LAPORAN PRAKTIKUM "MIKROBIOLOGI PEWARNAAN GRAM DAN

PENGAMATAN MORFOLOGI BAKTERI"

A. Judul Praktikum
PEWARNAAN GRAM DAN PENGAMATAN MORFOLOGI BAKTERI
B. Tujuan Praktikum
Mengetahui dan memahami prosedur pewarnaan gram dan mengelompokkan
bakteri gram positif atau bakteri gram negatif serta menentukan morfologinya.
C. Pendahuluan
1. Latar Belakang
Bakteri mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas. Bakteri
merupakan mikroorganisme yang berukuran mikroskopik. Selain mikroskopik, bakteri juga
hampir tidak berwarna atau transparan dan kontras dengan air. Sehingga melihat dan mengamati
bakteri dalam kedaan hidup sangat sulit. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu
teknik pewarnaan sel bakteri. Ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-
penelitian mikrobiologi. Hal itu untuk mempernudah proses identifikasi bakteri.
Untuk mengidentifikasi suatu biakan murni bakteri hasil isolasi mula-mula diamati
morfologi sel secara mikroskopik melalui pengecetan atau pewarnaa, salah satunya adalah dengan
pewarnaan gram. Pewarnaan gram merupakan salah satu prosedur yang paling banyak digunakan
untuk mencirikan banyak bakteri. Dari pewarnaan gram dapat diketahui morfologi sel antara lain
sifat gram, bentuk sel, dan penataan sel. Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode
empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, Gram positif dan gram
negatif, berdasarka sifat kimia dan fisika dinding sel mereka, metode ini diberi nama berdasarkan
penemunya, ilmuwan denmark hans Christian gram 1884. Pewarnaan Gram dibagi menjadi dua
yaitu pewarnaan majemuk karena menggunakan lebih dari satu macam zat warna. Dan pewarnaan
diferensial karena pewarnaan ini mampu mengdeferensiasi atau membedakan bakteri, sehingga
bakteri dapat digolongkan menjadi dua yaitu Gram negatif dan Gram positif.
Selain dengan pewarnaan atau pengecatan, identifikasi bakteri dapat berupa melihat
morfologi koloni dan uji biokimia bakteri. Morfologi bakteri meliputi bentuk, ukuran, tekstur,
warna koloni,dll. Semantara uji biokimia dilakukan untuk memastikan jenis/spesies bakterinya.
Oleh karena itu, dilakukan praktikum ini untuk mengetahui teknik pewarnaan bakteri, morfologi
koloni, dan uji biokimia sehingga dapat mempernudah untuk isdentifikasi bakteri.
2. Tinjauan Teori
Pada umumnya bakteri bersifat tembus cahaya, hal ini disebabkan karena banyak
bakteri yang tidak mempunyai zat warna (Waluyo, 2007) . Salah satu cara untuk mengamati
bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau
pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui
reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan.
 Pewarnaan atau pengecatan terhadap mikroba banyak dilakukan baik secara
langsung (bersama bahan yang ada) ataupun secara tidak langsung (melalui biakan murni). Tujuan
dari pewarnaan tersebut ialah untuk :
1. Mempermudah melihat bentuk jasad, baik bakteri, ragi, ataupun fungi.
2. Memperjelas ukuran dan bentuk jasad.
3. Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan juga struktur dalam jasad.
4. Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat-sifat fisik
dan kimia yang ada akan dapat diketahui (Suriawiria, 1999).
Ada tiga macam prosedur pewarnaan, yaitu pewarnaan sederhana (simple stain),
pewarnaan diferensial (differential strain), dan pewarnaan khusus (special strain) (Pratiwi,
2008). Pada pewarnaan sederhana hanya digunakan satu macam zat warna untuk meningkatkan
kontras antara mikroorganisme dan sekelilingnya. Prosedur Pewarnaan sederhana mudah dan
cepat, sehingga pewarnaan ini sering digunakan untuk melihat bentuk ukuran dan penataan pada
mikoorganisme bakteri pada bakteri dikenal bentu yang bulat (coccus), batang (basil), dan spiral
(Lay, 1994).
Pewarnaan bakteri yang menggunakan lebih dari satu zat warna seperti pewarnaan gram
dan pewarnaan tahan asam. Pewarnaan gram adalah salah satu teknik pewarnaan diferensial yang
paling penting dan paling luas digunakan untuk bakteri. Bakteri yang diwarnai dengan metode
gram ini dibagi menjadi dua kelompok, salah satu diantaranya bakteri gram positif dan bakteri
gram negatif (Pelczar & Chan, 1986).
Pada pewarnaan gram, bakteri yang telah difiksasi dengan panas sehingga membentuk
noda pada kaca objek diwarnai dengan pewarna basa yaitu crystal violet. Karena warna ungu
