.11±0.21 600±295
3 19.0±24.9 0,60±0.12 0.14±0,04 1900±2491
Stroberi
4 3.1±7.8 1.17±0,05 0,41±0,05 310±783
5 2.6±0.6 1.53±0,69 1.98±5,18 260±56
6 298.5±159.1 1.59±0.13 1.82±0,05 29.850±15.914
1 241.9±44.2 1.50±0,05 0.37±0,03 24.190±4423
2 4.0±2.1 2.09±0,08 1.02±0,20 400±211
3 6.3±1.3 1.39±0,10 1.17±0,10 630±125
Frambos
4 1.7±0.9 1.25±0.27 0.33±0,07 170±86
5 9.3±19.4 1.99±0,04 0.38±2.15 930±1938
6 650.3±65.2 1.43±0,02 1.78±0.18 65.030±6524
1 48.2±16.4 1.24±0,06 0,43±0,04 4820±1638
2 0.9±0.4 1.20±0.35 0.19±0.14 90±40
3 33.3±14.6 0,76±0.19 0.16±0,04 3330±1456
Aprikot
4 2.2±0,3 1.11±0,09 0,23±0,03 220±30
5 4.6±2.0 1.93±0.16 0.27±0,06 460±203
6 75.9±23.1 1.43±0,03 1.53±0,06 7590±2308
1 50.4±21.9 1.25±0,06 0.34±0,04 5040±2187
2 1.7±0,3 2.29±0,20 0,41±0,07 170±30
3 18.9±3.2 1.18±0,05 0.39±0,04 1890±323
Prem
4 2.1±0.2 1.05±0.13 0.27±0.12 210±15
5 4.1±0.4 1.56±0,44 0,49±0.11 410±42
6 101.2±12.0 1.38±0,02 1.14±0,06 10.120±1196
1 4.3±2.1 1.30±0,48 0,23±0,05 430±206
2 15.4±0.8 2.25±0,05 1.82±0.21 1540±75
3 2.7±1.1 1.28±1.43 0.32±0,41 270±108
Persik
4 14.3±3.9 1.25±0,05 0,26±0,05 1,430±391
5 3.1±0.2 1.80±0,15 1.67±1.61 310±21
6 184.2±30.5 1.65±0,01 1.45±0,08 18.420±3054
Molekul2020,25, 4317 4 dari 15

Tabel 1.Lanjutan.

Buah metode c (ng·µL−1) A260/A280 A260/A230 m (ng)

1 2.6±7.0 1.75±0,58 0.27±0.11 260±696

2 8.5±1.7 2.68±0,10 1.43±0,44 850±170
3 1.9±0,7 1.55±3,8 1.69±3,41 190±66
Mangga
4 4.1±0,5 1,54±0.02 0,59±0,01 410±47
5 4.7±2.2 1.81±0,22 0,66±32,58 470±217
6 123.8±12.5 1.57±0,02 1.63±0,08 12.380±1246

Isolat DNA bilberry yang disediakan oleh protokol CTAB memiliki rasio absorbansi terbaik. Sementara
rasio A260/A280 menunjukkan beberapa kontaminasi protein, rasio A260/A230 lebih tinggi dari 1,5, yang tidak
dicapai oleh salah satu dari lima metode lainnya. Kit 2 dan 5 masing-masing menyediakan DNA dengan sedikit
atau tanpa kontaminasi protein. Untuk isolat DNA buah pir, rasio A260/A280 terbaik diukur pada isolat yang
disediakan oleh kit 5. Menggunakan kit 5 untuk isolasi DNA apel diperoleh tingkat kontaminasi protein
terendah, sedangkan tertinggi ditemukan pada isolat yang diperoleh kit 1 dan 4 Rasio A260/A230
menunjukkan kemungkinan kontaminasi garam pada isolat DNA yang diperoleh dengan semua metode,
dengan tingkat kontaminasi yang sebanding antara lima kit komersial, dan secara signifikan lebih rendah
dalam hal protokol CTAB (Tabel1).
Mengenai isolat DNA dari stroberi dan raspberry, rasio A260/A280 terbaik diamati pada isolat yang
disediakan oleh kit 2 dan 5, dan oleh protokol CTAB. Rasio untuk kit 1, 3, dan 4 ini menunjukkan kontaminasi
protein. Rasio A260/A230 menunjukkan DNA murni pada isolat yang diperoleh dengan kit 5 dan protokol CTAB,
dan rasio untuk kit 2 menunjukkan kontaminasi garam atau fenolik. (Meja1).
Mengenai DNA aprikot, rasio A260/A280 menunjukkan tingkat kontaminasi protein yang sebanding pada
isolat DNA yang diperoleh dengan semua metode kecuali kit 5. Rasio A260/A230 dari semua isolat DNA kecuali
yang diperoleh dengan protokol CTAB menunjukkan kontaminasi garam/fenolik, yang sebanding di antara
kelima kit komersial (Tabel1).
Dari isolat DNA plum, yang diperoleh dengan kit 2 menunjukkan kemungkinan kontaminasi RNA. Isolat yang
diperoleh dengan keenam metode menunjukkan kontaminasi garam/fenolik, yang kadarnya sebanding di antara lima
kit komersial, dan lebih rendah pada isolat yang diperoleh dengan protokol CTAB (Tabel1).
Isolat DNA persik yang diperoleh dengan kit 5 adalah murni, sedangkan yang diperoleh dengan kit 2
menunjukkan kemungkinan kontaminasi RNA, dan yang diperoleh dengan protokol CTAB menunjukkan sedikit
kontaminasi protein. Sisa isolat, menunjukkan tingkat kontaminasi protein dan garam/fenolik yang lebih tinggi, tetapi
sebanding. Pada isolat DNA yang diperoleh dengan kit 2 dan 5, dan dengan protokol CTAB, rasio A260/A230
mendekati atau lebih tinggi dari 1,5, menunjukkan DNA murni (Tabel1).
Untuk isolat DNA mangga, yang diperoleh dengan kit 2 menunjukkan kontaminasi RNA, sedangkan pada
isolat lain, ditemukan tingkat kontaminasi protein yang rendah (kit 3 dan 4, protokol CTAB), atau DNA murni
(kit 1 dan 5). Rasio A260/A230 isolat DNA yang diperoleh dengan kit 1, 4, dan 5 lebih rendah dari 1,0,
menunjukkan kontaminasi garam/fenolik. Pada isolat yang diperoleh dengan kit 2 dan 3, dan dengan protokol
CTAB, rasio A260/230, masing-masing menunjukkan hanya sedikit kontaminasi atau DNA murni (Tabel1).
Singkatnya, ketika dinilai hanya dengan kemurnian yang diambil sebagai pertimbangan utama dan
konsentrasi sebagai pertimbangan sekunder, penampilan terbaik secara keseluruhan diberikan oleh kit 2
(Elisabeth Pharmacon) dan 5 (Alat), dan oleh protokol CTAB. Namun, ketika durasi dan kompleksitas metode
isolasi diperhitungkan, protokol CTAB harus didiskualifikasi karena terlalu rumit dan memakan waktu (sekitar 6
jam kerja bahkan dengan kurang dari lima sampel) bila dibandingkan dengan dua kit (kurang dari 3 jam
bekerja bahkan dengan sejumlah besar sampel).
Kriteria lain, yang membantu menentukan pilihan akhir dari metode isolasi DNA yang paling
tepat untuk tujuan yang kami nyatakan adalah amplifikasi DNA yang diperoleh dari setiap metode.
Seperti disebutkan di atas, amplifikasi setiap isolat DNA dinilai dalam dua jenis uji PCR waktu nyata,
yang hasilnya disajikan dalam bab berikut. Sebagai tujuan akhir, kami akan
Molekul2020,25, 4317 5 dari 15

ingin menemukan prosedur isolasi DNA yang sederhana dan dapat direproduksi untuk teknik berbasis PCR yang diterapkan
dalam analisis keaslian makanan nabati olahan.

