LAPORAN PRAKTIKUM GENETIKA

ISOLASI DNA GEMONIK EUKARIOTIK II

NAMA : Yolla Fristia

NIM : 19032108

PRODI/KELAS : BIOLOGI D

DOSEN : Afifatul Achyar, M. Si

ASISTEN DOSEN : 1. Masnaini Siregar

2. Ruri Fitriani

JURUSAN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS NEGERI PADANG

2021
 ISOLASI DNA GENOMIK EUKARIOT II

A. TUJUAN PRAKTIKUM
a. Praktikan memahami prinsip kerja isolasi DNA tumbuhan
b. Praktikan terampil melakukan isolasi DNA dari buah secara sederhana
c. Praktikan mengetahui prosedur kerja isoasi DNA tumbuhan dengan metode CTAB

B. WAKTU DAN TEMPAT PRAKTIKUM

Hari/Tanggal : Jumat/ 24 September 2021
Pukul : 09.41–12.20 WIB
Tempat : Sungai Cubadak, Baso, Agam, Sumatra Barar

C. TEORI DASAR
DNA merupakan unit structural gen, sedangkan gen merupakan unit fungsional
materi genetik. DNA terbentuk dari untaian panjang nukleotida, atau DNA adalah polimer
nukleotida. Setia nukleotida terdisi atas satu gugus fosfat, satu gula pentose, dan satu basa
N-. Ciri khas struktur DNA adalah beruntai ganda dengan pasangan basa N yang
berkomplemenn dan saling berpilin, bersifat antiparalel, serta berdiameter 2 nm (Lucia dkk.
2016). DNA terdiri dari tiga macam molekul, yaitu gula deoksiribosa, gugus fosfat dan basa
nitrogen. Gula pentose memiliki 5 atom C, dan pada DNA atom C nomor 2 berikatan dengan
atom H. Gugus fosfat pada DNA berikatan dengan atom C nomo 5 melalui ikatan fosfoester.
Gugus fosfat tersebut menyebabkan asam nuleat bermuatan negative. Basa nitrogen yang
menyusun asam nukleat ada dua macam, yaitu basa purin yang terdiri dari adenin dan
guanin, dan juga basa pirimidin yang terdiri dari timin dan sitosin. Ikatan tersebut
menghasilkan molekul yang disebut nukleosida. Nukleosida akan bergabung dengan fosfat
dan membentuk molekul yang di sebut nukleotida. Nukleotida adalah satu komponen
pembangun DNA terdiri atas satu gula pentosa, satu gugus fosfat dan satu pasang basa
(Asris, 2010).

Molekul DNA terdiri atas polimer linear deoksiribonukleotida yang terikat dengan
ikatan fosfodiester yang bermuatan negative ketika berada pada pH >4. Dua utas anti
parallel DNA terhubung dengan ikatan hygdrogen dengan nukleotida pasangannya. Bentuk
axis yang umum berupa struktur double helix memilik sifat hidrophobik yang tinggi untuk
solvent dan ligan molekul. Senyawa yang memiliki aksesibilitas pada aromatic electron dan
situs yang tersedia untuk ikatan hydrogen sangat penting bagi ikatan ligan-DNA dan untuk
strategi eksplorasi desan dan pemurnian selektif DNA (Agus, 2013).

Isolasi DNA adalah prosedur rutin untuk mengumpulkan DNA untuk analisis
molekuler atau foresik berikutnya. Isolasi DNA merupakan salah satu teknik yang paling
dasar dan penting dalam studi DNA. Isolasi atau ekstrak DNA diperoleh dengan cara
merusak atau memecahkan dinding sel sehingga DNA keluar dari dalam sel. Derajat
kemurnian dan kualitas dalam isolasi DNA sangat mempengaruhi hasil yang akan
diperoleh. Secara umum, prosedur ekstraksi yang baik untuk isolasi DNA mencakup tiga
hal penting, yaitu harus bisa di hasilkan DNA dengan kemurnian yang tinggi, DNA harus
utuh, dan konsentrasi yang tinggi. Konsentrasi dan kemurnian DNa ditentukan dengan
spektrofotometer pada λ 260 nm dan 280 nm. Molekul DNA dikatakan murni jika rasio
absorbansinya berkisar antara 1,8 – 2,0 (Nurasyiah dkk, 2018).

