Uji In-Vivo Serbuk dan Isolat Flavonoid Dari Biji Pepaya (Carica papaya
L.) dalam Menurunkan Kadar Lemak Darah
Oleh
Cholifatuzaroh
NIM 140332601972
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Obesitas menjadi salah satu ancaman terbesar bagi kesehatan global di abad ini,
dengan lebih dari 1,5 miliar orang dewasa kelebihan berat badan dan setidaknya 400 juta
subjek obesitas klinis (Drew et al., 2007). Perkembangan obesitas ditandai dengan
ketidakseimbangan kronis antara asupan energi dan pengeluaran energi ( Schrauwen et al.,
2000), dan ini sering dianggap berasal dari perubahan gaya hidup dan kebiasaan makan yang
tidak memadai. Juga, penurunan pengeluaran energi sering dikaitkan dengan tingkat
metabolisme basal rendah yang diwariskan, aktivitas fisik, dan kapasitas rendah untuk
oksidasi lemak (Little et al., 2007). Untuk mengurangi berat badan dan adipositas, perubahan
kebiasaan gaya hidup masih menjadi landasan penting ( Schrauwen et al., 2000).
Lim et al., (2013) menunjukan bahwa ekstrak Artemisia capillaris yang diujikan pada
mencit obesitas yang diinduksi dengan pakan tinggi lemak dapat memperbaiki dislipidemia
pada mencit dengan cara mempercepat katabolisme lemak. Oleh karena itu pengujian In-Vivo
dilakukan untuk mengetahui efektivitas dari senyawa flavonoid dari biji pepaya dalam
menurunkan kadar lemak dalam darah. Dipilih tikus putih sebagai hewan coba karena tikus
merupakan hewan yang mewakili kelas mamalia, termasuk manusia, sehingga kelengkapan
organ, kebutuhan nutrisi, metabolisme biokimia, sistem reproduksi, pernafasan, peredaran
darah serta sistem ekskresi menyerupai manusia (Smith, 1988). Disamping itu tikus putih
juga relatif murah dan mudah untuk digunakan sebagai hewan coba.
Berdasakan ulasan diatas, penelitian dengan judul “ Uji In-Vivo Serbuk dan Isolat
dari Biji Pepaya (Carica papaya L.) dalam Menurunkan Kadar Lemak Darah” penting
untuk dilakukan.
B. Tujuan Penelitian
1. Menentukan struktur isolat flavonoid dari biji pepaya (Carica papaya L.) yang aktif
sebagai inhibitor lipase pankreas berdasarkan profil spektrum UV-Vis, FT-IR dan LC-
MS.
2. Menentukan daya inhibisi isolat flavonoid biji pepaya (Carica papaya L.) relatif
terhadap orlistat.
3. Menentukan kemampuan flavonoid dalam menurunkan lemak di dalam darah secara
In-Vivo.
C. Manfaat penelitian
1. Bagi Peneliti
memperoleh wawasan dalam bidang biokimia khususnya mengenai salah satu jenis
senyawa flavonoid pada biji pepaya yang berpotensi sebagai inhibitor lipase pankreas
dan aktivitas secara In-Vivo dari isolat flavonoid biji pepaya sebagai penurun kadar
lemak darah.
2. Bagi Masyarakat
Memberikan informasi tentang manfaat biji pepaya sebagai penurun kadar lemak di
dalam tubuh. Sehingga dapat dimanfaatkan dengan baik oleh masyarakat.
3. Bagi Perkembangan IPTEK
Memberikan bahan referensi tambahan untuk penelitian selanjutnya dalam
pengembangan ilmu pengetahuan khususnya dalam bidang biokimia yang berkaitan
dengan penentuan aktivitas secara In-Vivo dari isolat flavonoid biji pepaya.
TINJAUAN PUSTAKA
A. Obesitas
Obesitas menjadi salah satu ancaman terbesar bagi kesehatan global di abad ini,
dengan lebih dari 1,5 miliar orang dewasa kelebihan berat badan dan setidaknya 400 juta
subjek obesitas klinis (Drew et al., 2007). Karena tingkat obesitas yang meningkat, World
Health Organization (WHO) telah diminta mempertimbangkannya sebagai epidemi abad
21dan mengembangkan strategi untuk mencegah dan mengontrol kemajuannya (Brug et
al.,2009).
Penderita obesitas akan melakukan berbagai cara untuk menurunkan berat badan,
beberapa diantaranya mengubah gaya hidup dan mengatur pola makan, sebagian penderita
juga mengkonsumsi obat penurun berat badan. Menurut Tsuji et al., (2001) pada dasarnya,
ada dua jenis agen anti obesitas, yang tergolong sebagai inhibitor lipid (lipase inhibitor) dan
absorbsi karbohidrat (α-glukosidase inhibitor). Lipase pankreas memainkan peran kunci
untuk penyerapan trigliserida di usus kecil. Enzim ini, yang dikeluarkan dari pankreas ke
dalam usus, menghidrolisis trigliserida menjadi asam lemak (Voshol et al., 2007). Salah satu
obat penurun berat badan adalah Orlistat (Xenical) . Tetrahydrolipstatin (Orlistat), diisolasi
dari actinomycetes (Streptomyces toxytricini), yang bekerja sebagai penghambat lipase
pankreas (Weibel et al., 1987 di Mukherjee dan Sengupta, 2013).Obat ini menghambat
gastrointestinal dan lipase pankreas yang mampu mencegah penyerapan sekitar 30% lemak
makanan (Guerciolini, 1997).