2.2. PCR Waktu Nyata

Kriteria lain, yang membantu menentukan pilihan akhir dari metode isolasi DNA yang paling sesuai
untuk tujuan yang kami nyatakan, adalah amplifikasi DNA yang diperoleh dengan setiap metode. Seperti
disebutkan di atas, amplifikasi setiap isolat DNA dinilai dalam dua jenis uji PCR waktu nyata: (i) Metode
khusus untuk wilayah ITS2 tanaman, (ii) metode khusus untuk spesies buah individu. Hasil dibagi menjadi
beberapa kelompok menurut jenis buahnya, misalnya buah merah, buah batu, buah tropis, dan buah
pome.

2.2.1. Buah Merah

Dalam penelitian ini, berbagai metode isolasi DNA diuji pada tiga spesies buah merah, yaitu
raspberry, strawberry, dan bilberry. Dari isolat DNA raspberry, yang diperoleh dengan kit 1 (Qiagen),
tidak dapat diamplifikasi baik dalam uji PCR spesifik tanaman, atau spesifik raspberry (Tabel2 dan File S10
dalam Bahan Pelengkap). Semua isolat lainnya dapat diamplifikasi pada kedua pengujian yang
disebutkan di atas. Hasil terbaik dicapai dengan isolat DNA yang diperoleh dengan kit 2 dan 4 (Elisabeth
Pharmacon dan Perkin-Elmer, masing-masing), diikuti oleh kit 3 (Invitrogen), dan kit 5 (Alat) (Gambar1,
Meja2dan File S10 dalam Bahan Pelengkap). Namun, berdasarkan nilai Ct assay dengan isolat DNA
bilberry dan strawberry diperoleh kit 3 (Tabel1, Meja2), terbukti bahwa dalam dua kasus ini, konsentrasi
isolat ini terlalu tinggi. Isolat yang diperoleh dengan protokol CTAB juga dapat diamplifikasi dalam
pengujian spesifik tanaman dan spesifik raspberry, tetapi hasilnya kurang dapat diterima dibandingkan
hasil yang dicapai dengan isolat DNA yang diperoleh dengan kit komersial (Tabel2dan File S10 dalam
Bahan Pelengkap). Jumlah DNA yang diamplifikasi yang sesuai dengan setiap nilai Ct ada di File S14
tambahan.

Meja 2.Nilai Ct dari reaksi PCR real-time dengan isolat DNA stroberi, raspberry, dan bilberry. Setiap
nilai Ct mewakili preparasi DNA yang berbeda. Kolom "Gambar" mengacu pada gambar yang sesuai
dalam file tambahan.

Buah metode Ct—Primer Spesifik Tanaman Ct—Primer Spesifik Spesies Angka

Paket 1
21.64 21.24 26.91 25.03 24.77 S9, 1, 2 13, 14
(Qiagen)
Kit 2 (Elisabeth
19.52 20.21 33,54 23.56 25.13 29.28 S9, 3, 4, 15, 16
Stroberi Farmakon)
Paket 3
18.18 18.48 19.07 21.11 22.22 22.88 S9, 5, 6, 17, 18
(Invitrogen)
Paket 4
22.48 21.98 21.56 26.46 32.49 26.34 S9, 7, 8, 19, 20
(PerkinElmer)
Paket 5
18.19 18.19 17.25 20.16 24.03 23.01 S9, 9, 10, 21, 22
(Peralatan)

6
32.15 24.0 21.17 29.81 31.47 S9, 11, 12, 23, 24
(protokol CTAB)
Paket 1
33.25 31.18 S10, 1, 2, 13, 14
(Qiagen)
Kit 2 (Elisabeth
16.62 22.15 18.33 28.14 23.79 22.66 S10, 3, 4, 15, 16
Frambos Farmakon)
Paket 3
18.05 17.31 19.28 25.08 24.91 25.47 S10, 5, 6, 17, 18
(Invitrogen)
Paket 4
19.21 19.13 17.33 27.05 25.68 24.9 S10, 7, 8, 19, 20
(PerkinElmer)
Paket 5
15.01 16.57 18.32 21.98 24.11 25.3 S10, 9, 10, 21, 22
(Peralatan)

6
20.6 17.62 24.1 25.25 23.88 29.58 S10, 11, 12, 23, 24
(protokol CTAB)
Molekul2020,25, 4317 6 dari 15

Meja 2.Lanjutan.

Buah metode Ct—Primer Spesifik Tanaman Ct—Primer Spesifik Spesies Angka

Paket 1
19.71 18.83 19.1 26.72 24.77 24.09 S5, 1, 2, 13, 14
(Qiagen)
Kit 2 (Elisabeth
19.94 20.55 14.38 28.87 31.31 28.16 S5, 3, 4, 15, 16
bilberry Farmakon)
Paket 3
17.45 16.93 17.73 22.84 22.61 23.49 S5, 5, 6, 17, 18
(Invitrogen)
Paket 4
22.6 23.91 21.07 28.27 28.78 26.42 S5, 7, 8, 19, 20
(PerkinElmer)
Paket 5
16.75 18.08 16.09 22.36 24.37 23.56 S5, 9, 10, 21, 22
(Peralatan)

6
31.01 29.32 27.87 30.36 S5, 11, 12, 23, 24
(protokol CTAB)

Gambar 1.Hasil uji PCR spesifik tanaman dengan isolat DNA diperoleh kit 5:1–3 banana, 4–6
raspberry, 7–9 blueberry, 10–12 mangga, 13–15 peach, 16-DNA ladder, 17–19 apricot, 20–22 apel,
23–25 prem, 26–28 stroberi, 29–31 pir, 32 kontrol positif, 33 tanpa kontrol template.