mewarnai seluruh sel, maka pewarna ini disebut pewarna primer. Selanjutnya noda dicuci dan pada
noda spesimen ditetesi iodin yang merupakan mordant. Setelah iodin dicuci, baik bakteri Gram
Positif maupun Gram Negatif tampak berwarna ungu. Selanjutnya noda spesimen dicuci dengan
alkohol yang merupakan decolorizing agent (senyawa peluntur warna) yang pada spesies bakteri
tertentu dapat menghilangkan warna ungu dari sel. Setelah alkohol dicuci, noda spesimen diwarnai
kembali dengan safranin yang merupakan pewarna basa berwarna merah. Bakteri yang tetap
berwarna ungu digolongkan ke dalam Gram Positif, sedangkan bakteri yang berwarna
merahdigoongkan ke dalam Gram Negatif (Suriawiria, 1999).
Perbedaan warna antara bakteri Gram Negatif dan bakteri Gram Positif disebabkan oleh
adanya perbedaan struktur pada dinding selnya. Dinding Gram Positif mengandung banyak
peptidoglikan, sedangkan dinding bakteri Gram Negatif banyak mengandung
lipopolisakarida(Suriawiria, 1999).
Pewarna yang digunakan antara lain : kristal violet sebagai gram A, iodine sebagai gram
B, alkohol sebagai gram C, serta safranin sebagai gram D. Bakteri tahan asam merupakan bakteri
yang kandungan lemaknya sangat tebal sehingga tidak bisa diwarnai dengan reaksi pewarnaan
biasa, tetapi harus dengan pewarnaan tahan asam. Kelompok bakteri ini disebut bakteri tahan asam
 (BTA) karena dapat mempertahankan zat warna pertama sewaktu dicuci dengan larutan pemucat.
Golongan bakteri ini biasanya bersifat patogen pada manusia contohnya adalah Mycobacterium
tuberculosis (Pelczar & Chan, 1986)
Pengamatan morfologi bakteri meliputi bentuk, ukuran, tekstur, dan warna koloni.
Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), coccus, spirilum. Bakteri yang berbentuk
tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk basil pembagiannya yaitu
basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil.Sedangkan pada coccus dibagi menjadi monococcus,
diplococcus, sampai stophylococcus. Khusus pada spirilum hanya dibagi dua yaitu setengah
melengkung dan melengkung (Hadioetomo, 1993).
D. Tinjauan Pustaka
Mikrobioligi adalah ilmu yang mempelajari makhluk-makhluk hidup yang kecil, yang
hanya dapat dilihat dengan mikroskop (mikros= kecil, bios= hidup, dan logos= ilmu). Makhluk
hidup yang kecil ini disebut mikroba atau mikro-organisme. Bakteri berasal dari kata
latinbacterium (jamak, bacteria) , adalah kelompok raksasa dari organisme hidup. Mereka
sangatlah kecil (mikroskopik) dan kebanyakan uniseluler (bersel tunggal), dengan struktur sel
yang relatif sederhana tanpa nucleus (inti sel, cytoskeleton, dan organel lain seperti mitoondria dan
kloroplas. Istilah bakteria telah diterapkan untuk semua prokariota atau kelompok besar
mereka, tergantung pada gagasan mengenai hubungan mereka. Bakteri adalah yang paling
berkelimpahan dari semua organisme. Mereka tersebar (tersebar dimana-mana) di tanah, air, dan
sebagai simbiosis dari organisme lain. Banyak pathogen merupakan bakteri. Kebanyakan dari
mereka kecil, biasanya hanya berukuran 0,5 , meski ada jenis yang dapat mencapai 0,3mm.
Meski umumnya memiliki dinding, seperti sel tumbuhan dan jamur, tertapi dengan komposisi yang
sanngat berbeda (peptidoglikan). Banyak yang bergerak menggunakan flagella, yang berbeda
dalam strukturnya dari flagella kelompok lain. Bakteri pertama ditemukan oleh Anthony van
Leewenhoek pada tahun 1674. Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi,
struktur dan sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak
berwarna dan kontras dengan air, dimana el-sel bakteri tersebut di suspensikan,. salah satu cara
untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah degan metode
pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu
mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangakaian pengecatan (Entjang, 2003).
Bakteri merupakan organisme prokariot. Umumnya ukuran bakteri sangat
kecil, bentuk tubuh bakteri baru dapat dilihat dengan menggunakan mikroskop dengan
pembesaran 1.000 X atau lebih (Waluyo, 2004). Sel bakteri memiliki panjang yang beragam, sel
beberapa spesies dapat berukuran 100 kali lebih panjang daripada sel spesies yang lain. Bakteri
merupakan makhluk hidup dengan ukuran antara 0,1 sampai 0,3 m. Bentuk bakteri bermacam