Carica papaya Linn merupakan famili dari Caricaceae umumnya dikenal sebagai
pepaya di Indonesia. Tanaman ini berasal dari Amerika tropis dan diperkenalkan ke India
pada abad ke 16. Tanaman ini dikenal memiliki batang yang lunak dan biasanya tidak
bercabang, dipenuhi oleh daun besar dan panjang, tumbuh dengan cepat dan dapat tumbuh
tinggi hingga 20m. Secara tradisional daunnya dapat digunakan untuk pengobatan berbagai
penyakit, seperti pengobatan malaria, demam berdarah, penyakit kuning dan aktivitas
antivirus. (Anjum et al., 2013)
Beberapa penelitian menunjukkan biji pepaya memiliki potensi sebagai obat karena
meiliki aktivitas antimikroba untuk melawan Trichomonas vaginalis dan beberapa bakteri
pantogen seperti Bacillus subtilis, Enterobacter cloacae, Escherichia coli, salmonella typhi,
Staphylococcus aureus, Proteus, vulgaris, Pseudomonas aeruginosa dan Klebsiella
pneumoniae ( Osato et al., 1993; Krishna et al., 2008).
Berdasarkan analisis fitokimia pada biji pepaya yang diuji di laboratorium Kimia
Universitas Muhammadiyah Malang, Jawa Timur menggunakan sampel biji pepaya dan jus
biji pepaya didapatkan bahwa biji pepaya mengandung flavonoid, saponin dan tanin.
Tabel 2.1 Kandungan zat fitokimia dalam 100 gram biji pepaya. Sumber (Meirindasari, 2013)
Kandungan fitokimia berupa flavonoid, tanin dan saponin yang terdapat dalam biji pepaya
tersebut berpengaruh dalam menurunkan kadar kolesterol LDL pada dislipidemia yaitu
abnormalitas profil lipid dalam darah. Dalam penelitian ini biji pepaya akan digunakan
sebagai inhibitor lipase pankreas alami untuk menurunkan kadar lemak darah.
C. Flavonoid
Flavonoid merupakan salah satu kelompok senyawa metabolit sekunder yang paling
banyak ditemukan di dalam jaringan tanaman (Rajalakshmi dan S. Narasimhan, 1985).
Flavonoid termasuk dalam golongan senyawa phenolik dengan struktur kimia C6-C3-C6
(White dan Y. Xing, 1951; Madhavi et al., 1985; Maslarova, 2001). Flavonoid mempunyai
kerangka dasar karbon yang terdiri dari 15 atom karbon, dimana dua cincin benzene (C6) terikat
pada suatu rantai propan (C3) sehingga membentuk suatu susunan C6-C3-C6.
Sebagian besar flavonoid alam ditemukan dalam bentuk glikosida dimana unit
flavonoid alam ditemukan dalam bentuk glikosida diimana unit flavonoid terikat pada satu
gula. Glikosida adalah kombinasi antara suatu gula dan suatu alkohol yang saling berikatan
melalui ikatan glikosida (Lenny, 2006). Adanya gula yang terikat pada flavonoid cenderung
menyebabkan flavonoid lebih mudah larut dalam air dan dengan demikian campuran pelarut
dengan air merupakan pelarut yang baik untuk glikosida seperti etanol, metanol, butanol,
aseton, dimetil sulfoksida, dimetilformamida dan air. Sebaliknya, aglikon flavonoid(yaitu
flavonoid tanpa gula terikat) yang kurang polar seperti isoflavon, flavanon, dan flavon serta
flavonol yang termetoksilasi cenderung lebih mudah larut dalam pelarut seperti eter dan
kloroform (Markham, 1988).
Cho et al., (2016) mengatakan 6 subgrup utama dari flavonoid, yaitu flavonol,
flavanol, flavans-3-ol dan antosianin masing-masing memiliki peran dalam pengobatan,
pencegahan dan pengurangan berbagai penyakit degeneratif seperti penyakit jantung, kanker,
diabetes. Flavonoid dapat berfungsi sebagai antioksidan untuk mencegah penyakit dengan
cara mengatur penekanan oksidatif di dalam tubuh. Menurut Latifah (2015) flavonoid
memiliki kemampuan sebagai antioksidan yang mampu mentransfer sebuah elektron atau
sebuah atom hidrogen ke senyawa radikal bebas dengan menghentikan tahap awal reaksi.
Oleh karena itu, flavonoid dapat menghambat peroksidasi lipid, menekan kerusakan jaringan
oleh radikal bebas dan menghambat beberapa enzim.
D. Enzim Lipase
Enzim lipase (EC.3.1.1.3) merupakan enzim yang memiliki peran penting dalam
bioteknologi modern. Lipase terkenal memiliki aktivitas yang tinggi dalam reaksi hidrolisis
dan dalam kimia sintesis. Lipase dapat berperan sebagai biokatalis untuk reaksi-reaksi
hidrolisis, esterifikasi, alkoholisis, asidolisis, dan aminolisis (Gandhi, 1997).