Dalam kasus stroberi, semua metode, termasuk protokol CTAB, menyediakan isolat DNA yang dapat
diamplifikasi. Sementara hasil PCR real-time dengan primer spesifik tanaman serupa di antara enam metode
isolasi DNA (Tabel2dan File S9 dalam Bahan Tambahan), dengan primer spesifik spesies mereka berbeda (Tabel
2dan File S9 dalam Bahan Tambahan). Pengujian dengan DNA yang diisolasi oleh kit 5 (Alat) menghasilkan hasil
terbaik sejauh ini (Tabel2dan File S9 dalam Bahan Tambahan). Serupa dengan DNA stroberi, DNA bilberry
menghasilkan hasil yang sebanding dalam uji spesifik tanaman dengan isolat yang diperoleh dari semua kit
komersial (Tabel2dan File S5 dalam Bahan Tambahan), sedangkan hasil pengujian spesifik bilberry sekali lagi
berbeda. Hasil terbaik dicapai dengan isolat DNA yang diperoleh dengan kit 5 (Alat), diikuti oleh kit 3
(Invitrogen) (Tabel2dan File S5 dalam Bahan Pelengkap). Berdasarkan hasil tersebut, kami menganggap kit 5
(Alat) yang paling tepat untuk isolasi DNA dari makanan dengan kandungan buah merah yang tinggi, dengan
kit 3 sebagai alternatif yang sesuai.

2.2.2. Buah Batu

Kelompok buah-buahan ini melibatkan salah satu sampel yang paling tidak bermasalah dalam penelitian ini
(persik) dan dua sampel yang terbukti rekalsitran (aprikot dan plum). Dalam kasus buah persik, hasil yang baik dicapai
dengan isolat DNA yang diperoleh dengan kit 1 (Qiagen) memberikan hasil terbaik dalam pengujian PCR waktu nyata
dengan primer spesifik tanaman (Tabel3dan File S6 dalam Bahan Tambahan), dan kit 5 (Alat) dan
Molekul2020,25, 4317 7 dari 15

Protokol CTAB dalam pengujian spesifik buah persik (Gambar2, Meja3dan File S6 dalam Bahan Pelengkap).
Semua kit lain dalam semua preparasi menyediakan DNA, yang berhasil diamplifikasi dalam pengujian spesifik
tanaman dan spesifik buah persik dengan efisiensi PCR hanya sedikit lebih rendah daripada DNA yang
diperoleh oleh kit 1 dan 5 dan protokol CTAB (Tabel3dan File S6 dalam Bahan Pelengkap). Jumlah DNA yang
diamplifikasi yang sesuai dengan setiap nilai Ct dapat ditemukan di File tambahan S14, Tabel2.

Tabel 3.Nilai Ct dari reaksi PCR waktu nyata dengan isolat DNA prem, aprikot, dan persik. Setiap nilai Ct
mewakili preparasi DNA yang berbeda. Kolom "Gambar" mengacu pada gambar yang sesuai dalam file
tambahan.

Buah metode Ct—Primer Spesifik Tanaman Ct—Primer Spesifik Spesies Angka

Paket 1
30.96 33.41 30.06 29.56 29.62 S13, 1, 2, 13, 14
(Qiagen)
Kit 2 (Elisabeth
22.91 21.94 21.74 20.78 22.71 22.56 S13, 3, 4. 15, 16
Prem Farmakon)
Paket 3
31.12 30.39 35.6 21.91 30.5 29.98 S13, 5, 6, 17, 18
(Invitrogen)
Paket 4
23.75 24.05 21.44 25.82 25.79 24.32 S13, 7, 8, 19, 20
(Perkin-Elmer)
Paket 5
18.61 20.06 19.78 21.37 23.53 22.26 S13, 9, 10, 21, 22
(Peralatan)

6
29.36 31.69 28.25 31.24 25.34 28.73 S13, 23, 24
(protokol CTAB)
Paket 1
16.09 18.53 17.48 23.96 28.22 27.43 S6, 1, 2, 13, 14
(Qiagen)
Kit 2 (Elisabeth
19.43 20.49 19.54 28.46 26.64 27.27 S6, 3, 4, 15, 16
Persik Farmakon)
Paket 3
18.85 17.98 18.45 26.59 26.36 26.13 S6, 5, 6, 17, 18
(Invitrogen)
Paket 4
20.08 19.66 21.11 27.93 27.09 26.36 S6, 7, 8, 19, 20
(Perkin-Elmer)
Paket 5
15.68 18.09 17.06 25.25 26.43 25.51 S6, 9, 10, 21, 22
(Peralatan)

6
20.61 20.5 20.27 26.06 24.61 27.04 S6, 11, 12, 23, 24
(protokol CTAB)
Paket 1
31.38 32.25 31.85 S12, 1, 2, 13, 14
(Qiagen)
Kit 2 (Elisabeth
25.07 23.51 30.76 30.42 30.96 S12, 3, 4, 15, 16
Aprikot Farmakon)
Paket 3
17.94 15.61 17.26 25.78 24.27 26.16 S12, 5, 6, 17, 18
(Invitrogen)
Paket 4
24,65 23.54 24.48 32.28 29.5 S6, 7, 8, 19, 20
(Perkin-Elmer)
Paket 5
18.51 19.05 18.28 27.17 27.93 28,99 S6, 9, 10, 21, 22
(Peralatan)

6
29.76 28.82 24,92 32.0 S6, 11, 12, 23, 24
(protokol CTAB)

Namun, dalam kasus aprikot dan plum, kit 1 terbukti menjadi metode yang paling tidak tepat untuk
isolasi DNA dari spesies ini, tanpa amplifikasi yang diamati pada salah satu, atau hanya dalam satu dari
tiga, uji PCR real-time paralel, terlepas dari primer yang digunakan (Tabel3dan File S12 dalam Bahan
Pelengkap). Pengujian dengan isolat DNA plum yang diperoleh dengan kit 5 memberikan hasil terbaik,
diikuti oleh isolat DNA yang diperoleh dengan kit 2 (Elisabeth Pharmacon) (Tabel3dan File S13 dalam
Bahan Pelengkap). Isolat DNA plum yang diperoleh dengan kit 4 (Perkin-Elmer) berhasil diamplifikasi
dalam uji dengan primer spesifik tanaman, dan begitu juga isolat DNA yang diperoleh dengan protokol
CTAB, meskipun dengan efisiensi PCR yang lebih rendah (Tabel3dan File S13 dalam Bahan Pelengkap).
Namun, hasil uji spesifik plum dengan isolat DNA yang diperoleh dengan kit 4 menunjukkan bahwa suhu
leleh amplikon berbeda dari yang diamati pada pengujian spesifik plum lainnya dengan isolat DNA yang
diperoleh dengan semua metode lain (File S13 dalam Bahan Tambahan), meskipun DNA itu
Molekul2020,25, 4317 8 dari 15

diisolasi dari buah yang sama. Dalam uji spesifik prem dengan isolat DNA yang diperoleh dengan protokol CTAB, tidak
ada amplifikasi spesifik yang diamati (Tabel3dan File S13 dalam Bahan Pelengkap). Mengenai kit 3 (Invitrogen), tidak
ada amplifikasi yang diamati dalam pengujian dengan isolat DNA prem yang diperoleh oleh kit ini, terlepas dari
primer yang digunakan (Tabel3dan File S13 dalam Bahan Pelengkap).