macam yaitu elips, bulat, batang dan spiral. Bakteri lebih sering diamati dalam olesan terwarnai
dengan suatu zat pewarna kimia agar mudah diamati atau dilihat dengan jelas dalam hal ukuran,
bentuk, susunan dan keadaan struktur internal dan butiran. Sel sel individu bakteri dapat berbentuk
seperti bola/elips, batang (silindris), atau spiral (heliks) (Pelczar & Chan, 2007).
Pewarnaan bakteri bertujuan untuk memudahkan melihat bakteri dengan mikroskop,
memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, untuk melihat struktur luar dan struktur dalam bakteri
seperti dinding sel dan vakuola, menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia yang khas daripada bakteri
dengan zat warna, serta meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnya. Teknik
pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi tiga macam yaitu pengecatan sederhana,
pengecatan diferensial dan pengecatan struktural. Pemberian warna pada bakteri atau jasad- jasad
renik lain dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan, yang
sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana. Prosedur pewarnaan yang menampilkan
perbedaan di antara sel-sel mikroba atau bagian-bagian sel mikroba disebut teknik pewarnaan
diferensial (Pelczar & Chan, 2007). Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan
menjadi tiga macam yaitu pengecatan sederhana, pengecatan diferensial dan pengecatan struktural.
Pemberian warna pada bakteri atau jasad- jasad renik lain dengan menggunakan larutan tunggal
suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan, yang sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan
sederhana. Prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara sel-sel mikroba atau
bagian-bagian sel mikroba disebut teknik pewarnaan diferensial (Pelczar & Chan, 2007).
Bakteri yang diwarnai dengan teknik pewarnaan Gram terbagi dua golongan, yaitu:
Gram positif , bila warna zat pewarna pertama (karbol gentian violet) tetap bertahan, dengan
demikian warna se bakteri tampak ungu tua; dan Gram negatif, bila warna zat pewarna
pertama tidak bertahan (luntur) kemudian tercat oleh zat pewarna tandingannya, misal: air fuchsin,
safranin, dan oleh zat pewarna tandingan lainnya. (Razali, 1987)
Penyebab terjadinya dua golongan bakteri yaitu Gram positif dan Gram negatif ialah
setelah diberi zat pewarna fenomenanya ini, berhubungan dengan struktur dan komposisi dinding
sel. Perbedaan ketebalan antara kedua golongan itu dapat merupakan hal yang penting; dinding sel
bakteri Gram negatif pada umumnnya lebih tipis dari yang dimiliki bakteri Gram positif.
Presentasi kandungan lipid bakteri Gram negatif lebih tinggi daripada Gram positif. Kenyataannya
dalam eksperimen pengecatan mennjukkan bahwa perlakuan dengan alkohol mengeskstrak lipid,
yang menyebabkan poisitas atau permeabilitas didding sel meningkat. Denagn demikian,
kompleks karbol gentian violet dan lugol dapat disari keluar dan bakteri Gram negatif terwarnakan.
Keterangan lain yang hampir sama juga mendasarkan pada perbedaan permeabilitas antara kedua
golongan bakteri itu, yaitu pada bakteri Gram negatif kandungan peptidoglikan jauh lebih sedikit
sehingga kerapatan jalinannya jauh lebih sedikit daripada baktri gram posiif. Pori-pori dalam
peptidoglikan bakteri Gram negatif tetap masih cukup besar untuk dapat disari keluar kompleks
karbol gentian violet dan lugol. Selautnya, bila sel-sel Gram psitif diperlakukan dngan lisozim
untuk menyingkirkan dinding selnya, sisa strukturnya yang disebut protoplas atau sel tanpa
dinding akan tercatat juga oleh kompleks karbol gentian violet dan lugol. Tetapi, sel ini mudah
dihapuskan oleh alkohol. Kenyataan ini menunjukkan bahwa struktur dinding sel bakteri Gram
positif itu yag menjadi tempat tertahannya zat pewarna pertama yaitu karbol gentian violet.
(Razali, 1987).
Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnya
berwarna. Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif. Senyawa-senyawa
kimia ini berguna untuk membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel bakeri akan
memberikan warna berbeda. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri.
Sel-sel warna dapat dibagi menjadi dua golongan yaitu asam dan basa. Jika warna terletak pada
muatan positif dari zat warna, maka disebut zat warna basa. Jika warna terdapat pada ion negatif,