Lipase menghidrolisis trigliserida menjadi asam lemak bebas, gliserida parsial dan
gliserol. Trigliserida sebagai substrat terdiri dari asam lemak rantai panjang yang tidak larut
dalam air (Shahani, 1975).
Lipase pankreas adalah enzim yang diproduksi oleh sel acinar dan disekresi sebagai
fungsi eksokrin pankreas. Enzim ini merupakan suatu enzim glikoprotein yang larut dalam
air, disintesis oleh sel-sel parenkim pankreas, dan ditransfer ke permukaan luminar usus halus
untuk menghidrolisis substrat. Senyawa-senyawa trigliserida yang dapat menjadi subtrat
lipase pankreas berasal dari golongan lipid, seperti minyak dan lemak dari makanan dalam
bentuk triasilgliserol (Bishop et al., 2004).
Lipase pankreas terdiri atas His-263, Asp-176, dan Ser-152 dengan Ser-152 sebagai
sisi katalitik(Birari&bhutani 2007). Lipase pankreas bekerja pada daerah permukaan minyak
air dan titik-titik lipifd yang teremulsi secara halus dibrntuk oleh gerakan mekanis dalam usus
dengan adanya garam empedu. Semakin aktif aktivitas enzim tersebut, maka lemak dan
minyak yang dihidrolisis akan semakin banyak sehingga asam lemak bebas yang akan
dihasilkan akan semakin banyak pula (Rahardjo 2005).
Lipase biasanya diproduksi oleh pankreas babi dan sapi, ragi Candida, Aspergillus,
Rhizopus, dan Mucor sp. Dalam industri, lipase antara lain digunakan dalam industri farmasi
dan untuk menghasilkan asam lemak dari minyak tidak stabil yang biasanya mengandung
asam lemak tidak jenuh. Lipase dari Candida cylindracea digunakan untuk menghidrolisis
minya dalam pembuatan sabun. Selain bidang farmasi, lipase jga digunakan dalam industri
kosmetik, kulit, makanan, parfum dan sintesis bahan organik lain (Gandhi, 1997).
Aktivitas enzim dengan metode titimetri menurut kurnia (2010), dapat dihitung
dengan menggunakan rumus berikut:
Keterangan:
Vmt = Volume NaOH yang dibutuhkan untuk titrasi substrat minyak
Va = Volume yang dibutuhkan untuk titrasi substrat air (kontrol)
NNaOH = Normalitas NaOH yang digunakan
1000 = Faktor konversi dari mmol ke μmol
25 = waktu inkubasi (menit)
Salah satu obat anti obesitas yang saat ini banyak digunakan adalah
Tetrahydrolipstatin, diisolasi dari actinomycetes (Streptomyces toxytricini), yang
bekerja sebagai penghambat lipase pankreas dan tersedia secara komersial dengan
nama "Orlistat" (Weibel et al., 1987 di Mukherjee dan Sengupta, 2013).
a. Ekstraksi
Pengambilan bahan aktif dari suatu tanaman, dapat dilakukan dengan ekstraksi.
Dalam proses ekstraksi ini, bahan aktif akan terlarut oleh zat penyari yang sesuai sifat
kepolarannya. Metode ekstraksi dipilih berdasarkan beberapa faktor seperti sifat
bahan mentah obat, daya penyesuaian dengan tiap macam metode ekstraksi dan
kepentingan dalam memperoleh ekstrak yang sempurna atau mendekati sempurna
(Ansel, 1989).
Maserasi merupakan metode sederhana yang paling banyak digunakan. Cara ini
sesuai, baik untuk skala kecil maupun skala industri (Agoes, 2007). Metode ini
dilakukan dengan memasukkan serbuk tanaman dan pelarut yang sesuai ke dalam
wadah inert yang tertutup rapat pada suhu kamar. Proses ekstraksi dihentikan ketika
tercapai kesetimbangan antara konsentrasi senyawa dalam pelarut dengan konsentrasi
dalam sel tanaman. kerugian utama dari metode maserasi ini adalah memakan banyak
waktu, pelarut yang digunakan cukup banyak, dan besar kemungkinan beberapa
senyawa hilang. Selain itu, beberapa senyawa mungkin saja sulit diekstraksi pada
suhu kamar. Namun disisi lain, metode maserasi dapat menghindaro rusaknya
senyawa-senywa yang bersifat termolabil.
Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dapat digunakan untuk tujuan analitik dan preparatif.
Kromatografi Lapis Tipis (KLT) analitik digunakan untuk menganalisa senyawa-
senyawa organik dalam jumlah kecil misalnya, menentukan jumlah komponen dalam
campuran dan menentukan pelarut yang tepat untuk pemisahan dengan KLT
preparatif. Sedangkan KLT preparatif digunakan untuk memisahkan campuran
senyawa dari sampel dalam jumlah besar berdasarkan fraksinya, yang selanjutnya
fraksi-fraksi tersebut dikumpulkan dan digunakan untuk analisa berikutnya
(Sastrohamidjojo, 2007).