Gambar 2.Hasil uji PCR dengan primer, spesifik untuk spesies individu, baris atas: Peach, 1-3 kit 1 (Qiagen),
4-6 kit 2 (Elisabeth Pharmacon), 7-9 kit 3 (Invitrogen), 10.100 bp DNA ladder, 11–13 kit 4 (PerkinElmer), 14–
16 kit 5 (Alat), 17–19 protokol CTAB, 20 tanpa kontrol template. Baris bawah: Pisang, 21–23 kit 1, 2426 kit 2,
27–29 kit 3, 30 DNA ladder, 31–33 kit 4, 34–36 kit 5, 37–39 protokol CTAB, 40 tanpa kontrol template.

Dalam kasus aprikot, hasil terbaik dicapai dengan isolat DNA yang diperoleh dengan kit 3, diikuti oleh kit 5 (Tabel
3dan File S12 dalam Bahan Pelengkap). Kit 2 dan 4 menyediakan DNA yang dapat diamplifikasi dalam dua dari tiga
persiapan paralel, dengan efisiensi PCR yang sebanding antara dua kit ini (Tabel3dan File S12 dalam Bahan
Pelengkap). Dalam pengujian dengan isolat DNA yang diperoleh dengan protokol CTAB, amplikon spesifik tidak
terdeteksi (pengujian spesifik tanaman), atau mereka hanya terdeteksi dalam satu dari tiga paralel (pengujian spesifik
aprikot) (Tabel3dan File S12 dalam Bahan Pelengkap). Ringkasnya, kit 5 terbukti paling tepat untuk isolasi DNA dari
spesies buah batu yang digunakan dalam penelitian ini, atau bahan makanan dengan kandungan tinggi matriks plum,
aprikot, atau persik. Kami mengusulkan kit 2 sebagai alternatif dari kit 5, karena kit 2 juga secara konsisten
menyediakan DNA yang dapat diamplifikasi dari ketiga spesies buah batu dalam penelitian ini, meskipun efisiensi PCR
lebih rendah. Untuk isolasi DNA dari aprikot, atau makanan dengan kandungan matriks aprikot yang tinggi, kit 3
adalah yang paling tepat, meskipun kami tidak merekomendasikannya untuk isolasi DNA dari buah plum.

2.2.3. Buah tropis

Dua spesies buah tropis — pisang dan mangga — termasuk di antara sampel yang paling tidak bermasalah
dalam penelitian ini. Dalam kasus mangga, isolat DNA dari setiap preparasi dapat diamplifikasi dalam uji spesifik
tanaman, dan semua isolat DNA kecuali yang diperoleh dengan kit 2 (Elisabeth Pharmacon) dapat diamplifikasi dalam
uji spesifik mangga (Tabel4dan File S11 dalam Bahan Pelengkap). Hasil terbaik dalam hal
Molekul2020,25, 4317 9 dari 15

Efisiensi PCR dicapai dalam pengujian dengan isolat DNA yang diperoleh dengan kit 1 (Qiagen) dan 5
(Alat) (Tabel4dan File S11 dalam Bahan Pelengkap). Jumlah DNA yang diamplifikasi sesuai dengan setiap
nilai Ct dapat ditemukan di File tambahan S14, Tabel3.

Tabel 4.Nilai Ct dari reaksi PCR real-time dengan isolat DNA pisang dan mangga. Setiap nilai Ct
mewakili preparasi DNA yang berbeda. Kolom "Gambar" mengacu pada gambar yang sesuai dalam
file tambahan.

Buah metode Ct—Primer Spesifik Tanaman Ct—Primer Spesifik Spesies Angka

Paket 1
16.51 16.97 18.13 21.04 21.63 23.06 S4, 1, 2, 13, 14
(Qiagen)
Kit 2 (Elisabeth
17.38 19.24 19.06 24.2 22.31 23.45 S4, 3, 4, 15, 16
Farmakon)
Paket 3
pisang 20.09 20.38 19.61 23.03 24.2 23.85 S4, 5, 6, 17, 18
(Invitrogen)
Paket 4
22.25 23.52 23.76 25.69 25.3 24.42 S4, 7, 8, 19. 20
(Perkin-Elmer)
Paket 5
18.77 17.4 18.56 20.77 17.87 20,75 S4, 9, 10, 21, 22
(Peralatan)

6
20.82 29.96 28.24 25.24 32.1 29.47 S4, 11, 12, 23, 24
(protokol CTAB)
Paket 1
22.43 19.25 18.52 21.98 20.72 20.86 S11, 1, 2, 13, 14
(Qiagen)
Kit 2 (Elisabeth
23.26 23.75 22.83 30,92 30.0 S11, 3, 4, 15, 16
Farmakon)
Paket 3
21.83 21.92 22.05 25.03 25.77 25,94 S11, 5, 6, 17, 18
Mangga (Invitrogen)
Paket 4
21.54 22.39 21.7 25.11 26.2 25.17 S11, 7, 8, 19, 20
(Perkin-Elmer)
Paket 5
16.91 18.02 17.33 21.18 24.01 21.98 S11, 9, 10, 21, 22
(Peralatan)

6
21.15 21.78 25.03 25.62 26.64 28.02 S11, 11, 12, 23, 24
(protokol CTAB)

Dalam kasus pisang, hasilnya serupa. Dua perbedaan yang diamati: Semua isolat DNA yang diperoleh dengan kit
2 dapat diamplifikasi pada uji spesifik tanaman dan spesifik pisang, sedangkan isolat DNA yang diperoleh dengan
protokol CTAB dapat diamplifikasi pada kedua pengujian dengan efisiensi PCR yang jauh lebih rendah daripada isolat
DNA mana pun. diperoleh oleh lima kit komersial (File S4 dalam Bahan Tambahan). Ketika hasil pengujian spesifik
tanaman dan spesifik buah diperhitungkan, kita dapat menyimpulkan bahwa kit 1 dan 5 paling cocok untuk isolasi
DNA dari mangga dan pisang, atau dari bahan makanan dengan kandungan tinggi dari kedua spesies ini. Untuk
pisang, kami menyarankan kit 2 dan 3 (Invitrogen) sebagai alternatif yang memungkinkan, dan untuk mangga, kami
menyarankan kit 3 dan 4 sebagai alternatif yang memungkinkan untuk kit 1 dan 5.