Metode untuk asam nukleat biasanya dimulai dengan menambahkan sampel ke

larutan lisis yang mengandung deterjen atau chaotropic. Atau, sel dapat pertama kali
terkonsentrasi oleh sentrifungsi dan kemudian ditangguhkan dalam larutan. Solusi suspensi
yang khas adalah hipotonis, seperti yang digunakan dalam langkah pra-pengobatan untuk
mengalisis sel darah merah atau larutan isotonik, sebagai garam penyangga fosfat, glukosa
atau sorbitol. Reagen lisis biasanya mengandung deterjen anionic Sodium Dodecyl Sulfate
(SDS) dan N-Lauroyi Sarcosine. Untuk tujuan ini, deterjen non-ionik dan kationik juga
telah dilaporkan. Setelah lisis, DNA dimurnikan dengan pemisahan dari lisat kompleks,
yang mengandung pasangan seluler non DNA seperti RNA, lipid dan protein. Pemurnian
DNA dapat dilakukan menggunakan protocol berbasis solusi atau berbasis kolom (Carpi
et al, 2011).

Pada dasarnya isolasi DNA genom total bakteri, terdiri dari beberapa tahap yaitu :
1. Kultivasi sel dalam media yang sesuai.
2. Pemecahan dinding sel.
3. Ekstraksi DNA genom.
4. Purifikasi DNA. Pemecahan dinding sel bakteri dilakukan secara fisik misalnya dengan
carra sonikasi, maupun dengan cara kimia yaitu dengan menggunakan enzim lisozim, etilen
diamin tetra asetat (EDTA) atau kombinasi dari keduanya. Setelah sel mengalami lisis,
tahap selanjutnya adalah memisahkan debris sel dengan cara sentrifugasi. Komponen sel
yang tidak larut diendapkan dengan sentrifungsi. Komponen sel yang tidak larut diendapkan
dengan sentrifugasi sehingga meninggalkan ekstrak sel dalam supernatant yang jernih
(Radji, 2011).

Isolasi DNA genomic adalah langkah pertama dalam sebagian besar eksperimen
biologi molekuler. Faktor penentu saat memilih metode ekstraksi adalah kuantitas, kualitas
dan kemurnian DNA terisolasi. Teknik biologi molekuler membutuhkan DNA dengan
berbagai kemurnian dan kualitas. Saat ini, ada banyak metodologi dan kit isolasi untuk
ekstraksi DNA genomic dengan sifat optimal. Penyangga yang mengandung deterjen
nonionic seperti cetyl trimenthyl ammonium bromid (CTAB) sering digunakan untuk
isolasi DNA, dan kemudian diikuti oleh serangkaian langkah untuk pemurnian DNA dari
kontaminan menggunakan pelarut organik atau curah hujan garam (Stefunova et al, 2013).
 D. ALAT DAN BAHAN
Isolasi DNA buah dengan metode sederhana
Alat
a. Pisau
b. Sendok
c. Kantong plastic
d. Botol kaca
e. Corong air
f. Tabung reaksi
g. Cawan pentri / Piring bening
h. Kertas tisu

