LAPORAN PRAKTIKUM

NUTRIGENOMIK DAN APLIKASI TEKNIK MOLEKULER

PRAKTIKUM BASAH ISOLASI DNA

Dosen Pengampu:
Dr. Diana Nur Afifah, S.TP., M.Si.
Faizah Fulyani, S.Si., M.Sc., Ph.D.

Disusun oleh:
Kelompok 6 Kelas B

Elisabeth Maretta Kristianti Girsang 22030120130086

Monica Lemuela Christanto 22030120130090
Seto Iman Swastono 22030120130098
Yolanda Renata Primaningtyas 22030120130100
Nafidz Amara Khairunisa 22030120130102
Azka Nadia 22030120140028
Anisa Fibrianti 22030120140034

PROGRAM STUDI S-1 GIZI

FAKULTAS KEDOKTERAN
UNIVERSITAS DIPONEGORO
2023
 I. TINJAUAN PUSTAKA
PCR adalah suatu metode yang didasarkan pada kemampuan enzim DNA
polimerase untuk mensintesis untai DNA baru yang merupakan komplementer dari
DNA cetakan. Komponen utama reaksi PCR terdiri dari: template DNA atau DNA
cetakan; primer yang didesain; enzim DNA polimerase; dan nukleotida. Primer, salah
satu komponen PCR, adalah potongan pendek DNA untai tunggal yang komplemen
dengan urutan gen target. Terdapat dua jenis primer, yaitu primer forward dan primer
reverse. Primer yang berada sebelum daerah target disebut primer forward dan yang
berada setelah daerah target disebut primer reverse.(1,2)
Untuk mendapatkan hasil amplifikasi DNA yang tepat sasaran dengan sekuens
DNA yang diinginkan, primer yang digunakan haruslah spesifik dan memenuhi
syarat-syarat primer yang baik. Primer yang baik dilihat berdasarkan panjang basa
nukleotida (bp), konten GC (% GC), dan melting temperature (Tm). Pertama, primer
sebaiknya dibuat dalam rentang panjang 18 – 30 bp. Primer yang terlalu pendek akan
membuat primer tersebut menjadi kurang spesifik, sedangkan primer yang terlalu
panjang akan mempersulit proses penempelan primer pada template DNA
(annealing). Kedua, primer sebaiknya mengandung basa nukleotida guanin dan
sitosin (konten GC) sebesar 40 – 60%. Konten GC yang terlalu besar akan
mempersulit proses annealing karena Tm yang terlalu tinggi. Hal ini disebabkan oleh
ikatan hidrogen GC (3 ikatan) yang lebih kuat dan stabil daripada AT (2 ikatan).
Ketiga, perbedaan Tm antara primer forward dan reverse sebaiknya tidak lebih dari 5
0
C agar tidak terjadi penurunan efisiensi proses amplifikasi. Tm primer sendiri
umumnya berada dalam rentang 50 – 65 0C. (3) Tujuan dari praktikum kali ini adalah
untuk mempelajari dan memahami bagaimana membuat rancangan primer dari variasi
gen VDR Fok I rs2228570.

II. ALAT DAN BAHAN

a. Laptop
b. Artikel untuk menentukan variasi gen VDR Fok I
c. Website NCBI
d. Website TM calculator
III. HASIL PRAKTIKUM
VDR Vitamin D receptor [ Homo sapiens (human) ]
FOK 1 rs2228570