maka disebut zat warna asam. Contoh zat warna basa adalah methylen blue, safranin, netral red,
dan lain-lain. Sedangkan anionnya pada umumnya adalah Cl-, SO4-, CH3COO-, COOHCOO. Zat
warna asam umumnya mempunyai sifat dapat bersenyawa lebih cepat dengan bagian sitoplasma
sel sedangkan zat warna basa mudah bereaksi dengan bagian-bagian inti sel. Pewarnaan bakteri
dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti : fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan
dan penggunaan zat warna penutup (Sutedjo, 1991).
Prinsip dasar dari pewarnaan adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari
bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Ikatan ion dapat terjadi karena
adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna. Terdapat tiga mcam
metode pewarnaan yaitu pewarnaan sederhana, pewarnaan diferensial dan pewarnaan gram.
Pewarnaan sederhana menggunakan pewarna tunggal, pewarnaan diferensial memakai
serangkaian larutan pewarna atau reagen. Pewarnaan gram merupakan metode pewarnaan yang
paling umum digunakan untuk mewarnai sel bakteri (Umsl, 2008).
Zat pewarna adalah garam yang terdiri atas ion positif dan ion negatif, salah satu di
antaranya berwarna. Pada zat warna yang bersifat basa, warna terdapat pada ion positif (zat
pewarna+ Cl-) dan pada pewarna asam, warna akan terdapat pada ion negatif (zat pewarna- Na+).
Hubungan antara bakteri dengan zat pewarna basa yang menonjol disebabkan terutama oleh
adanya asam nukleat dalam jumlah besar dalam protoplasma sel. Jadi, jika bakteri itu diwarnai,
muatan negatif dalam asam nukleat bakteri akan bereaksi dengan ion positif zat pewarna basa,
Kristal violet, safranin dan metilin blue adalah beberapa zat pewarna basa yang biasa digunakan.
Sebaliknya zat pewarna asam ditolak oleh muatan negatif bakteri menyeluruh. Jadi, mewarnai
bakteri dengan zat pewarna asam akan menghasilkan hanya pewarnaan pada daerah latar belakang
saja. Karena sel bakteri tak berwarna di atas latar belakang yang berwarna (Volk & Wheeler,
1993).
Pewarnaan gram ditemukan pada tahun 1884 oleh seorang dokter kebangsaan
Denmark Christian Gram (membuat zat pewarna khusus) pewarna tersebut merupakan pewarna
differensial karena dapat membagi bakteri menjadi dua kelompok fisiologi, yang akan
memudahkan untuk identifikasi. Prosedur pertama dari pewarnaan gram ini adalah memberi
pewarna kristal violet, setelah 1 menit dibilas dan kemudian akan diberikan pewarna yodium,
setelah satu menit dibilas dan kemudian akan diberi laputan alkohol 95% selama 30 detik,
kemudian dibilas dan diberi pewarna safranin atau bismarck (untuk buta warna merah) selama 1
menit. Zat pewarna kristal violet dan yodium akan membentuk senyawa yang kompleks. Beberapa
bakteri akan melepaskan zat pewarna dengan mudah apabila dicuci dan beberapa bakteri yang lain
zat pewarna akan bertahan walaupun dicuci dengan alkohol 95%. Bakteri gram positif akan
terwarna ungu (kristal violet) dan bakteri gram negatif akan terwarna merah (safranin) (Umsl,
2008).
Pewarnaan terhadap bakteri yang paling sering dilakukan adalah pewarnaan Gram dan
ZiehlNelsen. Pewarnaan tersebut untuk mengetahui morfologi, struktur, dan karakteristik bakteri.
Pewarnaan Gram dapat mengidentifikasi penyakit infeksi. Prosedur pewarnaan Gram dimulai
dengan pemberian kristal violet, setelah itu ditambahkan larutan iodium maka semua bakteri akan
berwarna biru. Setelah itu ditambah alkohol. Bakteri Gram positif membentuk kompleks Kristal
iodine yang berwarna biru. Setelah di tambahkan safranin, bakteri Gram positif akan berwarna
ungu. Contoh bakteri Gram positif adalah Streptococcus, Bacillus, Stapilococcus, Clostridia,
Corynebacterium dhypteriae, Peptococcus, Peptostreptococcus, dll. Sedangkan bakteri Gram
negatif akan terdekolorisasi oleh alcohol dan pemberian safranin akan memberikan warna merah
pada bakteri Gram negatif. Contoh bakteri Gram negative adalah Neisseria, Klebesiella,
Vellonella, Shigella, Salmonella, Hemophillus, dll (Cappuccino & Sherman, 1983).
Proses pewarnaan gram ini memerlukan 4 jenis reagen. Bakteri terbagi atas dua
kelompok berdasarkan pewarnaan ini, yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif.
Perbedaan ini berdasarkan warna yang dapat dipertahankan bakteri. Reagen pertama disebut warna