Fasa diam dalam KLT berupa silika gel (biasanya berupa plat silika gel F254) yang
mampu mengikat senyawa yang akan dipisahkan. Sedangkan fasa geraknya berupa
berbagai macam pelarut atau campuran pelarut. Proses pengembangan/elusi ialah
proses pemisahan campuran cuplikan akibat pelarut pengembang merambat naik
dalam lapisan fase diam. Jarak hasil pemisahan senyawa pada kromatogram biasanya
dinyatakan atau harga Rf. KLT dapat digunakan untuk perhitungan kualitatif dengan
pengujian sampel dengan menggunakan harga Rf dimana harga Rf dinyatakan dengan
(Sastrohamidjojo, 2007):
a. Spektrofotometer UV-Vis
Radiasi infrared (IR) merupakan bagian dari spektrum elektromagnetik antara daerah
gelombang cahaya tampak dan gelombang microwave. Penggunaan terbesar terhadap
kimia organik adalah panjang gelombang 400-400 cm-1. Frekuesi radiasi IR kurang
dari 100cm-1 diabsorbsi dan diubah oleh molekul organik menjadi energi rotasi
molekul, serapan ini diukur. Radiasi IR dalam daerah panjang gelombang 10000-100
cm-1 diabsobsi dan diubah oleh sebuah molekul organik ke dalam energi vibrasi
molekul, serapan ini juga dihitung. Absorbsi frekuensi atau panjang gelombang
tergantung pada massa relatif atom, gaya konstan ikatan dan geometri atom
(Silverstain, 1998).
G. Uji In-Vivo
Pengujian In-Vivo diperlukan untuk mengetahui respon dari suatu senyawa yang
diberikan kepada hewan uji melalui gejala, dampak dan akibat yang terjadi pada tubuh hewan
percobaan. Jenis pengujian ini untuk menjelaskan pengaruh dari variable eksperimen pada
suatu organ, jaringan, sel, komponen sel, protein dan atau biomolekul dengan asumsi semua
jaringan, sel-sel penyusun tubuh, serta enzim-enzim yang ada didalam tubuh hewan
percobaan tersebut memiliki kesamaan dengan manusia. Umumnya hewan percobaan yang
digunakan adalah mencit, mencit dibuat dalam kondisi obesitas dengan pemberian pakan
tinggi kalori. Kemudian mencit dikelompokkan menjadi tiga kelompok, terdiri atas:
kelompok mencit yang diberi pakan standar, kelompok mencit yang selain diberi pakan
standar diberi tambahan Orlistat, dan kelompok mencit yang selain diberi pakan standar
diberi tambahan isolat senyawa, perlakuan dilakukan selama 30 hari. Pada hari ke 31
dilakukan pengambilan darah terhadap mencit yang sebelumnya dipuasakan selama 1 hari,
kemudian darah mencit dianalisis meliputi kolesterol total, HDL, trigliserida dan LDL.
(Resti, 2017)
BAB III
METODOLOGI PENELITIAN
A. Rancangan Penelitian
Penelitian ini terdiri dari 4 tahap yaitu: 1) isolasi senyawa flavonoid, 2) identifikasi
senyawa flavonoid, 3) pengujian senyawa flavonoid secara In-Vitro dan 4) pengujian
senyawa flavonoid secara In-Vivo. Isolasi senyawa flavonoid dilakukan dengan: preparasi
sampel, ekstraksi dengan metode maerasi menggunakan pelarut etanol-air, uji aktivitas
inhibisi lipase serta analisis kromatografi lapis tipis. Identifikasi senyawa flavonoid dilakukan
dengan cara uji fitokimia dan analisis menggunakan spektrofotometer UV-Vis dan FT-IR.
Pengujian In-Vivo dilakukan dengan cara memasukkan dosis tertentu senyawa flavonoid ke
hewan percobaan yaitu mencit untuk mengetahui efek penurunan kadar lemak dalam darah
hewan percobaan tersebut.
B. Variabel Penelitian
Pada penelitian “Uji In-Vivo Serbuk dan Isolat dari Biji Pepaya (Carica papaya L.)
dalam menurunkan kadar lemak darah”, terdapat variabel sebagai berikut:
3) Variabel kontrol : jenis pepaya, jenis mencit, metode pengukuran kadar lemak
darah, cara perlakuan mencit, pemberian pakan mencit
Penelitian dilakukan pada bulan November 2017 sampai April 2018 di Laboratorium
Penelitian Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas
Negeri Malang dan Laboratorium Ma Chung Research Center Photosynthetic Pigments
(MRCPP) Universitas Ma Chung.
D. Subjek dan Objek Penelitian
Subjek penelitian ini adalah biji pepaya Thailand (Carica papaya L.) dan objek
penelitian adalah senyawa aktif flavonoid dalam subjek penelitian yang berperan sebagai
inhibitor enzim lipase sehingga dapat menurunkan kadar lemak dalam darah hewan uji.
a. Alat Penelitian
Alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi: 1) peralatan gelas, yaitu
erlenmeyer, gelas beaker, kaca arloji, pengaduk kaca, corong kaca, , pipet volume, gelas
ukur, tabung reaksi, labu takar dan buret; 2) peralatan lain, yaitu neraca analitik dengan
ketelitian 0,001, blender, ayakan 50 mesh (MBT SIEVE SHAKER), corong buncher, statif
dan klem, spatula, peralatan Kromatografi lapis Tipis (KLT),peralatan pengujian In-Vivo,
pipet tetes indikator universal, kertas saring halus dan kasar, aluminium foil dan pisau. Serta
peralatan instrumen magnetic stirer (Thermo Scientific), rotary evaporator (B.U.C.H.I),
watherbath, pH meter (pH 3110 SET 2), lampu UV (Merck dengan λ: 254 nm, 312 nm, dan
356 nm), spektrofotometer UV-Vis (UV-1700 PharmaSpec Shimadzu) dan FT-IR, LC-MS di
laboratorium lain.
b. Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi: biji pepaya, etanol 70%,
aquades steril, buffer fosfat pH 7,5 (dibuat dengan mencampurkan 16 mL larutan NaH2PO4
dan 84 mL larutan Na2HPO4), larutan H2SO4 pekat (Merck), NaOH 0,01 N, indikator pp, plat
Kromatografi Lapis Tipis (KLT) GF254 (Merck), Lipase enzym from porcine pancreas type II
(Sigma Aldrich), minyak zaitun, Orlistat (Xenical®), gum arabik, NaCl, CaCl2, mencit.
F. Prosedur Penelitian
a. Preparasi Sampel
Biji pepaya segar didapatkan dari pepaya varietas Thailand. Pepaya dipotong dan
dikumpulkan bijinya. Biji yang telah dikumpulkan dicuci dengan air dan dikeringkan dengan
cara di jemur dibawah sinar matahari sampai beratnya konstat. Kemudian biji pepaya yang
telah dijemur, disangrai dan dihaluskan dengan blender. Sernuk yang didapat lalu di ayak
dengan ayakan 50 mesh kemudian hasil ayakan ditempatkan dalam gelas beaker dan ditutup
rapat menggunakan plastik wrap.
b. Ekstraksi
Sebanyak 85 gram serbuk biji pepaya direndam dalam 325mL etanol 70% selama 20
menit. Sebanyak 325mL aquades steril ditambahkan ke dalam larutan sampel dan dilakukan
maserasi 1x24jam disertai pengadukan dengan menggunakan magnetic stirer. Setelah proses
maserasi selesai, larutan sampel disaring, filtrat yang didapatkan dipekatkan dengan rotary
evaporator dengan suhu 50ºC untuk mendapatkan ekstrak kental biji pepaya. Ekstrak kental
kemudian diuji secara fitokimia dengan uji flavonoid ( Panca, 2016) dan diuji inhibisinya
terhadap lipase pankreas secara In-Vivo dengan melihat kadar lemak dalam darah tikus uji
yang diberikan ekstrak biji Pepaya (Carica papaya L.) dan tikus uji yang diberikan Orlistat
sebagai pembanding.
c. Pembuatan Substrat
Terdapat dua jenis substrat yang digunakan yaitu substrat minyak dan substrat
kontrol. Pembuatan substrat minyak dengan cara mencampurkan 2,5 mL minyak zaitun dan
22,5 mL larutan gum arabik lalu dihomogenkan selama 10 menit. Kemudian ditambahkan 20
mL H2O, 15 mL CaCl2 0,075M, 10 mL NaCl 3 M, selanjutnya dihomogenkan kembali.
Campuran dimasukkan ke dalam labu ukur 100 mL dan ditambahkan aquades hingga tanda
batas. Pembuatan substrat kontrol dilakukan dengan cara yang sama dengan pembuatan
substrat minyak namun, penggunaan 2,5 mL minyak zaitun diganti dengan 2,5 mL air.
(Panca, 2016)
Pengujian aktivitas lipase dimulai dengan membuat substrat minyak dan substrat
kontrol. Substrat minyak dibuat dengan cara 2,5 mL minyak zaitun ditambah dengan 22,5 mL
larutan gum arabik 10% dihomogenkan selama 10 menit, ditambah 20 mL H2O, 15 mL CaCl2
0,075 M dan 10 mL NaCl 3 M kemudian dihomogenkan kembali dan dimasukkan ke dalam
labu ukur 100mL serta ditambahkan aquades hingga tanda batas. Sedangkan substrat kontrol
dengan mengganti 2,5 mL minyak zaitun menggunakan air 2,5 mL. (Panca, 2016)
1. Uji Aktivitas Lipase Pankreas
3. Uji Inhibisi Sari, Serbuk, Ekstrak Kental dan Isolat Flavoboid Hasil KLTP terhadap
Lipase Pankreas
Pengujian aktivitas lipase dengan cara diambil 25 mL substrat minyak sebanyak 4 kali
dan ditempatkan dalam 4 buah erlenmeyer. Kondisi pH substrat diatur dengan buffer
fosfat sampai pH 7,5. Erlenmeyer pertama ditambahkan sari dari 8,5 gram biji pepaya,
erlenmeyer kesua ditambahkan 0,928 gram serbuk biji pepaya, erlenmeyer ketiga
ditambahkan 0,85 gram ekstrak kental biji pepaya, erlenmeyer ke empat ditambahkan
isolat flavonoid hasil KLTP, selanjutnya sebanyak 1 mg enzim lipase ditambahkan ke
dalam masing-masing erlenmeyer, kemudian dikocok selama 30 detik. Campuran
diinkubasi pada suhu 37ºC selama 25 menit. Hidrolisis substrat oleh enzim lipase
dihentikan dengan memanaskan erlenmeyer ke dalam penangas air dengan kondisi air
yang mendidih selama 10 menit. Masing-masing campuran substrat-enzim ditambah 3
tetes indikator pp kemudian ditritasi dengan NaOH 0,1 N sampai timbul warna merah
