Teori dasar

Protein terdapat di semua jaringan sel hidup, baik pada tanaman maupun hewan.
Setelah air, protein merupakan komponen yang terbesar dalam tubuh manusia. Seperenam
berat manusia terdiri atas protein. Sepertiga dari jumlah tersebut terdapat pada otot, seperlima
bagian terdapat pada tulang dan tulang rawan, seper sepuluh terdapat pada kulit dan sisanya
terdapat pada organ lain serta cairan tubuh. Pada umumnya, protein diperlukan tubuh untuk:
a. Pertumbuhan dan pengembangan tubuh.
b. Perbaikan dan pergantian sel-sel jaringan tubuh yang rusak.
c. Produksi enzim pencernaan dan enzim metabolisme.
d. Bagian yang terpenting dari hormon-hormon tertentu seperti tiroksin dan insulin (Winarno,
1993).

Banyak metode yang digunakan untuk fraksinasi protein terutama berdasarkan ukuran
molekul dari protein. Sebagai contoh, protein yang diangkat dari larutan dengan menambahkan
garam, proses dari ukuran molekul protein yang lebih besar ke ukuran yang lebih kecil.
Peristiwa pemisahan atau pengendapan protein oleh garam berkonsentrasi tinggi disebut
"salting out". Metode "salting out" ini mungkin bergantung pada fenomena fisik, dua
fenomena tersebut yang penting di antaranya adalah penghentian dari daya tarik dari
permukaan protein oleh ion garam dan perpindahan air dari sekitar molekul protein oleh
kompetisi dari ion dari garam dengan air (Cantarow and Schepartz, 1963).

Salting out merupakan metode yang digunakan untuk memisahkan protein yang didasarkan
pada prinsip bahwa protein kurang terlarut ketika berada pada daerah yang konsentrasi kadar
garamnya tinggi. Konsentrasi garam diibutuhkan oleh protein untuk mempercepat keluarnya
larutan yang berbeda dari protein satu ke protein yang lainnya (Mayes dkk, 1990).

Pengendapan protein dengan garam dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu pH, temperatur,
konsentrasi protein, dan garam yang digunakan. Konsentrasi protein merupakan faktor
terpenting dalam scaling-up karena pemurnian skala besar memberikan hasil yang lebih banyak
dibanding skala laboratorium (Walker dkk., 1988). Pengendapan protein dalam ekstrak sel dan
jaringan dapat dilakukan dengan penambahan reagen, diantaranya:
1). Amonium sulfat
Amonium sulfat merupakan garam yang umum digunakan dalam pengendapan protein secara
salting out karena memiliki kelarutan yang tinggi, tidak toksik, dan murah (Walker dkk., 1988).
2). Pelarut organik
Penambahan pelarut organik dalam larutan encer akan mengurangi kelarutan protein dengan
mengurangi konstata dieletrika dalam medium. Pelarut organik yang dapat digunakan untuk
mengendapkan protein yaitu etanol, aseton, propan-2-ol. Protein mudah didenaturasi oleh
pelarut organik, maka dalam pengerjaannya dilakukan pada temperatur 00C. Pelarut organik
mudah terbakar, mahal dan memiliki selektifitas rendah karenanya jarang digunakan untuk
pemurnian enzim dalam skala besar (Walker dkk., 1988).
3). Polimer BM Tinggi
Organik lain juga dapat digunakan untuk pemurnian protein yaitu polietilenglikol. Senyawa ini
tidak toksik, tidak mudah terbakar dan tidak mendenaturasi protein (Walker dkk., 1988).