Bahan
a. Buah ( Alpokat )
b. Garam
c. Detergent
d. Alkohol 70%

Isolasi DNA Tumbuhan dengan Metode CTAB

Alat Bahan
 Timbangan analitik  Sampel daun cabe rawit
 Mikropipet berbagai ukuran  Alkohol 70% semprot
 Water bath  Microtube
 Microcentrifuge  Tips berbagai ukuran
 Rak microtube  Tris 1 M pH 8,0
 Micropestle  EDTA 0,5 M
 Spindown  NaCl 5 M
 Vortex  Buffer ekstraksi
 Wadah limbah  Larutan SDS 20%
 Larutan CTAB
 PVP
 Kloroform-Isoamil Alkohol 24:1
 Isopropanol
 Etanol 70%
 Buffer TE pH 8
E. CARA KERJA

1. Memotong-motong buah alpukat lalu memasukkan ke dalam kantung plastikbersih.

2. Menghaluskan buah alpukat di dalam plastik dengan bantuan sendok, kemudian

sisihkan terlebih dahulu.
3. Masukkan 1 sendok deterjen pencuci piring ke dalam wadah, kemudian
menambahkan air hingga encer, lalu aduk.
4. Menambahkan 2 sendok garam ke dalam larutan deterjen.

5. Memasukkan buah alpukat yang sudah halus ke dalam wadah berisi larutan
deterjen+garam, aduk sampai tercampur rata.
6. Menyiapkan wadah baru dan corong yang dialasi dengan kertas saring/kertastisu.

7. Menyaring campuran buah dan larutan deterjen+garam sampai habis.

8. Menuang alkohol 70% pada cawan petri, lalu menuangkan hasil saringan buah ke
dalam cawan petri tersebut.
9. Mengamati apakah terbentuk benang-benang putih
F. HASIL PENGAMATAN

No Nama Sampel Data Nanophotometer

1 Daun cabe rawit Deskripsi:1-
2 helai daun muda segar

2 Daun koleksi herbarium

Deskripsi: ukuran daun 1x1cm

3 Daun koleksi herbarium

Deskripsi: ukuran daun 2x2cm
G. PEMBAHASAN

Pratikum kali ini mengamati DNA eukariotik pada tumbuhan. Genom adalah satu sel
kromosom lengkap yang di wariskan sebagai satu kesatua dari satu tertua. Genom merupakan
komplemen lengkap gen-gen suatu organisme atau materi genetik suatu organisme dan
terorganisir menjasi kromosom. Genom meliputi bagian-bagian fungsional dan non
fungsional dalam sel organisme. Kromosom merupakan bagian dari sel dimana mempunyai
struktur berupa deret panjang molekul yang terdiri dari satu molekul DNA dan berbagai
protein terkait yang merupakan informasi genetic suatu organisme. Isolasi DNA genom sangat
penting dalam rangka pengklonan DNA atau gen sasaran. Konstruksi pustaka genom dan
pengklonan DNA membutuhkan DNA yang utuh agar fragmen DNA betul-betul berasal dari
proses pemotongan enzimatik yang sangat spesifik. Bila terpotongnya DNA bukan karena
reaksi enzimatik, maka fragmen DNA tersebut sulit disambungkan dengan DNA dari vektor
pengklonan. Oleh sebab itu isolasi DNA genom yang utuh sangat diperlukan bila DNA
tersebut akan diproses untuk pengklonan.
Pada percobaan ini saya melakukan pengamatan pada DNA buah alpukat. Tahap pertama
yang dilakukan adalah menghancurkan buah alpukat terlebih dahulu, lalu mencampurkan
buah alpukat tersebut dengan larutan detergent yang telah ditambahkan air dan dua sendok
garam. Selanjutnya campuran tersebut disaring dengan kertas tissu dan hasil saringan
tersebut nantinya akan dicampurkan dengan alkohol 70%. Dari hasil pengamatan, saya dapat
melihat DNA buah alpukat yaitu berupa endapan putih menyerupai benang. Benang- benang
itulah yang disebut dengan DNA buah alpukat.
Namun saat sudah selesai melakukan percobaan, benang benang tidak langsung terlihat
pada piring. Saya menunggu sekitar lebih kurang 5-10 menit hingga benang benang terbentuk,
hal tersebut memiliki beberapa faktor seperti ukuran dan berapa banyak bahan bahan yang
tercampur dan dicampurkan.
H. Kesimpulan