muda (pink). Langkah yang sama dilakukan terhadap substrat kontrol (air). (Panca,
2016)
d. Uji Flavonoid
Sebanyak 1 mg (sekitar 1 tetes larutan) sari, serbuk, ekstrak kental biji pepaya dan
isolat hasil KLTP yang diperoleh, diletakkan pada plat tetes kemudian dilarutkan dalam
sedikit metanol. Larutan sampel lalu ditambahkan dengan H2SO4 pekat. Diamati perubahan
warna sampel pada plat tetes. (Panca, 2016)
Dalam penelitian ini dilakukan dua jenis KLT, yaitu KLT kualitatif dan KLT
preparatif dengan prosedur sebagai berikut:
Kromatografi lapis tipis kualitatif digunakan untuk menentukan eluen yang digunakan
dalam KLT preparatif. Ekstrak kental biji pepaya yang diperoleh dianalisis dengan
kromatografi lapis tipis (KLT) kualitatif. Plat KLT dipotong dengan ukuran panjang 5
cm dan lebar 1 cm. Pada bagian atas dan bawah diberi tanda batas, batas atas 0,5 cm
dan batas bawah 0,5 cm. Analisis KLT dilakukan dengan cara menotolkan sampel
pada bagian bawah plat KLT menggunakan pipa kapiler kemudian dimasukkan ke
dalam bejana KLT (chamber) yang dijenuhkan dengan eluen yang berupa etil asetat,
metanol dan air dengan perbandingan 0,5:1,4:0,1 (v/v/v), etil asetat dan air dengan
perbandingan (0,5:1,5), (0,4:1,6), (0,3:1,7), (0,2:1,8), (0,1:1,9) dan (1:1).
Proses KLT berakhir ketika eluen telah mencapai batas atas. Selanjutnya plat KLT
diamati di bawah lampu UV untuk mengetahui adanya noda yang tampak pada plat
KLT. Noda yang tampak diberi tanda kemudian dihitung faktor retensinya (Rf).
Bercak atau noda yang ada dikerok dan dianalisis menggunakan UV-Vis dan pelarut
yang dapat menghasilkan pemisahan noda terbaik digunakan untuk kromatografi lapis
tipis (KLT) preparatif.
2. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Preparatif
Plat KLT dipotong dengan ukuran panjang 15 cm dan lebar 15 cm. Pada bagian atas
dan bawah diberi tanda batas yakni 1,5 cm. Analisis KLT dilakukan dengan cara
menotolkan sampel pada bagian bawah plat KLT menggunakan pipa kapiler secara
berulang kali kemudian dimasukkan ke dalam benjana KLT (chamber) yang
dijenuhkan dengan eluen yang berupa etil asetat, metanol dan air dengan
perbandingan 20;56;4 (v/v/v).
Proses KLT berakhir ketika eluen telah mencapai batas atas. Selanjutnya plat KLT
diamati di bawah lampu UV untuk mengetahui adanya noda yang tampak pada plat
KLT. Noda yang tampak diberi tanda kemudian dihitung faktor retensinya (Rf).
Bercak atau noda yang ada dikerok dan dianalisis dengan menggunakan UV-Vis dan
FT-IR.
3. LC-MS
Hasil isolat KLT preparatif juga dianalisis dengan LC-MS untuk mengidentifikasi
struktur senyawa hasil isolasi melalui analisis pada spektrum massa yang terbentuk
dan terdapat puncak-puncak yang menyatakan suatu fragment molekul. Sebelum
dianalisis sengan LC-MS, hasil isolat dipisahkam dengan HPLC untuk mengetahui
tingkat kemurnian isolat.
3. Uji Aktivitas Isolat Flavonoid dari Ekstrak Biji Pepaya (Carica papaya L.)
Hewan yang digunakan untuk uji secara in vivo adalah tikus putih strain wistar
dengan jenis kelamin jantan berusia 2 bulan dan berat badan 130-150 g. Digunakan
hewan sebanyak 18 ekor yang dikelompokkan menjadi tiga, masing-masing enam
ekor tikus, yaitu: Kelompok I, II, dan III. Di hari pertama semua tikus diukur kadar
lemak darahnya. Tikus pada kelompok I diberi makanan setandar tanpa tambahan,
kelompok II selain diberi makanan standar diberi tambahan 0,05 gram orlistat tiap
pagi hari, dan kelompok III selain diberi makanan standar diberi tambahan 1 gram sari
mesokarp tiap pagi hari. Perlakuan terhadap tikus ini dilakukan selama 30 hari.
Pengambilan darah dilakukan pada hari ke 31, dimana sebelumnya tikus dipuasakan
selama 1 malam. Kemudian pada pagi harinya tikus mulai diambil darahnya melalui
sinus orbitalis mata menggunakan mikrohematokrit.