CCCCTTCCGGGACCGCCATTGCTCCTCACAAGGCACCTTGCGCGCCACCAAGGCG
AGAGGCCCCGCTTGCCCTCAGCAGGCCCTGGCGGCTCAGCCGCAGCCCGGCGCC
GTCCCCACGTACACCCATGGCGCCCTTCCCGACCTCTGACCGCGAGCTAGACGCG
CCAGGCCCGCCCCCCGGGCTGCGGAGCTCGGCAGCAGCCCCTCACTGCCTGCCCG
CGGCTCCAGGTCGCAGCCCCGGGAGGGGACATCCTGAGCACAGTCAGCGAGGGC
CGCGCCACCACGAGAACCACACCTCTCCAGGCCCCTTCTTCCCCTTCCGCCTCTA
ACCTGAGGGAATCGCTGCCGGAGCTTAAGGCAGTTCTCAGAGCTACTGCGGAGC
CAGGCGGGCGCGCACACAGGACAGACCCCTCGTCACCTCCCATACAGCAGCCAT
GCTCACCTGGGATAGCCCGCGTCAGACCACGCCACACCCGCTCAAAATCTGCAAT
GGCTCTGGCCTCCTTCCGGGCAAAAGCTGCCGTGCTCACCGTGGCCTGCAACGCC
CTGCTCCGCCCGCCTCGGGACCCCTCACCTGCAACCAGCGCCCACCCTGCTCATG
CCGCTCCCTCGCCCTTGAGCCTGCCAGGCCGTTCGTCTGTCAGTGTCTGTAACTGC
AATTCCCTCTGCCTGGAATGCGTTCCTCTCGAATGTCAGTCTACCCTGCTGACCCC
CTCATTCCCATAGATGGTGCTCAGGCATCCCCTGCGGAGGCCTTCCCTCATCGTCT
TATTTAAAAGTAAACCTCCACTCACACCCCATTCCCCTGCTTTACCTTTCTCCACA
GCCCCTACTGCCACCCAACAAAGTGTGTTTAACTTATTTTATTCATTGTCTCTCTA
CTAGATTGTAAGCTCCCCGTGGGCAGGGATTCAGGCCTGTTTTATTTATTGCTAA
CTCCCTGACACCTAGAACAGATACACGATAAATATTTGATGAATGAAGGACGGA
CTTTTAAAACCCATACACACATATACAAACGCATATGTATATATTCCTAGGTGTG
CATATCAAGGCTGCCACTGAGGGAGCACCAGCAATTAATACATCCCAGGCCCTG
GAAGAGGCCTGTATCAAGCCTGCACTCTGAGTGTCTAATTAATTCTTTCAATGAG
GCCGAGGTAAAAATGGACTACCCACATTATAAAACTGAAACTAAAGCTTGGAGT
TTAAGGAACTTGCCCAAGTGAGCCAGCAAGGAAAAGACAAAGCTCAACGTGCTC
TTCAGAACTCCAAATCCTGTGCTCTTTCCACCAATCAACCGTTCTCTTGGTTCTCA
CACCCCTAAGAACTTGCCCCGCTAATAGTAATGGGCCCATACATCTGCTGTCTTC
ACTACCAAACTGAGCTCTCTTGAGGCTACAGGAGCGTCTCCTCCTCTCTGTTTTTC
CAGGAGATATGCACACACACACACATAATATTCTAGCTCCTGGAAAATACTCCAT
CTCAATCACTCACTGTTAGAGATGTTAATTTTCTTTCTACCTGACT

Template DNA:

5’GCAATGGCTCTGGCCTCCTT 3’

3’ACCCTGCTGACCCCCTCATT 5’

Primer

Forward : GCAATGGCTCTGGCCTCCTT

Reverse : AATGAGGGGGTCAGCAGGGT
 Pada praktikum kali ini kami mencari variasi dari gen VDR Fok 1 yaitu pada
rs2228570. Kemudian, kami merancang template DNA yang kemudian kami jadikan sebagai
primer. Primer ini selanjutnya kami uji nilai melting temperature (Tm) nya dan setelah
dimasukkan kedalam Tm calculator, didapatkan suhu 68.1⁰ C dan 68.7⁰C yang artinya selisih
suhu tidak lebih dari 5⁰C. Primer kami juga memiliki panjang sebesar 20 bp dan memiliki
persen GC sebanyak 60%.