dasar, berupa pewarna basa, jadi pewarna ini akan mewarnai dengan jelas. Reagen kedua disebut
bahan pencuci warna (decolorizing agent). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada
komposisi dinding sel, bila komponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak akan
tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat mengikat warna dasar, maka warna akan
tercuci. Reagen terakhir adalah warna pembanding, bila warna tidak tercuci maka warna
pembanding akan terlihat, yang terlihat pada hasil akhir tetap warna dasar. Larutan yang biasa
dipakai adalah ungu kristal, lartan iodium, alkohol dan safranin (Tracy, 2005).
Teori Salton menjelaskan bahwa ada konsentrasi lipid yang tinggi pada dinding sel
bakteri Gram negatif. Sehingga jika lipid dilarutkan dalam pemberian alcohol, maka poripori akan
membesar dan tidak mengikat pewarna. Hal ini menyebabkan bakteri menjadi tidak berwarna.
Sedangkan bakteri Gram positif akan mengalami denaturasi selama pemberian alcohol. Hal ini
akan mengecilkan poripori sehingga menghasilkan kompleks kristal iodium. Bakteri Gram positif
memiliki dinding sel yang kuat dan lapisan peptidoglikan sebanyak 30 lapisan sehingga
permeabilitas dinding selnya menjadi berkurang. Sedangkan bakteri Gram negatif hanya memiliki
12 lapisan peptidoglikan sehingga memiliki permeabilitas dinding sel yang lebih besar.
Pewarnaan Gram terdiri atas Gram A (violet) (Kristal violet, Aalkohol, Ammonium oksalat,
Aquades), Gram B (cokelat) (Iodium, Kalium iodide, Aquades), Gram C (Aseton, Alcohol), Gram
D (merah) (Safranin, Alcohol, Aquades) (Madigan, 2003).
 Secara garis besar teknik pewarnaan bakteri dapat dikategorikan sebagai berikut:
pewarnaan sederhana, pewarnaan differensial (pewarnaan gram dan pewarnaan tahan asam),
pewarnaan khusus untuk melihat struktur tertentu : pewarnaan flagel, pewarnaan spora, pewarnaan
kapsul, pewarnaan khusus untuk melihat komponen lain dan bakteri (pewarnaan Neisser (granula
volutin), pewarnaan yodium (granula glikogen) dan pewarnaan negatif (Gozali, 2009).
Memurut Pelezar and Chan, 2007 secra morfologi sel bakteri memnyai bagian-bagian
sebagai berikut:
1. Kapsul : lapisan tebal dari lendir yang membungkus sel. Fungsi kapsul adalah melindungi sel dari
kondisi lingkungan yang tidak menguntungkan sebagai sarana pengikat antar sel satu dengan yang
lainnya. Kapsul berhubungan dengan sifat patogenitas dimana bakteri yang berkapsul biasanya
bersifat patogen akan hilang/ berkurang. Hal ini terjadi karena kapsul melindungi bakteri dari dari
sistem imun tubuh, sehingga ketika bakteri masuk ke tubuh hospes, sistem imun tubuh tidak
mampu lelawan bakteri.
2. Dinding sel : bagian sel yang membungkus isi sel, terletak antara kapsul dan membran sitoplasma
dengan struktur sangat kaku. Tebal sel 10-35mm. Fungsi dindiing sel adalah pelindung sel dari
tekanan osmosis, memberi bentuk pada sel, dan berperann dalam reproduksi.
3. Membran sel/sitoplasma : lapisan tipis yang bersifat permiabel, fungsinya untuk mengatur zat-zat
masuk dan keluar sel.
4. Pili : benang-benag halus yang keluar dari dinding sel (seperti filamen tetapi bukan
flagela).Jumlah pili lebih banyak, lebih pendek, dan lebih kecil dari flagela.
5. Flagela : alat gerak dari bakteri terdiri dari rambut tipis yang mencuat menembus dinding sel dan
bermula dari dasar tubuh, merupakan suatu struktur granular yang tepat dibawah membran sel
dalam sitoplasma. Flagela terdiri dari tiga bagian yaitu tubuh dasar, struktur seperti kait dan
sehellai filamen panjang di luar dinding sel. Panjang flagel: beberapa kali panjang sel, namun
diameternya lebih kecil daripada diameter ssel (10-20).
6. Kromoson : merupakan pembawa sifat yang diturunkan pada sel anakan.
7. Krommosom : bakteri tidak terbentuk membran (DNA telanjang), biasanya terdiri dari satu sel
DNA yang sirkuler
8. Plasmit : bahan genetk tambahan yang bersifat otonom.
9. Ribosom : tempat sintesis protein.
E. Alat dan Bahan
1. Alat:
a. Pipet tetes
b. Kawat ose
c. Lampu bunsen
d. Mikroskop
e. Botol semprot
f. Cover Glass
g. Korek api
h. Object Glass
i. Kapas
j. Hair drier
2. Bahan:
1. Pewarna gram
a. Biakan murni
b. Garm A: Methylene blue
c. Gram B: Iodium
d. Gram C: Alkohol
e. Gram D: Safranin
f. Air
g. Minyak imersi
F. CARA KERJA