Metode analisis data terdiri dari beberapa tahap, antara lain sebagai berikut:
1) Aktivitas Lipase Pankreas (ALP)
Menurut penelitian Irawan dkk (2008:287), aktivitas lipase pankreas dapat dihitung
menggunakan rumus sebagai berikut:
(Vsm−Vsa)x N NaOH x 1000
ALP = (µmol/menit)
Vs x 25
Keterangan:
Vsm : Volume NaOH yang diperlukan pada titrasi substrat
minyak (mL)
Vsa : Volume NaOH yang diperlukan pada titrasi substrat
air (mL)
N NaOH : Normalitas NaOH yang digunakan pada titrasi substrat
(mol/L)
1000 : faktor konversi dari mmol ke µmol
Vs : volume substrat yang diambil sebanyak 25 mL
25 : waktu inkubasi (menit)
2) Daya Inhibisi terhadap Lipase Pankreas (DILP)
Daya Inhibisi lipase pankreas dari berbagai sampel mesokarp mentimun, yaitu:
a. Daya Inhibisi Orlistat terhadap Lipase Pankreas
ALP tanpa inhibitor−ALP Orlistat
DILP = x 100%
ALP tanpa inhibitor
7) Analisis LDL
Analisis LDL dari serum darah yang telah diambil dari mencit dapat dihitung
menggunakan rumus yaitu:
Kolesterol total − HDL −Trigliserida
LDL =
5
DAFTAR PUSTAKA
Anjum V, Ansari SH, Naquvi KJ, Arora P, Ahmad A. Development of quality standards of
Carica papaya Linn. Leaves, Sch Res Lib 2013; 5(2):370-376.
Sjahid, R. Landyyun. 2008. Isolasi dan Identifikasi Flavonoid dari Daun Dewandaru
(Eugenia uniflora L.). Skripsi. Tersedia dalam http://www.pdfport.com/view/638561-
isolasi-dan-identifikasi-flavonoid-dari-daun-dewandaru-eugenia.html (diakses tanggal
08 Januari 2013)
Badan Pusat Statistik (BPS). 2014. Statistik Indonesia, statistical year book of Indonesia
2014. Jakarta: BPS.
Bishop ML, Fody EP, Schoeff LE. 2004. Clinical Chemistry. Fifth Edition. Washington DC:
Wolters Kluwer Health..
Birari R, Bhutani K. Pancreatic lipase inhibitors from natural sources: unexplored potential.
Drug Discov Today 2007; 12: 879-889.
Brug J, Crawford D. The obesity pandemic. Is it bad or worse? European Journal of Public
Health 2009; 19: 570-571.
Drew B, Dixon A, Dixon J. Obesity management: update on orlistat. Vascular Health Risk
and Management 2007; 3: 817-821
Filippatos, T. D., Derdemezis, C. S., Gazi I. F., Na-kou, E. S., Mikhalidis, D. P., & Elisaf M.
S. 2008. Orlistat associated adverse effects and drug interactions: a critical review.
Drug Safety, 31 (1): 53-65.
Gandhi, N., 1997, Application of Lipases, Journal American Oil Chemist Society, 74(6), 621-
629.
Lim, D.W., Kim, Y.T., Jang, Y.J., Kim, Y.E., & Han, D. 2013. Anti-Obesity Effect of
Artemisia capillaris Extracts in High-Fat Diet-Induced Obese Rats. Molecules.
Latifah, 2015. Identifikasi Golongan Senyawa Flavonoid dan Uji Aktivitas Antioksidan Pada
Ekstrak Rimpang Kencur Kaempferia galanga L. Dengan Metode DPPH (1,1-Difenil-
2Pikrilhidrazil). Program Studi Kimia FMIPA. Universitas Islam Negeri Maulana
Malik Ibrahim. Malang
Lenny, S. 2006. Senyawa Flavonoida, fenil Propanoida dan Alkaloida. Karya Ilmiah. MIPA
Universitas Sumatera Utara.
Lusiana, K., Magatra,P., Martono,Y., Ekstrak Limbah Biji Pepaya Carica Papaya Seeds Anti
Penyakit Jantung Koroner. Program Studi Kimia FMIPA.Universitas Kristen Satya
Wacana . Salatiga
Moreno D A, Ilic N, Poulev A, Brasaemle D L, Fried S K et al, Ihibitory effects of grape seed
extract on lipases, Nutrition, 19 (2003) 876-879
Malacrida, C.R., Kimura, M., & Jorge, N. 2011. Characterization of a high oleic oil extracted
from papaya (Carica papaya L.) seeds. Cienc. Tecnol. Aliment., Campinas, 31(4):
929-934.
Meirindasari, N. 2013. pengaruh pemberian jus biji pepaya(Carica papaya L.)terhadap kadar
kolesterol total tikus sprague dawley dislipidemia. Artikel Penelitian. Universitas
Diponegoro.
Madhavi, D.L., R.S. Singhal, P.R. Kulkarni. (1985). Technological Aspects of Food
Antioxidants dalam D.L. Madhavi, S.S. Deshpande dan D.K. Salunkhe: Food
Antioxidant, Technological, Toxilogical and Health Perspectives. Marcel Dekker Inc.,
Hongkong: 161-265
Maslarova, N.V. Yanishlieva. (2001). Inhibiting oxidation dalam Jan Pokorny, Nedyalka
Yanislieva dan Michael Gordon: Antioxidants in food, Practical applications.
Woodhead Publishing Limited, Cambridge: 22-70
Nitin A. Lunagariya, Neeraj K. Patel, Sneha C. Jagtap, Kamlesh K. Bhutani* Department of
Natural Products, National Institute of Pharmaceutical Education and Research
(NIPER), Sector 67, S.A.S Nagar, Mohali-160062, Punjab (INDIA)
Osato JA, Santiago L.A., Remo, G.M., Cuandra, M.S., & Mori, A. 1993. Antimicrobial and
antioxidant activities of unripe papaya. Life Sci, 53(17): 1383-1389.