 Isolasi DNA dapat dilakukan dengan cara :

- Teknik sederhana
- Teknik CTAB

 Isolasi DNA merupakan salah satu teknik yang paling dasar dan penting dalam studi
DNA. Isolasi atau ekstrak DNA diperoleh dengan cara merusak atau memecahkan
dinding sel sehingga DNA keluar dari dalam sel

 Genom adalah satu sel kromosom lengkap yang di wariskan sebagai satu kesatua
dari satu tertua. Genom merupakan komplemen lengkap gen-gen suatu organisme
atau materi genetik suatu organisme dan terorganisir menjasi kromosom.
 DAFTAR PUSTAKA

Agus, Rosana. 2013. Penuntun Praktikum Genetika. Makassar : Universitas Hasanuddin.

Asris, Ahmad. 2010. Isolasi DNA. Malang : Universitas Malang.

Carpi, F. M.,et all. 2011. Human DNAExtraction Methods: Patents and Applications,

Recent Patents on DNA and Gene Sequence, 5(1):1-7.

Lucia, dkk. 2016. Biologi Molekuler Sel. Jakarta : Salemba Teknika.

Nurasyiah, S., et all 2018. Perbandingan Efektivitas Metode Isolasi DNA (Boiling

Water Dan CTAB) Pada Bakteri Klebsiella pneumoniae. Prosiding PertemuanIlmiah

Nasional Penelitian & Pengabdian Masyarakat (PINLITAMAS 1) Dies Natalis Ke-16,

1(1): 627-634.

Radji, M. 2011. Rekayasa Genetika: Pengantar Untuk Profesi Kesehatan. Jakarta : CV

Sagung Seto.

Stefunova, V., dkk. 2013. The Effect Of DNA Isolation and Its Applicability in the

PCR Analysis of Lettuce (Lactuca sativa L.). Evalution, 66(4): 99-1

(mohon maaf kak, tata penulisan daftar pustakanya tidak bisa diatur karena saya bikinnya di hp kak, laptop
saya lagi diservice kak. mohon pengertiannya ya kak, trimakasih bnyak kak)
 JAWABAN PERTANYAAN

1. Apa saja komponen dan fungsi larutan pada kedua metode isolasi DNA tumbuhan
di atas (sederhana dan CTAB)?
Jawab :

a. Metode sederhana

lisis. Selain itu, detergen ini dapat menghambat DNase yang dapat merusak
DNA dan dapat mendenaturasi protein, sehingga protein dapat dihilangkan
dari larutan.

 Penambahan garam berfungsi untuk memudahkan pemisahan benang-

benang DNA dari campuran sehingga benang-benang tersebut akan mudah
diamati.

 Kertas saring berfungsi untuk memisahkan larutan yang berisi DNA dengan
debris sel.
b. Metode CATB

 Alkohol 70% untuk mensterilkan daun

 EDTA merupakan Mg++ ion chelator dan penghambat DNase, karena

DNase membutuhkan ion Mg++ sebagai aktivator untuk aktivitasnya.
Adanya EDTA di dalam buffer menghambat enzim yang aktifitasnya
tergantung logam.

 Larutan CTAB merupakan detejen kationik yang bersifat menghancurkan

sel, mengurai protein, dan memisahkan karbohidrat dari asam nukleat.

 Senyawa PVP berfungsi untuk menghambat proses oksidasi dan mengurangi

timbulnya warna coklat pada DNA. Senyawa PVP akan berikatan dengan
polifenol dan mencegahnya berikatan dengan DNA.