obyek glass difiksasi/diaseptiskan

satu ose biakan kuman murni (bacilus sp.) diletakkan di atas obyek glass

diratakan biakan kuman murni dengan

jarum ose

difiksasi dengan melidah apikan bagian yang tidak ada kumannya di atas bunsen 2-3 kali
dengan cepat

dituangkan pewarna carbol gentian violet, biarkan selama 1 menit

dibuang sisa carbol gentian violet, dicuci preparat dengan air mengalir
 dikeringkan preparat dengan membiarkan di udara terbuka/ dihair drier

dituangkan pewarna iodium, biarkan selama 2 menit

dibuang sisa iodium

dicuci preparat dengan air mengalir

dikeringkan preparat diudara terbuka/ dihair drier

dipucatkan dengan alkohol 95% dengan cara meneteskan perlahan sampai warna ungu
hilang

dibilas dengan air mengalir

dituangkan pewarna safranin sebagai pewarna penutup/ pembanding biarkan selama 30 detik

dibuang kelebihan safranin

dicuci preparat dengan air mengalir

dikeringkan preparat dengan meletakkan diantara 2 buah kertas isap

 ditambahkan minyak imersi pada preparat dan amati preparat dibawah mikroskop dengan
perbesaran lemah (10 X) kemudian perbesaran kuat (100)
G. Data dan Hasil
KELOMPOK NAMA BAKTERI TERMASUK WARNA GAMBAR
GRAM (+) GRAM (-)
7 Bacillus sp. Ungu
Berbentuk
batang (basil)