IV. PEMBAHASAN
1. Penjelasan Vitamin D Reseptor
Vitamin D telah memiliki peran penting dalam mempertahankan homeostasis
tulang dan kalsium, proliferasi sel, diferensiasi dan respon imun. Selain itu, vitamin D
juga telah terbukti memainkan peran kunci dalam banyak mekanisme antioksidan,
anti-fibrotik, anti-inflamasi, dan imunomodulator. Akibatnya, kekurangan vitamin D
berkontribusi terhadap beberapa kondisi patogen, termasuk infeksi pernapasan,
gangguan kardiovaskular, kanker, gangguan autoimun, dan diabetes. Vitamin D
merupakan nutrisi yang larut dalam lemak yang dikenal luas karena perannya dalam
kesehatan tulang, juga berperan dalam pengaturan kekebalan. Efek biologisnya,
termasuk pengaturan perkembangan sel T helper dan profil sekresi sitokin berikutnya,
dicapai melalui pengaturan ekspresi gen, yang dimediasi oleh reseptor vitamin D
(VDR).(4)
 Reseptor vitamin-D (VDR) yang telah berikatan dengan ligannya,
ditranslokasikan ke nukleus. Koneksi ini dapat mengontrol dan mengatur ratusan gen
yang ada dalam tubuh. Gen VDR terletak pada kromosom 12q13. Terdapat lebih dari
470 polimorfisme nukleotida tunggal (SNP) yang ditemukan pada gen ini. Empat SNP
signifikan dalam gen VDR, termasuk rs1544410, rs731236, rs7975232, dan
rs2228570, dapat memengaruhi aktivitas, stabilitas, dan tingkat ekspresi produk gen
VDR, dan kemudian mengubah sumbu pensinyalan vitamin D-VDR yang
menyebabkan disfungsi vitamin D.(5)

2. Hasil Searching Gen Vit D Reseptor di NCBI

Berdasarkan data VDR pada NCBI, Gen VDR memiliki ID 7421, terletak
pada kromosom dengan nomor 12, pada lengan panjang, region 1, sub region 3,
pita ke 11, dan memiliki jumlah exon sebanyak 12. VDR ini dapat ditranslasikan
M-RNA sebanyak 6 sebagai berikut,
1. NM_000376.3 → NP_000367.1 vitamin D3 receptor isoform VDRA
- Homo sapiens vitamin D receptor (VDR), transcript variant 1, mRNA
- Memiliki 4616 bp → 427 asam amino
 -

2. NM_001017535.2 → NP_001017535.1 vitamin D3 receptor isoform

VDRA
- Homo sapiens vitamin D receptor (VDR), transcript variant 2, mRNA
- Memiliki 4738 bp → 427 asam amino

3. NM_001017536.2 → NP_001017536.1 vitamin D3 receptor isoform

VDRB1
- Homo sapiens vitamin D receptor (VDR), transcript variant 3, mRNA
- Memiliki 5007 bp → 477 asam amino
 -

4. NM_001364085.2 → NP_001351014.1 vitamin D3 receptor isoform

VDRAx
- Homo sapiens vitamin D receptor (VDR), transcript variant 1, mRNA
- Memiliki 4616 bp → 494 asam amino

5. NM_001374661.1 → NP_001361590.1 vitamin D3 receptor isoform

VDRA
- Homo sapiens vitamin D receptor (VDR), transcript variant 4, mRNA
- Memiliki 5048 bp → 427 asam amino
 -

6. NM_001374662.1 → NP_001361591.1 vitamin D3 receptor isoform

VDRA
- Homo sapiens vitamin D receptor (VDR), transcript variant 5, mRNA
- Memiliki 4535 bp → 427 asam amino