Sel mengandung ratusan hingga ribuan jenis protein. Fraksinasi terhadap protein dapat
dilakukan untuk memperoleh preparat protein murni tertentu sebelum ditentukan komposisi
dan deret asam amino penyusunnya (Lehninger, 1982). Protein dapat dimurnikan berdasarkan
ukuran, daya larut, dan afinitas pengikatan (Stryer, 2000). Pemisahan dan pemurnian protein
dapat dilakukan dengan cara:
a. Dialisis
Protein dapat dipisahkan dari senyawa dengan berat molekul rendah yang ada di dalam ekstrak
sel atau jaringan dengan proses dialisis. Molekul besar seperti protein ditahan di dalam kantong
terbuat dari senyawa berpori amat halus, seperti selopan. Jadi, jika kantong yang mengandung
ekstrak sel atau jaringan dimasukkan ke dalam air, molekul kecil di dalam ekstrak jaringan,
seperti garam, akan melalui pori-pori, tetapi protein dengan berat molekul tinggi akan tertahan
di dalam kantong (Lehninger, 1982).
b. Elektroforesis
Protein dapat juga dipisahkan satu dari yang lain oleh elektroforesis berdasarkan tanda dan
jumlah muatan listrik pada gugus R dan gugus termal asam amino dan terminal karboksil yang
bermuatan. Seperti peptida sederhana, rantai polipeptida protein mempunyai titik isoelektrik
yang khas, yang akan mencerminkan jumlah relatif gugus R asam dan basa (Lehninger, 1982).
Kecepatan migrasi protein dalam medan listrik tergantung pada kekuatan medan listrik, muatan
protein, dan koefisian pergesekan (Stryer, 2000).

Protein merupakan suatu zat yang sangat diperlukan oleh tubuh kita sebagai sumber
energi untuk dapat melakukan aktivitas sehari-hari. Sehingga kita perlu mengetahui dan
menentukan kadar protein di dalam tubuh kita. Penentuan kadar protein tersebut dapat
dilakukan dengan berbagai cara yang salah satuya adalah metode Bradford. Metode lain dalam
menentukan kadar protein yang biasa digunakan adalah metode Lowry.

Metode Bradford ialah suatu metode yang dapat digunakan untuk menganalisis
kandungan protein di dalam suatu larutan dengan menggunakan zat warna Coomassie Blue G-
250 sebagai pengikat protein. (Bradford 1976) Zat warna tersebut akan mengikat protein
dan mengubah warna pada larutan yang mengandung protein tersebut dari warna kemerahan
menjadi warna kebiruan. Ikatan yang terjadi antara zat warna Coomassie Blue G-250 dan
protein dapat terjadi dikarenakan adanya gaya van der walls antara keduanya. Gaya
van der walls dapat terjadi karena adanya bagian protein yang bersifat hidrofobik
mengikat bagian dari zat warna Coomassie Blue G-250( penyusun reagen Bradford) yang
bersifat non polar sehingga mengakibatkan zat warna tersebut melepaskan elektronnya
ke bagian hidrofobik protein. Selain itu, antara zat warna dan protein juga terdapat
kekuatan ionik yang memperkuat ikatan antara keduanya dan membuat zat warna
tersebut menjadi stabil. Hal ini lah yang digunakan pada metode Bradford untuk
menentukan kadar protein di dalam suatu larutan. Kandungan protein yang berikatan
dengan zat warna tersebut dapat diukur dengan menggunakan instrument spectronic 20
D untuk mengukur nilai absorbansnya pada panjang gelombang kisaran 465-595 nm.
Selanjutnya, nilai absorbans tersebut dapat digunakan untuk membuat kurva standar
yang menjadi dasar penentuan konsentrasi dan kadar protein di dalam larutan.
(Bradford 1976)

Panjang gelombang yang digunakan untuk mengukur nilai absorbans larutan yang
mengandung protein berkisar antara 470-650. Hal itu dikarenakan metode Bradford bergantung
pada kerja zat warna Coomassie Blue G-250 yang memiliki empat formasi ion yang
berbeda-beda dengan nilai pKa 1,15 ; 1,82 ; dan 12,4. Zat warna yang digunakan pada
metode Bradford ini dapat dalam bentuk anion dan kation.Bentuk kation zat warna ini
ialah dye commassie yang berwarna merah dan hijau dengan nilai absorbansi maksimum
berada pada panjang gelombang kisaran 470 nm hingga 650 nm.Bentuk anion zat warna ini
ialah commasie yang berwarna biru dengan nilai absorbansi maksimum berada pada panjang
gelombang maksimum 595 nm. Penentuan kadar protein pada suatu larutan dilakukan dengan
menentukan jumlah zat warna dalam bentuk anion (commasie blue G-250) yang diukur dengan
panjang gelombang 595 nm.(Bradford 1976)
Tingkat ketelitian metode Bradford dlam menentukan kadar protein cukup tinggi karena
koefisien penghentian dari kompleks albumin larutan standar BSA adalah konstan selama
rentang konsentrasi flip-10. Nilai presisi dan akurasi data dari metode Bradford cukup tinggi
dalam hal penentuan kadar protein ataupun sampel lain. Metode Bradford sangat sederhana,
cepat dan teliti serta dapat dilakukan pengujian ulang untuk sampel lain yang berada di luar
jangkauan. Oleh karena itu metode Bradford sangat dianjurkan untuk mendeteksi suatu
molekul selular seperti protein. Metode ini menentukan kadar protein bukan dari ikatan
peptidanya namun metode ini mendeteksi suatu asam amino spesifik yang berada di dalam
protein tersebut dan berikatan dengan zat warnanya.( Stoscheck 1990)