2.2.4. Buah Pome

Apel dan pir adalah sampel buah yang paling bermasalah yang digunakan dalam penelitian ini. Namun,
makanan bayi berbahan dasar buah seringkali sebagian besar terdiri dari pure apel dan/atau pir, sehingga hasil uji
PCR real-time dengan isolat DNA dari kedua buah ini memiliki pengaruh besar pada pilihan akhir kit kami untuk
pekerjaan lebih lanjut.
Dalam pengujian dengan isolat DNA pir, hasil terbaik dicapai dengan yang diperoleh dengan kit 2 (Elisabeth
Pharmacon). Kit ini menghasilkan DNA yang dapat diamplifikasi dalam pengujian spesifik tanaman dan spesifik buah
pir di ketiga persiapan paralel (Tabel5dan File S7 dalam Bahan Pelengkap). Kit 1 (Qiagen), 3 (Invitrogen), dan 5 (Alat)
juga menyediakan isolat DNA yang dapat diamplifikasi di kedua pengujian, tetapi efisiensi PCR lebih rendah (Tabel5
dan File S7 dalam Bahan Pelengkap). Kit 4 menyediakan isolat DNA yang dapat diamplifikasi
Molekul2020,25, 4317 10 dari 15

dalam uji spesifik tanaman saja, (Tabel5dan File S7 dalam Bahan Pelengkap). Menggunakan isolat yang
diperoleh dengan protokol CTAB, amplikon spesifik ditentukan dalam satu dari tiga paralel, dan hanya
dalam uji spesifik tanaman (File S7 dalam Bahan Tambahan). Jumlah DNA yang diamplifikasi sesuai
dengan setiap nilai Ct dapat ditemukan di File tambahan S14, Tabel4.

Tabel 5.Nilai Ct dari reaksi PCR real-time dengan isolat DNA pir dan apel. Setiap nilai Ct mewakili
preparasi DNA yang berbeda. Kolom "Gambar" mengacu pada gambar yang sesuai dalam file
tambahan.

Buah metode Ct—Primer Spesifik Tanaman Ct—Primer Spesifik Spesies Angka

Paket 1
25.23 24.17 26.28 29.03 28.36 28.91 S7, 1, 2, 13, 14
(Qiagen)
Kit 2 (Elisabeth
21.89 20.94 19.35 26.08 24.97 23.88 S7, 3, 4, 15, 16
Farmakon)
Paket 3
Pir 26.04 26.27 26.29 29.06 29.71 29.11 S7, 5, 6, 17, 18
(Invitrogen)
Paket 4
25.27 27.43 26.34 26.77 28.73 26.54 S7, 7, 8, 19, 20
(Perkin-Elmer)
Paket 5
25,92 24.63 24.35 27.84 28.48 29.93 S7, 9, 10, 21, 22
(Peralatan)

6
29.58 31.65 32.42 28.27 26.65 27.97 S7, 11, 12, 23, 24
(protokol CTAB)
Paket 1
28.24 27.25 27.89 32.27 35.9 32.84 S8, 1, 2, 13, 14
(Qiagen)
Kit 2 (Elisabeth
29.34 27.93 29.11 34.72 32.68 S8, 3, 4, 15, 16
Farmakon)
Paket 3
27.38 27.52 25.88 30.76 30.87 30,79 S8, 5, 6, 17, 18
apel (Invitrogen)
Paket 4
27.4 28.08 27.56 32.75 S8, 7, 8, 19, 20
(Perkin-Elmer)
Paket 5
28.05 27.84 27.69 29.48 30.62 S8, 9, 10, 21, 22
(Peralatan)

6
32,99 29.13 31.26 30.96 32.32 S8, 11, 12, 23, 24
(protokol CTAB)

Isolat DNA apel yang diperoleh dengan kit 3 (Invitrogen), berhasil diamplifikasi dalam pengujian
spesifik tanaman dan spesifik apel (Tabel5dan File S8 dalam Bahan Tambahan). Isolat yang diperoleh
dengan empat metode komersial lainnya menunjukkan amplifikasi spesifik dalam setidaknya dua dari
tiga paralel di semua pengujian spesifik tanaman (File S8 dalam Bahan Tambahan). Namun, efisiensi PCR
rendah, dan dalam kasus kit 5 (Alat) amplikon tidak terdeteksi oleh elektroforesis (Tabel5dan File S3
dalam Bahan Pelengkap). Amplifikasi spesifik apel diamati hanya dengan isolat DNA yang diperoleh
dengan kit 2 (Elisabeth Pharmacon) 3, dan 5 (File S8 dalam Bahan Tambahan). Singkatnya, kami
menganggap kit 2 (Elisabeth Pharmacon) paling sesuai untuk isolasi DNA dari buah pir, dan kit 3
(Invitrogen) paling sesuai untuk isolasi DNA dari apel. Pada saat yang sama, isolat DNA apel yang
diperoleh dengan kit 2 dapat diamplifikasi, dan hal yang sama berlaku untuk isolat DNA pir yang
diperoleh dengan kit 3. Oleh karena itu, kami menganggap kedua kit ini paling sesuai untuk isolasi DNA
dari apel dan pir, atau dari bahan makanan dengan kandungan tinggi dari salah satu buah ini.
Jika dipertimbangkan bersama-sama, hasil uji PCR spesifik tanaman dan uji PCR spesifik spesies menunjukkan bahwa
dari lima kit komersial yang diuji dalam penelitian ini, yang paling universal adalah kit 2 (Elisabeth Pharmacon), kit 3
(Invitrogen), dan kit 2 (Elisabeth Pharmacon), dan kit 3 (Invitrogen). sebagian kit 5 (Alat). Kit ini secara konsisten menyediakan
DNA yang dapat diperkuat dari sebagian besar dari sepuluh spesies buah yang digunakan dalam penelitian ini, dan masing-
masing terbukti paling cocok untuk isolasi DNA dari beberapa sampel yang lebih bermasalah, khususnya plum, aprikot, apel,
dan pir.
Molekul2020,25, 4317 11 dari 15

Untuk pekerjaan lebih lanjut, kami dapat merekomendasikan khususnya kit 2 (Elisabeth Pharmacon).
Faktor penentu termasuk kualitas DNA pir dan apel yang diisolasi dengan kit ini, karena pure apel dan/atau pir
sering menjadi komponen utama makanan bayi, kebutuhan nitrogen cair untuk homogenisasi sampel, waktu
yang dibutuhkan untuk isolasi DNA, dan harga per Sampel. Faktor pertama didiskualifikasi kit 5 (Alat), yang
tidak direkomendasikan untuk isolasi DNA baik dari apel atau pir. Faktor yang tersisa mendiskualifikasi kit
berbasis pembawa magnetik 3 (Invitrogen), karena isolasi DNA menggunakan kit berbasis kolom 2 (Elisabeth
Pharmacon) lebih mudah dan lebih cepat, tidak memerlukan homogenisasi sampel dalam nitrogen cair, dan
harga per sampel lebih rendah .