 NaCl berfungsi untuk meningkatan kelarutan senyawa polisakarida pada

alkohol sehingga polisakarida tidak akan mengendap bersama DNA saat
disentrifugasi. NaCl berfungsi untuk menjaga asam nukleat tetap berada pada
medium isotonik. Konsentrasi garam ini diperlukan untuk menjaga struktur
molekul DNA.
  Isopropanol dingin untuk presipitasi atau mengendapkan DNA pada
sentrifuse yg kedua.

 Etanol 70% untuk mencuci sampel mengendapkan DNA pada sentrifuse

ketiga.

2. Bagaimana hasil isolasi DNA buah yang Anda lakukan secara sederhana di
rumah?
Jawab:
Hasil isolasi DNA yang saya lakuka menggunakan meode sederhana dengan buah
pisang, dimana terdapat benang benang putih setelah didiamkan selama 5-10 menit.

3. Bandingkan kedua metode isolasi DNA di atas!

Jawab:
No Isolasi DNA Buah dengan Metode Isolasi DNA Tumbuhan dengan
Metode
Sederhana
CTAB
1. Tidak ada tahap persiapan atau Membuat larutan kerja terlebih dahulu
pembuatan larutan kerja , yaitu membuat larutan Tris 1M pH
8,0 (100 mL), EDTA 0,5 M
pH 8,0 (100 mL), NaCl 5 M (20 mL),
Buffer Ekstraksi (50 mL) , Larutan
SDS 20% (10 mL), Larutan CTAB
(20 mL), Kloroform-Isoamil Alkohol
24:1 (25 mL)
2. Tidak menggunakan alat khusus yang ada Menggunakan alat khusus yang adadi
di laboratorium seperti Microcentrifuge, laboratorium seperti
Spindown, Micropestle, Vortex dan lain Microcentrifuge, Spindown,
sebagainya Micropestle, Vortex dan lain
sebagainya
3. Sampelnya berupa buah Sampelnya berupa daun
4. Tidak menggunakan tahap Sterilisasi Menggunakan tahap
menggunakan alcohol 70% selama 1 menit Sterilisasi
menggunakan alcohol 70%
selama 1 menit
6. Tidak ada proses Vortex dan inkubasi Terdapat proses Vortex dan inkubasi
7. Sampel yang di campur dengan larutan Sampel yang di campur dengan
larutan
diaduk hingga rata menggunakan sendok
hanya di bolak balik secara perlahan
8. Tidak ada proses sentrifugasi Terdapat proses sentrifugasi
9. Menggunakan kertas saring/kertas tisu Menggunakan larutan kloroformuntuk
untuk memisahkan sampel dengan DNA mendenaturasi protein dan juga
isopropanol agar DNA tidak larut dan
mengendap
10 Memurnikan DNA dengan alkohol 70% Memurnikan DNA dengan etanol
70% dan kemudian di sentrifugasi
11 Proses pengeringan DNA dengan hanya Terdapat proses pengeringan DNA
mengangin angin kan saja dalam beberapa selama 3 jam
menit
12 Tidak mengukur konsentrasi dan Mengukur konsentrasi dan kemurnian
kemurnian DNA menggunakan DNA menggunakan Nanophotometer
Nanophotometer
13 Langsung mengamati sampel DNA yang Menyimpan sampel DNA pada suhu -
berbentuk benang-benang putih 20 derajat celcius (freezer)

4. Mengapa beberapa larutan pada prosedur tahap persiapan isolasi DNA metode
CTAB tidak perlu disterilisasi dengan autoklaf? Berikan penjelasan!
Jawab:

Karna autoklaf berfungsi untuk mensterilisasi suatu benda menggunakan uap bersuhu
dan bertekanan tinggi (121oC, 15 lbs) selama kurang lebih 15 menit. Penurunan
tekanan pada autoklaf tidak dimaksudkan untuk membunuh mikroorganisme,
melainkan meningkatkan suhu dalam autoklaf.