3. Penjelasan Variasi Genetik (FOK 1 rs 2228570)

Variasi gen VDR Fok I rs2228570 ditemukan pada kodon start translasi.
Fok I terletak di ujung 5' gen VDR . Dalam SNP, karena substitusi nukleotida T
menjadi C dalam kodon pertama ekson 2 (ATG menjadi ACG menimbulkan
konversi alel "f" menjadi "F"), situs inisiasi terjemahan pertama (TIS)
dihilangkan dan menghasilkan produksi peptida yang lebih pendek dari peptida
aslinya (3 asam amino tidak ada) sehingga menciptakan bentuk baru VDR yang
lebih aktif secara transkripsi (6).
Perubahan variasi gen VDR Fok I rs2228570 terjadi pada start codon
(ATG), ketika terdapat sitosin (C), situs mulai digunakan, kemudian
menghasilkan protein dengan ukuran yang berbeda. Polimorfisme Fok I dapat
menghasilkan protein yang terpotong dan berhubungan dengan peningkatan risiko
hipertensi. Polimorfisme Fok I disebabkan oleh transisi timin (T) ke sitosin (C)
yang mengarah ke pergeseran bingkai translasi ditandai dengan perluasan ke
kodon inisiasi berikutnya (ATG), kemudian menghasilkan sintesis protein asam
amino 424 yang terpotong. Di dalam protein asam amino 427, metionin yang
dikodekan ATG (Bentuk M1) hadir di f alel, sedangkan metionin yang dikodekan
ACG (bentuk M4) hadir dalam F alel. Protein terpotong pada individu dengan
genotipe FF dianggap mendorong perkembangan hipertensi esensial dengan
meningkatkan produksi renin dan angiotensin II (7).
Terdapat penelitian yang mengungkapkan bahwa polimorfisme nukleotida
tunggal (SNP) dari gen VDR (BsmI, TaqI, ApaI, FokI) berhubungan dengan risiko
perkembangan kanker. Untuk menyelidiki polimorfisme dari gen VDR (BsmI,
TaqI, ApaI, FokI), diterapkan teknik polimerase chain reaction-restriction
fragment length polymorphism (PCR-RFLP). Primer PCR spesifik dirancang
menggunakan perangkat lunak desain primer oligo yang kuat dan database SNP.
Didapatkan hasil bahwa polimorfisme gen VDR FokI dapat meningkatkan risiko
perkembangan GC dan menjadi predisposisi penyakit melalui mekanisme tertentu
(6). Pada penelitian lainnya disebutkan bahwa pada polimorfisme VDR FokI,
genotipe FF sering terlihat pada pasien kusta paucibacillary (PB) (8).
V. DAFTAR PUSTAKA
1. Purwakasih DB, Achyar A. Primer Design and in Silico PCR for Detection
Shigella Sp. on Refilled Water Samples. Serambi Biol [Internet]. 2021;6(1):1–
6.
2. Widayat W, Winarni Agustini T, Suzery M, Ni’matullah Al-Baarri A, Rahmi
Putri S. Real Time-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) sebagai Alat
Deteksi DNA Babi dalam Beberapa Produk Non-Pangan. Indones J Halal.
2019;2(1):26.
3. Purwakasih DB, Achyar A. Primer Design and in Silico PCR for Detection
Shigella Sp. on Refilled Water Samples. Serambi Biologi. 2021;6(1):1–6
4. Chen YM, Ping XU, Wang ZT, Zhu YM, Gong CM, Huang CH, Liu XL,
Zhou JC. Polymorphisms of the Vitamin D Receptor Gene and Sex-
Differential Associations with Lipid Profiles in Chinese Han Adults.
Biomedical and Environmental Sciences. 2022 Feb 1;35(2):115-25.
5. Gariballa S, Al-Bluwi GS, Yasin J. Frequency of Vitamin D Receptor Gene
Polymorphisms in a Population with a very High Prevalence of Vitamin D
Deficiency, Obesity, Diabetes and Hypertension. Biomedicines. 2023 Apr
18;11(4):1202.
6. Hoseinkhani Z, et al. Asosiasi Polimorfisme Reseptor Vitamin D (Fok1
(rs2228570), ApaI (rs7975232), BsmI (rs1544410), dan TaqI (rs731236))
dengan Kanker Lambung di Antara Populasi Kurdi dari Barat Iran. Reports of
Biochemistry and Molecular Biology. 2021;9(4):435-441.
7. Awasthi R, et al. Fok I and Bsm I Gene Polymorphism of Vitamin D Receptor
and Essential Hypertension: A Mechanistic Link. Clinical Hypertension.
2023;9(5):3-12.
8. Lubis RD, et al. Vitamin D Receptor Gene Polymorphisms FokI rs2228570,
ApaI rs797523, and TaqI rs731236 in Multibacillary Leprosy Patients.
Macedonian Journal of Medical Sciences. 2021;9(B):112-115.