3. Diskusi

Dalam penelitian ini, kami membandingkan enam metode isolasi DNA yang dicirikan oleh berbagai cara
homogenisasi sampel dan penangkapan dan pemurnian DNA. Lima dari metode ini komersial dan satu di
rumah. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk memilih/memverifikasi metode isolasi DNA dari buah tunggal
yang berbeda, yang akan memberikan DNA dengan kualitas yang cukup untuk mengikuti pengujian berbasis
PCR. Dalam pekerjaan ini, 10 spesies buah individu diuji. Kriteria utama evaluasi adalah (i) deteksi berulang dari
amplikon spesifik dalam pengujian PCR waktu nyata dengan primer spesifik tanaman dan spesies buah,
dengan penekanan ditempatkan pada hasil pengujian dengan isolat DNA apel dan pir, (ii) cukup konsentrasi
dan kemurnian DNA yang diisolasi, (iii) kesederhanaan atau kerumitan masing-masing metode,
(iv) harga per sampel.
Setiap metode menunjukkan beberapa perbedaan kinerja tergantung pada buah dari mana
DNA diisolasi dan primer yang digunakan dalam kedua jenis pengujian PCR waktu nyata—metode
khusus untuk wilayah ITS2 tanaman dan metode khusus untuk DNA spesies buah individu. Isolat
yang diperoleh dengan protokol CTAB menunjukkan rasio A260/A280 yang sebanding dengan
isolat yang diperoleh dengan kit komersial, dan rasio 260/230 menunjukkan tingkat kontaminasi
garam/fenolik yang lebih rendah daripada isolat yang diperoleh dengan kit komersial. Namun,
spektrum serapan UV dari isolat DNA yang diperoleh dengan protokol CTAB juga menunjukkan
puncak yang khas pada 270 nm, yang menunjukkan kemungkinan kontaminasi polisakarida.
Puncak ini tidak ditentukan dalam spektrum penyerapan UV dari setiap isolat DNA yang diperoleh
dengan kit komersial. Selanjutnya, ketika dievaluasi secara real-time PCR assay,

Dari lima metode komersial, kinerja terbaik diberikan oleh kit 2 (Elisabeth Pharmacon), 3 (Invitrogen), dan
5 (Tools). Memilih salah satu dari metode ini sebagai satu-satunya protokol untuk isolasi DNA dari buah matang
berarti kompromi tertentu. Yang paling masuk akal, dan juga rekomendasi terakhir kami, bisa menggunakan
kit 2. Kit ini berkinerja lebih baik dalam isolasi DNA dari isolat DNA yang dihasilkan apel atau pir dengan
konsentrasi yang dapat diterima, dan kemurnian isolat DNA juga cenderung lebih baik dalam yang diperoleh
dengan kit 2 (Tabel1). Selanjutnya, isolasi DNA lebih cepat dengan kit 2, homogenisasi sampel dengan nitrogen
cair tidak diperlukan, tidak seperti kit 3 (Tabel2), dan harga per sampel lebih rendah dengan kit 2 juga. Oleh
karena itu kami menemukan kit 2 paling cocok untuk penggunaan umum, tetapi kami merekomendasikan kit 5
untuk isolasi DNA dari bahan makanan dengan kandungan matriks buah yang tinggi selain apel atau pir, dan
kit 3 untuk isolasi DNA dari aprikot dan buah apel, atau dari bahan makanan dengan kandungan tinggi dari
kedua spesies ini.

4. Bahan dan Metode

4.1. Spesies Buah

Untuk penelitian ini, sepuluh spesies buah yang berbeda dipilih, khususnya apel (Mallus domestica), pir (
Pyrus communis), raspberry merah (Rubus idaeus), bilberry (juga dikenal sebagai blueberry Eropa), (Vaccinium
myrtillus), Persik (Prunus persica), aprikot (Prunus armeniaca), plum (Prunus domestica), pisang (Musa
akuminata), buah mangga (Mangifera indica), dan stroberi (Fragaria ananasa). Buah matang dari
Molekul2020,25, 4317 12 dari 15

spesies ini diperoleh di ritel komersial. Buah dipotong kecil-kecil dengan pisau bedah dan disimpan dalam
freezer pada suhu 20◦C sampai digunakan lebih lanjut.

4.2. Kit Komersial untuk Isolasi DNA

Lima kit dan satu metode in-house dipilih untuk isolasi DNA. Berbagai cara homogenisasi
sampel dan penangkapan dan pemurnian DNA diterapkan, yang dirangkum dalam Tabel6.

Tabel 6.Metode isolasi DNA yang digunakan dalam penelitian ini.

Penangkapan DNA dan

Metode No. Pabrikan Kit/metode Homogenisasi Sampel
Pemurnian
pemukulan manik-manik kecil
DNEasy PowerPlant Pro
1 Qiagen potongan jaringan tumbuhan di Putar kolom
Kit
suhu kamar
Mekanik (alu dan
Tangkap pada filter putar di
Elisabeth DNA Tanaman EliGene pasir) dan bahan kimia
2 adanya deterjen
Farmasi Kit Isolasi (deterjen), di kamar
chaotropic
suhu
Manik-manik magnetik bermuatan
ChargeSwitch gDNA Penggilingan dengan mortar dan
3 Invitrogen positif dalam pH asam dan netral
Kit Tanaman alu dalam nitrogen cair
pada pH di atas 8,5

Perkin- Penggilingan dengan mortar dan Manik-manik magnetik dengan

4 Kit Tanaman DNA Chemagic
Elmer alu dalam nitrogen cair garam chaotropic

Polifenol Persiapan Mudah Penggilingan dengan mortar dan

5 Peralatan Putar kolom
Kit Ekstraksi DNA Tanaman alu dalam nitrogen cair
Penggilingan dengan mortar dan Isopropanol dan etanol
6 - protokol CTAB
alu dalam nitrogen cair curah hujan [12,13]

4.3. Isolasi DNA

Metode in-house sederhana berdasarkan protokol CTAB yang diusulkan oleh Saghai-Maroof, 1987,
dengan modifikasi oleh Glyn et al., 1997 [12,13], dibandingkan dengan kit komersial yang berbeda. Kit
isolasi Kit Isolasi DNA Tanaman EliGene, Elisabeth Pharmacon, Brno, Republik Ceko; Kit Tanaman DNA
Chemagic, Perkin-Elmer, AS; Kit Ekstraksi DNA Tanaman Polifenol Persiapan Mudah, Alat, Kota Taipei
Baru, Taiwan; ChargeSwitch gDNA Plant Kit, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA dan DNEasy PowerPlant Pro
Kit, Qiagen, Hilden, Germany dipilih. Isolasi DNA dengan metode komersial dilakukan sesuai dengan
protokol pabrikan, yang secara singkat diperkenalkan pada Tabel1. DNA diisolasi dari setiap buah dalam
rangkap tiga, dan konsentrasi serta kemurnian setiap sampel ditentukan dengan spektrofotometri UV/
VIS (NanoDrop 2000, Fisher Scientific, Hampton, NH, USA).