H. Pembahasan
Laporan praktikum mikrobiologi kali ini adalah pewarnaan dan pengamatan morfologi
pada bakteri. Pewarnaan Gram merupakan salah satu teknik pewarnaan yang dikerjakan di
laboratorium mikrobiologi untuk kepentingan identifikasi mikroorganisme. Morfologi
mikroskopik mikroorganisme yang diperiksa dan sifatnya yang khas terhadap pewarnaan tertentu
(pewarnaan gram) dapat digunakan untuk identifikasi awal. Pewarnaan gram dibagi menjadi dua
hasil yaitu gram positif dan gram negative, tergantung dari reaksi dinding sel terhadap tinta
safranin atau Kristal violet.
Proses sterilisasi sangat penting dibutuhkan sebelum memulai maupun mengakhiri sebuah
pekerjaan di laboratorium dengan menggunakan teknik aseptik. Alkohol 70% yang disemprotkan
pada tangan, kaca preparat dan meja, bahkan tangan pun sebelumnya harus dicuci dengan sabun
terlebih dahulu. Hal tersebut berfungsi untuk membunuh mikroorganisme yang tak diinginkan agar
mendapatkan pengukuran yang akurat.
Pada proses pewarnaan gram, harus gelas obyek yang bersih. Pembersihan ini dilakukan
supaya gelas obyek bebas lemak dan debu. Pembersihan biasanya menggunakan alkohol. Setelah
di cuci kemudian di beri satu tetes aquades pada permukaan gelas obyek. Kultur bakteri murni
diambil dan diratakan diatas kaca obyek. Pengambilan kultur bakteri tidak diambil terlalu banyak,
karena jika terlalu banyak akan sulit diratakan dan apabila kultur bakteri tidak dapat diratakan
tipis-tipis maka bakteri akan tertimbun hal ini akan mengakibatkan pemeriksaan bentuknya satu
per satu menjadi tidak jelas.
Apabila sudah kering, dilakukan fiksasi dengan cara melewatkan diatas nyala api. Proses
fiksasi dilakukan supaya bakteri benar-benar melekat pada kaca obyek sehingga olesan bakteri
tidak akan terhapus apabila dilakukan pencucian. Yang perlu diperhatikan dalam proses fiksasi
adalah bidang yang mengandung bakteri dijaga agar tidak terkena nyala api.
 Setelah dilakukan fiksasi kemudian ditetesi dengan larutan gram A (methylene blue)
sebanyak 1-2 tetes dan dibiarkan selama 1 menit. Kemudian dicuci dengan air mengalir dan
dibiarkan sampai kering dengan cara dianginkan dan menggunakan tissue untuk mengeringkan
bagian bawah ojek gelas. Pencucian dengan air bertujuan untuk mengurangi kelebihan zat warna
dari methylen blue.
Kemudian ditambahkan larutan gram B yang merupakan iodium. Gram B merupakan
larutan yang berfungsi untuk meningkatkan afinitas pengikatan zat warna oleh bakteri sehingga
pengikatan zat warna oleh bakteri lebih kuat, memperjelas warna dari zat warna tersebut,
mempersulit pelarutan zat warna. Pada pewarnaan gram, penambahan larutan mordan
menyebabkan terbentuknya persenyawaan kompleks. Tanpa penambahan larutan mordan, zat
warna methylene blueakan larut saat penambahan larutan alkohol. Lalu dibiarkan selama 1 menit
untuk dibilas kembali dengan aquades. Akibat pemberian cat Gram B, maka pengikatan warna
oleh bakteri akan lebih baik (lebih kuat).
Alkohol 95% ditambahkan atau diteteskan pada biakan bakteri untuk melakukan penetrasi
ke dalam dinding sel dan melunturkan pewarnaan biru dari komplek methylen blue dan KI pada
gram negatif, karena mengandung lipid sedangkan pada gram positif akan tetap mempertahankan
warna biru karena mengandung peptidoglikan. Larutan ini juga berfungsiuntuk melarutkan lipida
pada membrane bakteri gram negatif yang akan menyebabkan pori-pori sel membesar sehingga
meningkatkan daya larut persenyawaan methylene blue.Perlakuan ini dilakukan tidak
membutuhkan waktu yang lama atau secepat mungkin untuk melakukan pembilasan dengan
aquades. Kemudian dilakukan pengeringan.
Pewarnaan selanjutnya dengan menggunakan safranin (gram D) sebanyak 2 tetes dan
diamkan selama 30 detik. Safranin pada gram D tidak akan menyebabkan perubahan warna pada
bakteri positif karena persenyawaan kompleksmethylene blue tetap terikat pada dinding sel. Pada
bakteri gram negatif penambahan safranin akan menyebabkan warna bakteri berubah menjadi
merah karena warna biru yang dihasilkan oleh methylene blue telah luntur dengan lisisnya
membran sel sehingga safranin dapat terikat. Oleh sebab itu, gram D atau zat pewarna kedua
berfungsi sebagai pembeda terhadap zat warna kristal violet (Lay, 1994). Kemudian cuci dengan
air mengalir dan kering dianginkan, Cat ini berwarna merah. Cat ini merupakan cat sekunder atau
kontras. Cat ini berfungsi untuk memberikan warna mikroorganisme non target. Cat sekunder
mempunyai spektrum warna yang berbeda dari cat primer. Kemudian preparat dikeringkan dengan
cara diangin-anginkan lalu dilakukan pengamatan di bawah mikroskop.
Pemberian methylen blue pada bakteri gram positif akan meninggalkan warna biru.
Perbedaan respon terhadap mekanis pewarnaan gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur
dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung protein dan gram negative
mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis. Pemberian alkohol
(etanol) pada praktikum pewarnaan bakteri, menyebabkan terekstraksi lipid sehingga
memperbesar permeabilitas dinding sel. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan
 sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri gram positif
dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori pori mengkerut, daya rembes dinding
sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna
biru.
Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding
selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme
gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan
pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran tunggal
yang dilapisi peptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negative lapisan
peptidoglikogennya tipis (1-3 nm).
Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna ,
substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Suatu preparat yang sudah
meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka semua zat warna terhapus.
sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer. Bakteri-bakteri seperti ini
dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies
(Dwidjoseputro, 1994).
Berdasarkan hasil pengamatan di bawah mikroskop, diidentifikasi bakteri
jenis Bacillus sp. merupakan bakteri berbentuk batang (basil), dan tergolong dalam bakteri gram
positif.
I. Kesimpulan