5. Berdasarkan data nanofotometer di atas, sampel DNA apa saja yang tergolong murni
dan yang tidak murni? Berikan penjelasan, mengapa hal tersebut dapat terjadi!
Jawab:
 Berdasarkan data pada tabel di dapatkan bahwa sampel DNA yang tergolong murni
adalah sampel A (1.871) karena rasio A260/280 antara 1,8-2,0. Sedangkan sampel
DNA yang tergolong tidak murni adalah sampel B (1.301) dan C (1.216) Karna rasio
A260/280 nya kurang dari 1,8 yang berarti sampel yang diuji masih mengandung
kontaminan phenol dan pelarut yang digunakan terlalu banyak sedangkan DNA yang
diambil terlalu sedikit.

6. Bandingkan perbedaan metode isolasi DNA bakteri, manusia/hewan dan

tumbuhan!
Jawab:
 Isolasi DNA Bakteri

Proses isolasi DNA sel bakteri lebih mudah dibandingkan sel tumbuhan, hewan dan
manusia. Adapun tahap isolasi DNA genomik bakteri pada prinsipnya sama, yakni
lisis sel, pemisahan DNA dari protein dan komponen sel lainnya, dan pemurnian
DNA. Namun, bakteri memiliki dinding sel yang berbeda dari organisme lain.
Dinding sel bakteri mengandung peptidoglikan yang terletak di luar membran
sitoplasmik. Peptidoglikan berperan dalam kekerasan dan memberikan bentuk sel.
Ada dua tipe utama bakteri berdasarkan kandungan peptidoglikan dinding selnya
yaitu Gram positif dan Gram negatif. Perbedaan jenis bakteri seperti bakteri gram-
negatif dan positif juga menjadi dasar perbedaan teknik isolasi DNA pada bakteri.

 Isolasi DNA Manusia/ Hewan

Terdapat berbagai macam kendala yang sering ditemui dalam proses pengerjaan
isolasi DNA pada hewan seperti terlalu banyaknya lipid dan protein yang menyusun
suatu jaringan, dan adanya enzim nuklease pada beberapa organ hewan yang juga
dapat merusak asam nukleat. Masalah lain yang juga ditemukan dalam proses isolasi
DNA hewan adalah tingkat ketahanan dari organ atau jaringan hewan tidak seperti
tumbuhan dan lainnya, jaringan hewan dapat membusuk dengan cepat dan
menyebabkan kerusakan dalam jaringannya dalam waktu yang singkat, sehingga
disarankan dalam proses isolasi DNA hewan digunakan sampel yang masih segar.
Akan tetapi, untuk melakukan isolasi DNA hewan dengan menggunakan sampel
segar sangatlah sulit. Organ yang telah di ambil setelah pembedahan harus diawetkan
dan disimpan dalam freezer apabila akan digunakan pada lain hari.
Banyaknya kendala yang ada dalam proses isolasi DNA hewan dari jaringan atau
organ yang diawetkan menyebabkan tingkat keberhasilan isolasi DNA hewan
tersebut menjadi semakin minimum.

 Isolasi DNA tumbuhan

Isolasi DNA tumbuhan ada sedikit perbedaan dalam tahap lisis sel karena
struktur sel tumbuhan yang dikelilingi oleh dinding sel yang kaku. Oleh
karena itu, hal pertama yang dilakukan adalah menghancurkan dinding sel dan
membran sel. Secara fisik, sel tumbuhan dapat dihancurkan dengan bantuan
nitrogen cair dan ataupenggerusan menggunakan mortar-pestle. Kemudian
bubuk jaringan tumbuhan dilarutkan dengan bufer lisis. Ada banyak jenis
buffer lisis yang tersedia untuk berbagai jenis jaringan. Bufer lisis sel
tumbuhan yang umum digunakan adalah yangmengandung CTAB. Namun,
pada prinsipnya komponen utama dari bufer lisis adalahsama dan melakukan
fungsi yang sama dalam ekstraksi DNA.