4.4. PCR Waktu Nyata

Semua reaksi PCR dilakukan di RotorGene 6000 (Corbett Life Science, kota, Jerman). Semua
pengujian disiapkan menggunakan SYTO9 MasterMix (Bio Top, Vestec, Republik Ceko) yang mengandung
pewarna interkalasi SYTO9 (eksitasi pada 485 nm dan emisi pada 498 nM) sesuai dengan instruksi pabrik.
Setiap isolat DNA digunakan dalam satu reaksi spesifik tanaman dan satu spesies (pendekatan serupa
mengenai jumlah replika PCR real-time dipilih oleh Paulos et al.) [8]. Spesifisitas semua pasangan primer
kecuali pasangan s2 + s3 diverifikasi menggunakan Aplikasi Primer Blast dincbi.gov[14]. Semua primer
diperoleh dari Elisabeth Pharmacon. Urutan semua primer diperkenalkan pada Tabel3[15-24]. Semua
reaksi PCR dilakukan dalam 25µL dari total volume. Setiap campuran reaksi mengandung 9,5µL air PCR,
12,5µL dari SYTO9 MasterMix, 1µL masing-masing primer (larutan diencerkan hingga 10 pmol/µL), dan 1
µL template DNA konsentrasi ditunjukkan pada Tabel3. Profil bersepeda untuk setiap pasangan primer
diperkenalkan pada Tabel3, juga [15-24]. Alasan penggunaan isolat DNA murni dibandingkan dengan
menyesuaikan konsentrasi semua isolat DNA ke nilai yang sama adalah kenyataan bahwa pengenceran
yang berbeda juga akan mempengaruhi konsentrasi kontaminan dalam isolat DNA, yang pada gilirannya
dapat mempengaruhi hasil. Isolat DNA diperoleh dengan
Molekul2020,25, 4317 13 dari 15

metode tertentu dapat terlihat lebih baik dari yang lain, tetapi hasil ini bukan karena kualitas DNA yang
lebih baik, tetapi karena pengenceran senyawa penghambat yang ada dalam isolat.

4.5. Elektroforesis Gel Agarosa dari Produk PCR

Produk PCR dari pasangan primer S2 + S3 dianalisis menggunakan gel agarosa TBE 1,2% pada 30 V
selama 5 jam. Produk PCR amplifikasi DNA spesies tanaman individu menggunakan primer spesifik dianalisis
menggunakan gel agarosa 1,2% TBE pada 80 V selama 1 jam. Amplikon divisualisasikan menggunakan sinar UV
302 nm dan pewarna interkalasi Gel Red (Biotium, Fremont, CA, USA) sesuai dengan protokol pabrikan. Gel
didokumentasikan oleh sistem dokumentasi Azure c200 (Azure Biosystems, Dublin, CA, USA).

5. Kesimpulan

Tujuan dari penelitian ini adalah untuk membandingkan beberapa protokol untuk isolasi DNA dari buah matang
yang berbeda untuk mendapatkan DNA dengan kualitas yang cukup untuk metode berbasis PCR. Kemurnian isolat
DNA dinilai berdasarkan rasio absorbansi A260/A280 dan A260/A230. Kemurnian DNA tertinggi secara keseluruhan
diberikan oleh kit 2 (Elisabeth Pharmacon) dan 5 (Tools). Amplifiabilitas DNA yang diisolasi dievaluasi menggunakan
dua jenis tes PCR waktu-nyata.
Berdasarkan hasil qPCR, kami menganggap kit 5 (Tools) paling sesuai untuk isolasi DNA dari buah merah.
Kit 5 terbukti juga merupakan pilihan terbaik untuk isolasi DNA dari buah batu dan bahan makanan dengan
kandungan plum, aprikot, atau buah persik yang tinggi. Kit 5 (dan kit 1) juga termasuk yang paling cocok untuk
isolasi DNA dari mangga dan pisang. Kit 3 bisa menjadi alternatif yang cocok untuk buah aprikot, buah batu,
dan buah merah juga. Sebagai yang paling tepat untuk isolasi DNA dari pir dan apel, kit 2 dan 3, masing-
masing, diusulkan.
Jika dipertimbangkan bersama-sama, yang paling universal adalah kit 2 (Elisabeth Pharmacon), kit 3 (Invitrogen), dan kit 5
(Tools). Kit ini secara konsisten memberikan DNA yang dapat diamplifikasi untuk pengujian berbasis PCR dari sebagian besar spesies
buah yang digunakan dalam penelitian ini, termasuk sampel yang lebih bermasalah.

Bahan Tambahan:Berikut ini tersedia secara online. File S1: Urutan primer, File S2: Elektroforesis, ITS2, File S3:
Elektroforesis, uji spesifik spesies, File S4,: Banana qPCR, File S5: Bilberry qPCR, File S6: Peach qPCR, File S7:
Pear qPCR, File S8: Apple qPCR, File S9: Strawberry qPCR, File S10: Raspberry qPCR, File S11: Mango qPCR, File
S12: Apricot qPCR, File S13: Plum qPCR, File S14: Jumlah DNA dalam pengujian qPCR, File S15: Bagan alur kerja.

Kontribusi Penulis:Konseptualisasi, IM; Kurasi data, LF; Analisis formal, LF; Akuisisi pendanaan, IM; Investigasi,
LF dan DR, Pengawasan, IM, Validasi, LF; Menulis—draf asli, LF; Penulisan—review dan penyuntingan, IM dan
DR Semua penulis telah membaca dan menyetujui versi naskah yang diterbitkan.
Pendanaan:Penelitian ini didanai oleh Brno University of Technology, hibah nomor FCH-S-20-6316. APC didanai oleh
Brno University of Technology, dengan nomor hibah FCH-S-20-6316.

Konflik kepentingan:Para penulis menyatakan tidak ada konflik kepentingan. Para penyandang dana tidak memiliki peran dalam
desain penelitian, dalam pengumpulan, analisis, atau interpretasi data, dalam penulisan naskah, atau dalam keputusan untuk
mempublikasikan hasil.

Referensi
1. Koswig, S. Penentuan Jenis Buah Asing dan Varietas Buah. Analisis, Evaluasi dan Masalah Praktis.Proses
Buah. J. Proses Buah. Produk Jus. eur. Ind luar negeri2006,16, 401–412.
2. Zhang, J.; Yu, T.; Cheng, H.; Gan, Y.; Liu, H.; Kamu, X.; Chen, Y. Pendekatan Metabolomik untuk Otentikasi Jus Buah
Berry dengan Kromatografi Cair Quadrupole Time-of-Flight Spektrometri Massa Digabungkan dengan
Kemometrik.J. Pertanian. Kimia Makanan.2018,66, 8199–8208. [CrossRef]
3. Pardo-Teman, N.; Vera, A.; Barbosa, S.; Hidalgo-Serrano, M.; Núez, O.; Saurina, J.; Bangausebuahndez-Cassou, S.;
Puignou, L. Karakterisasi, klasifikasi dan otentikasi ekstrak berbasis buah dengan menggunakan sidik jari
kromatografi HPLC-UV, profil polifenol dan metode kemometrik.Kimia Makanan.2017,221, 29–38. [CrossRef] [
PubMed]
Molekul2020,25, 4317 14 dari 15