Pembahasan

Langkah pertama dalam pemurnian protein tertentu kebanyakan dilakukan dengan

teknik pengendapan. Teknik ini terutama ditujukan untuk memisahkan protein dari senyawaan
bukan protein yang terlarut. Protein dapat diendapkan dengan penambahan garam (salting out),
pengaturan pH, pengaturan suhu dan penambahan pelarut organic seperti alcohol atau aseton.
Namun beberapa jenis protein tidak dapat diendapkan dengan garam, bahkan penambahan
garam akan mempertinggi kelarutannya (salting in). sifat protein seperti ini dapat juga
digunakan untuk pemurnian protein tersebut. Sentrifugasi banyak digunakan untuk
mempercepat pengendapan protein (Tim Penyusun, 2009).

Pada percobaan ini dilakukan isolasi dan pemurnian α-Lactalbumin dari telur bebek.
Mula-mula putih telur dipisahkan dari kuningnya. Lalu 10 mL protein (putih telur)
ditambahkan dengan ammonium sulfat dalam gelas kimia lalu dimasukkan ke dalam tabung
valcon. Protein kurang terlarut pada daerah yang konsentrasi kadar garamnya tinggi.
Konsentrasi garam dibutuhkan untuk mempercepat keluarnya larutan yang berbeda dari protein
atau dengan kata lain untuk memisahkan protein dari senyawa bukan protein yang terkandung
dalam putih telur.

Pada uji pengendapan dengan garam, larutan protein dijenuhkan hingga keruh menggunakan
(NH4)2SO4. penambahan garam tersebut maka akan terbentuk endapan. Hal ini sesuai menurut
Stryer. Menurut Stryer Daya larut kebanyakan protein dalam larutan garam dengan konsentrasi
tinggi menjadi rendah. Efek ini dikenal dengan salting out (Stryer, 2000). Hubungan daya larut
protein dengan kadar garam berbeda antara satu protein dengan protein lainnya. Sehingga cara
salting out ini dapat digunakan untuk fraksinsai protein. Salting out juga dapat digunakan untuk
memekatkan larutan encer protein

Pengaruh penambahan garam terhadap kelarutan protein berbeda-beda, tergantung pada

konsentrasi dan jumlah muatan ionnya dalam larutan. Semakin tinggi konsentrasi dan jumlah
muatan ionnya, semakin efektif garam dalam mengendapkan protein (Yazid dan Nursanti,
2006).

Kelarutan protein akan berkurang bila ke dalam larutan protein ditambahkan garam-garam
anorganik, akibatnya protein akan terpisah sebagai endapan. Peristiwa pemisahan protein ini
disebut salting out. Bila garam netral yang ditambahkan berkonsentrasi tinggi, maka protein
akan mengendap. Pengendapan terus terjadi karena kemampuan ion garam untuk menghidrasi,
sehingga terjadi kompetisi antara garam anorganik dengan molekul protein untuk mengikat air.
Karena garam anorganik lebih menarik air maka jumlah air yang tersedia untuk molekul protein
akan berkurang (Winarno, 2002). Larutan albumin dalam air dapat diendapkan dengan
penambahan amoniumsulfat ((NH4)2SO4) hingga jenuh (Poedjiadi, 1994).

Kegunaan dari ammonium sulfat untuk pemisahan protein adalah untuk mempercepat dalam
menghubungkan klasifikasi dari albumin dan globulin. Sodium sulfat lebih sesuai untuk
pemisahan analitik dari plasma protein (Cantarow and Schepartz, 1963).

Kemudian larutan dimasukkan ke dalam sentrifugasi,dilakukan sentrifugasi karena untuk

mempercepat pemisahan protein dan juga sebagai medium pengendap protein dalam elu r.

Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul
dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di
dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. Teknik sentrifugasi tersebut
dilakukan di dalam sebuah mesin yang bernama mesin sentrifugasi dengan kecepatan yang
bervariasi, contohnya 2500 rpm (rotation per minute) atau 3000 rpm (Holme and Peck, 1993).