Berdasarkan percobaan yang dilakukan, maka dapat ditarik kesimpulan sebagai berikut :
1. Pewarnaan gram merupakan pewarnaan difrensial karena dapat digunakan untuk membedakan
antara bakteri gram negatif dan gram positif. Pewarnaan ini sering digunakan untuk identifikasi
dan klasifikasi bakteri. Komposisi dinding sel bakteri gram positif berbeda dengan bakteri gram
negatif sehingga hasil pewarnaan gram akan berbeda.
2. Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan warna methylene blue sewaktu proses
pewarnaan gram. Bakteri ini mempunyai lapisan peptidoglikan yang tebal.
3. Bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan warna methylene blue sewaktu
prose pewarnaan gram. Bakteri ini mempunyai lapisan peptidoglikan yang tipis.
4. Berdasarkan hasil pengamatan dapat diidentifikasi bahwa bakteriBacillus sp. merupakan bakteri
berbentuk batang (basil), dan tergolong dalam bakteri gram positif .
J. Daftar Pustaka
Cappuccino, J., G., & Natalie., S, 1983, Microbiology A Laboratory Manual, Addison-
Wesley Publishing Company : New York.
Dwidjoseputro. 1994. Mikrobiologi untuk Universitas. Ganesha Expect. Bandung.
Gozali, Amir, 2009, Pewarnaan Gram, http://www.gozali.blogspot.com/ gram/pewarnaan
gram-prinsip.html . Diakses pada tanggal 14 April 2012.
 Lay, B.W, 1994, Analisis Mikroba di Laboratorium, PT Raja Grafindo Persada : Jakarta.
Madigan, M.T, 2003, Brock Biology of Microorganism, Pearson Education : inc. United
State of America.
Pelczar, M. J., Chan, E.C.S, 2007, Elements of Microbiology. Mc Graw Hill Book
Company: New York.
Razali, U., 1987, Mikrobiologi Dasar, Jatinangor: FMIPA UNPAD.
Suriawiria, U. 1999. Mikrobiologi. Jakarta : Universitas Terbuka.
Sutedjo, M., 1991, Mikrobiologi Tanah, Rineka Cipta. Jakarta.
Tracy,2005, GramStaining, www.tracy.k12.ca.us/ thsadvbio/ pdfs/ gram%20stain.pdf,
Diakses pada tanggal 18 April 2014.
Umsl, 2008, StainingBacteria, www.umsl.edu /~microbes/pdf/ stainingbacteria.pdf,
Diakses pada tanggal 18 April 2014.
Volk & Wheeler, 1993, Mikrobiologi Dasar. Penerbit Erlangga : Jakarta
Waluyo. 2004. Mikrobiologi Tanah. Jakarta : CV Rajawali.
Waluyo, L. 2007. Mikrobiologi Umum. Malang : UMM Press.