4. LHaipez-Calleja, IM; De La Cruz, S.; Pegel, N.; Gonzosebuahlez, saya.; Pasarsayan, R.; Garcsayaa, T. Deteksi sensitif dan
spesifik almond (Prunus dulcis) dalam produk makanan komersial dengan PCR waktu nyata.Ilmu Makanan LWT.
teknologi. 2014,56, 31–39. [CrossRef]
5. Schrader, C.; Schielke, A.; Ellerbroek, L.; Johne, R. PCR inhibitor-kejadian, sifat dan penghapusan.J. Aplikasi Mikrobiol.
2012,113, 1014–1026. [CrossRef]
6. Turci, M.; Sardaro, MLS; Visioli, G.; MAESTRI, E.; Marmiroli, M.; Marmiroli, N. Evaluasi prosedur ekstraksi DNA
untuk ketertelusuran berbagai produk tomat.Kontrol Makanan2010,21, 143–149. [CrossRef]
7. Varma, A.; Padh, H.; Shrivastava, N. Isolasi DNA genom tanaman: Sebuah seni atau ilmu.Bioteknologi. J.2007, 2, 386–
392. [CrossRef]
8. Paulos, S.; Mateo, M.; De Lucio, A.; Bangausebuahndez-de Mingo, M.; Bailo, B.; Saugar, JM; Cardona, GA;
Fuentes, saya.; Mateo, M.; Carmena, D. Evaluasi lima metode komersial untuk ekstraksi dan pemurnian
DNA dari sampel feses manusia untuk deteksi molekuler hilir parasit protozoa enterik Cryptosporidium
spp., Giardia duodenalis, dan Entamoeba spp.J. Mikrobiol. Metode.2016,127, 68–73. [CrossRef]

9. Li, P.; Su, X.; Wang, J.; Yang, S.; Wu, G.; Lin, M.; Zhao, K.; Bezuidenhout, C.; Tang, X. Perbandingan kit komersial
ekstraksi DNA genom berdasarkan tanah liat dan tanah sawah.J. Aplikasi Murni. Mikrobiol.2014,7, 69–75.
10. Jara, C.; Mateo, E.; GuillamHain, JM; Toria, MJ; Mas, A. Analisis beberapa metode ekstraksi DNA berkualitas tinggi
dari bakteri asam asetat dalam anggur dan cuka untuk karakterisasi dengan metode berbasis PCR.
Int. J. Mikrobiol Pangan.2008,128, 336–341. [CrossRef]
11. Vodret, B.; Milia, M.; Orani, MG; Serratrice, G.; Mancuso, MR Deteksi Organisme yang Dimodifikasi Secara Genetik dalam Makanan:
Perbandingan Di Antara Tiga Metode Ekstraksi DNA yang Berbeda.Dokter hewan. Res. komuni.2007,31, 385–388. [CrossRef] [
PubMed]
12. Saghai-Maroof, MA; Soliman, MA; Jorgensen, RA; Allard, RW Ribosomal DNA spacer-length polimorfisme
dalam jelai: pewarisan Mendelian, lokasi kromosom, dan dinamika populasi.Prok. Paku. akad. Sci. Amerika
Serikat1984,81, 8014–8019. [CrossRef] [PubMed]
13. Glyn, MCP; Egertovsebuah,M.; Gaza, B.; Kovarik, A.; Bezdek, M.; Leitch, AR; Chen, Y. Pengaruh 5-azacytidine
pada kondensasi lengan pendek kromosom 1R gandum hitam diTriticum aestivumL. inti meristematik
ujung akar.kromosom1997,106, 485–492. [CrossRef] [PubMed]
14. Primer-BLAST: Alat untuk menemukan primer tertentu. Pusat Nasional Informasi Bioteknologi NCBI
[online]. Bethesda MD, 20894 AS. Tersedia secara online:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
(diakses pada 14 April 2020).
15. Chen, S.; Yao, H.; Han, J.; Liu, C.; Lagu, J.; Shi, L.; Zhu, Y.; Bu, X.; Gao, T.; Pang, X.; dkk. Validasi Region ITS2
sebagai Novel DNA Barcode untuk Identifikasi Spesies Tanaman Obat.PLoS SATU2010, 5. [CrossRef] [
PubMed]
16. Zhang, C.; Bu, R.; Xu, J.; Yan, J.; Guo, L.; Lagu, J.; Feng, R.; Yu, M. Genome-wide identifikasi dan klasifikasi gen
superfamili MYB dalam buah persik.PLoS SATU2018,13, e0199192. [CrossRef]
17. Sargent, DJ; Rys, A.; Nier, S.; Simpson, DW; Tobutt, KR Pengembangan dan pemetaan penanda fungsional di
Fragaria dan kemampuan transfernya serta potensi pemetaannya dalam genus lain.Teori. aplikasi gen. 2007,114
, 373–384. [CrossRef]
18. Wang, F.; Xia, L.; Lv, S.; Xu, C.; Niu, Y.; Liu, W.; Zeng, L.; Zhou, J.; Hu, B. Pengembangan Penanda SCAR
Mitokondria Terkait Kerentanan Pisang (Musa AAA Cavendish) terhadap Fusarium oxysporum f. sp. Balap
Cubense 4.Bukan. Bot. Horti Agrobot. Cluj Napoca.2018,46, 509–516. [CrossRef]
19. Zhang, S.; Zhang, D.; Kipas angin, S.; Du, L.; Shen, Y.; Xing, L.; Li, Y.; Bu, J.; Han, M. Pengaruh GA 3 eksogen dan
penghambatnya paclobutrazol pada pembentukan bunga, hormon endogen, dan gen terkait pembungaan dalam apel
'Fuji' (Malus domestica Borkh.).Fisiol Tumbuhan. Biokimia.2016,107, 178–186. [CrossRef]
20. Fuentes, L.; Monsalve, L.; Morales-Quintana, L.; Valdenegro, M.; Pasarsayanez, JP; Defilippi, BG; Gonzo
sebuahlez-Agüero, M. Diferensial ekspresi gen biosintesis etilen dalam drupelets dan wadah raspberry (
Rubus idaeus).J. Fisiol Tumbuhan.2015,179, 100–105. [CrossRef]
21. Lagu, Y.; Liu, H.; Zhou, T.; Zhang, HJ; Zhang, ZD; Li, YD; Wang, HB; Liu, FZ Urutan throughput tinggi
transkriptom bilberry highbush dan analisis faktor transkripsi helix-loop-helix dasar.
J. Integrasi pertanian.2017,16, 591–604. [CrossRef]
Molekul2020,25, 4317 15 dari 15

22. Hoang, VLT; Innes, DJ; Shaw, PN; Monteith, GR; Gidley, MJ; Dietzgen, RG Keragaman urutan dan ekspresi
diferensial gen biosintetik fenilpropanoid-flavonoid utama di antara tiga varietas mangga. Genom BMC.
2015,16, 561. [CrossRef] [PubMed]
23. Ziarovska, J.; Boselova, D.; Bezo, M. Retrotransposon cassandra salinan memperkirakan dalam plum menggunakan pendekatan pcr
real-time.Emir. J. Pertanian Pangan.2015,27, 591–604. [CrossRef]
24. Han, J.; Wu, Y.; Huang, W.; Wang, B.; Matahari, C.; Gan, Y.; Metode Chen, Y. PCR dan DHPLC digunakan untuk mendeteksi bahan sari
buah dari 7 buah.Kontrol Makanan2012,25, 696–703. [CrossRef]

©2020 oleh penulis. Penerima Lisensi MDPI, Basel, Swiss. Artikel ini adalah artikel akses
terbuka yang didistribusikan di bawah syarat dan ketentuan lisensi Creative Commons
Attribution (CC BY) (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).