Setelah sentrifuse maka didapatkan supernatant dan endapannya. Pada supernatant ditambahk
an garam amonium dikarenakan dalam supernatan dimungkinkan masih terdepan protein yang
terdispersi.sedangkan pada endapan dilarutkan dengan penambahan 5 mL larutan buffer Tris
ph 7.
Dari proses saling out, terdapat adanya sisa-sia garam yang tercampur pada protein. Oleh
karena itu perlu dilakukan pemurnian protein. Salah satu caranya adalah dengan dialisis.
Pemurnian enzim tidak menghendaki adanya kelebihan garam, oleh karena itu garam yang
tersisa dari proses pengendapan dipisahkan dengan cara dialisis.

Dialisis adalah proses pemindahan molekul terlarut dari suatu campuran larutan yang terjadi
akibat difusi pada membran semi-permeabel. Molekul terlarut yang berukuran lebih kecil dari
pori-pori membran tersebut dapat keluar, sedangkan molekul lainnya yang lebih besar akan
tertahan di dalam kantung membran. Selulosa adalah salah satu jenis materi penyusun
membran dialisis yang cukup umum dipakai karena bersifat inert untuk berbagai jenis senyawa
atau molekul yang akan dipisahkan. Dalam percobaan ini, dialisis digunakan untuk
menghilangkan molekul garam (ammonium sulfat), sebelum dilanjutkan dalam pada tahap
akhir pemurnian. Dialissis dilakukan dengan menggunakan buffer tiris pH 7 selama 2 jam.

Proses dialisis ini terjadi karena konsentrasi garam lebih tinggi di dalam membran dialisis
daripada di luar membran, sehingga menyebabkan larutan penyangga atau ia masuk ke dalam
dialisat. Hal ini terjadi pada awal proses dialisis. Selanjutnya garam akan keluar melalui
membran hingga tercapai kondisi keseimbangan. Tetapi setelah proses dialisis kadang terjadi
penurunan aktivitas enzim yang kemungkinan disebabkan oleh hilangnya ion penting yang
dapat berfungsi mengaktifkan enzim atau disebut sebagai kofaktor.

Mula-mula setiap fraksi 20%, 50%, dan 70% dimasukkan ke dalam tabung selofan yang telah
direndam dengan larutan buufer tiris ph 7. Fungsi perendaman adalah untuk memudahkan
membuka tabung selofannya.

Dalam pengamatan, tempat perbedaan pengendapan dari setiap fraksinya, hal ini dikarenakan
dalam sampel putih telur terdapat beberapa senyawa protein yang memiliki titik isoelektrik
yang berbeda sehinggaterdapat senyawa protein yang mengendap hanya saat konsentrasi garam
amonium sulfat yang ditambahkan mencapai 20%, 50% dan 70%. Perbedaan kelarutan protein
bergantung kepada kehidrofobikan dari mutan dan permukaan protein. Karena protein
merupakan polimer dari asam amino, maka kehidrofobikan protein ditentukan oleh gugus
samping (gugus R) residu asam amino; jika protein sebagian besar terdiri dari asam amino
dengan gugus R Noya hidrofobik makaprotein yang terbentuk memiliki sifat hidrofobik yang
besar. Proses dengan kelarutan yang lebih kecil mengindikasikan permukaan protein dengan
hidrofobilitas yang besar, sedangkan protein dengan hidrofobilitas yang kecil akan larut dalam
pelarut Polar.

Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan metode Bradford dapat mendeteksi adanya kadar
protein dengan menggunakan kurva standar hubungan antara absorbansi dan konsentrasi
larutan sampel. Absorbansi maksimum ntuk larutan asam pewarna Coomassie Blue G-250
berada pada panjang gelombang kisaran 470 hingga 595 nm.Zat warna Coomassie Blue
G-250 ini memiliki dua bentuk yaitu anion dan kation.Kation ialah zat warna merah
Coomassiedab anion ialah zat warna biru Coomassie blue. Metode Bradford ini memiliki
reagen khusus yaitu reagen Bradford. Reagen ini tersusun atas larutan 200 mikro
Coomassie Brilliant Blue G-250 yang diambil dari larutan BSA 5000 mikro. Lalu ditambahkan
800 mikro buffer tiris pH 7. (5 kali pengenceran) sampai campuran menjadi campuran 1 mg/L
kemudian liat di jurnal aja ya hehe.

Metode Bradford yang digunakan untuk menentukan kadar protein pada suatu larutan
bergantung pada kurva standar yang dihasilkan dari absorbansi dan konsentrasi larutan yang
mengandung protein tersebut. Prinsip dasar dari metode Bradford ini ialah pengikatan
warnaCoomassie Blue G-250 (komponen penyusun reagen Bradford) oleh protein.
Keuntungan dari metode ini adalah pereaksi yang digunakan sangat sederhana serta mudah
disiapkan.Selain itu kompleks warna biru pada larutan yang diberi reagen Bradford sangat
cepat terbentuk dan bersifat stabil. Kestabilan warna biru coomassieini karena adanya inteaksi
antara lapisan hidrofobik dari protein dengan bentuk anion dari zat warna Coomassie Brilliant
Blue G-250 yang menstabilkan bentuk anion tersebut (adanya gaya van der walls). (Bradford
1976)Selain itu, uji Bradford juga sangat menguntungkan karena nilai akurasi dan presisi data
yang didapatkan cukup tinggi serta untuk menjamin keakuratan data sampel yang berada di
luar jangkauan dapat dilakukan uji ulang yang hanya membutuhkan beberapa menit saja.Hal
itu membuat keefektifan kerja sangat cepat.

Kelemahan utama metode Bradford adalah reagen khususnya dapat mengakibatkan perbedaan
respon tes untuk jenisprotein yang berbeda. Hal itu membuat kita harus teliti dalam memilih
protein yang akan di ujikan. Sebaiknya protein yang akan diuji ialah protein yang memberikan
nilai absorbansi mendekati konsentrasi sampel protein yang diujikan. uji ini kurang akurat
untuk asam protein dasar.Selain itu kelemahan lainnya ialah kurangnya sensitivitasterhadap
sampel yang hanya memiliki sedikit kandungan protein.(Bradford 1976)
Larutan Bovine Serum Albumin (BSA) merupakan larutan standar yang digunakan untuk
menentukan kadar protein dengan metode Bradford (Keenan 1992)

Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan, praktikan menggunakan kurva standar yang
digunakan untuk menentukan konsentrasi sampel yang nilai absorbansinya telah diketahui.
Kurva standar tersebut ialah kurva hubungan antara konsentrasi larutan Bovine Serum Albumin
(BSA) dengan nilai absorbansinya yang ditentukan pada panjang gelombang 595 nm. Hal itu
dikarenakan zat warna yang diikat oleh bagian hidrofobik protein ialah bentuk anionnya yang
nilai absorbansi maksimumnya berada pada panjang gelombang terebut. (Bradford 1976)

Ceritaiin hasil absorbansi yang di jurnal...

Bedasarkan hasil percobaan pada BSA yang kedua absorbansinya menurun dari 0,055 menjadi
0,032, seharusnya semakin sedikit buufer tiris yang ditambahkan maka nilai absorbansinya
meningkat. Hal ini mungkin dikarenakan kurang kocok sehingga larutan kurang homogen dan
mengakibatkan nilai absorbansinya menjadi menurun.

Yang merah kata-kata sendiri

Persamaan garis yang diperoleh dari kurva standar yang menghubungkan antara nilai
absorbansi dengan konsentrasi larutan Bovine Serum Albumin (BSA) adalah Y=
0.003+0.873xdengan % r2 sebesar 95,92 %. Ketepatan data dapat dilihat dari nilai % r2 yang
diperoleh. Hal tersebut dapat terjadi karena adanya kesalahan selama percobaan.Kesalahan
tersebut seperti pada saat menambahkan larutan BSA dan larutan NaCl serta reagen Bradford
terjadi tumpahnya larutan campuran tersebut saat mengocok agar larutan homogen dapat
mengurangi jumlah protein di dalam larutan serta kesalahan pengkalibrasian
spektrofotometer.Nilai absorbansi sampel ulangan pertama adalah sebesar0,311 dengan nilai
konsentrasi sampel sebesar 0,3528 mg/mL. Nilai absorban sampel ulangan kedua adalah
sebesar 0,353 dengan nilai konsetrasi sampel sebesar 0,4009 mg/mL

http://alipart.blogspot.co.id/2011/05/protein-dan-asam-amino.html