Rahayu et al., 2009 Rahayu, D dan Hastuti, S.D. 2009. Stabilitas Saponin sebagai Antibiotik
Alami Hasil Isolasi Gel Daun Aloe barbandis miller pada Variasi Suhu dan Lama
Simpan. Jurnal. Malang: Jurusan Peternakan Fakultas Peternakan-Perikanan
Universitas Muhammadiyah Malang.
Susanti A. Inhibisi Ekstrak Air dan Etanol Daun Asam Jawa dan Rimpang Kunci Pepet
terhadap Lipase Pankres Secara In-Vitro. Departemen Kimia FMIPA Insititut
Pertanian Bogor.
Schrauwen P, Westerterp KR. The role of high-fat diets and physical activity in the regulation
of body weight. British Journal of Nutrition 2000; 84: 417-427
Subandi, Erlinda, F., Afida Afnib, F., Iqnatus Suknah, L. and Nur Faizin,A. 2015.
PANCREATIC LIPASE INHBITOR ACTIVITY OF CaricapapayaL. SEEDS
POWDER AND THE POTENCY AS ANTI OBESITY ‘COFFEE’ DRINK.
Shahani, K. M. 1975, Lipase and Esterases, In Enzymes in Food Processing ed, G, Redd,
pp.181-217. Academic, New York
Sri Wahyu Murni, Siti Diyar Kholisoh, Tanti D.L., dan Petrissia E.M. 2011. Produksi,
Karakterisasi, dan Isolasi Lipase dari Aspergillus nige. Program Studi Teknik Kimia,
Fakultas Teknologi Industri, UPN “Veteran”. Yogyakarta
Silverstein, Bassler and Moril. 1986. Penyidikan Spketrofotometrik Senyawa Organic edisi
ke-4. Jakarta : erlangga
Tsuji M, Saito N & Inoue S, Inhibitors of absorption as anti-obesity drugs, Nihon Yakurigaku
Zasshi, 118 (2001) 340-346
Tona, L., Kambu, K., Ngimbi, N., Cimanga, K., & Vlentink, A.J. 1998. Antiamoebic and
phytochemical screening of some congolese medisinal plants, J. Ethnopharmacol,
61(1): 57-65.
Vinson, Joe A., Jinhee Jang, Yousef A. Dabbagh, Mamdouh M. Serry and Songhuai Cai.
(1995a). Plant Polyphenols Exhibit Lipoprotein-Bound Antioxidant Activity Using an
in Vitro Oxidation Model for Heart Disease. J. Agric. Food. Chem. (43): 2798-2799
Vinson, Joe A., Yousef A. Dabbagh, Mamdouh M. Serry and Jinhee Jang. (1995b). Plant
Flavonoids, Especially Tea Flavonols, Are Powerful Antioxidants Using an in Vitro
Oxidation Model for Heart Disease. J. Agric. Food. Chem. (43): 2800-2802
Voshol P, Rensen P C N, van Djik K, Romijn J & Havekes L. Effect of plasma triglyceride
metabolism on lipid storage in adipose tissue: Studies usinh genetically engineered
mouse models. Biochim Biophys Acta, 1791 (2009) 479-485
Mukherjee, A. & Sengupta, S. 2013. Indian medicinal plants known to contain intestinal
glucosidase inhibitors also inhibit pancreatic lipase activity – an ideal situation for
obesity control by herbal drugs. Indian Journal of Biotechnology, Vol. 12, January
2013, pp. 32-39.
Wijiutami,P. 2016. Isolasi, Identifikasi dan Uji Aktivitas Flavonoid dari Biji Pepaya (Carica
papaya L.) sebagai Inhiitor Lipase Pankreas. Skripsi. Jurusan Kimia. Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Universitas Negeri Malang
White dan Y. Xing, 1951; Madhavi et al., White, P.J. and Y. Xing. (1954). Antioxidants from
Cereals and Legumes dalam Foreidoon Shahidi: Natural Antioxidants, Chemistry,
Health Effect and Applications. AOCS Press, Champaign, Illinois: 25-63
LAMPIRAN
BIJI PEPAYA
- Dilakukan pengayakan
- Diuji aktivitas - Diuji (Ayakan 50 mesh)
inhibisi lipase fitokimia
pankreas flavonoid
- Dipekatkan dengan
rotary evaporator
- Dihomogenkan 10 menit
- Ditambah 20 mL akuades
- Ditambah 15 mL CaCl2 0,075 M
- Ditambah 10 mL NaCl 3 M
- Dihomogenkan
- Dimasukkan ke dalam labu takar 100 mL
- Ditambah akuades hingga tanda batas
SUBSTRAT MINYAK
- Dihomogenkan 10 menit
- Ditambah 20 mL akuades
- Ditambah 15 mL CaCl2 0,075 M
- Ditambah 10 mL NaCl 3 M
- Dihomogenkan
- Dimasukkan ke dalam labu takar 100 mL
- Ditambah akuades hingga tanda batas
SUBSTRAT AIR
Lampiran 3. Diagram Alir Uji Aktivitas Lipase Pankreas dan Inhibisi Lipase
Pankreas
SUBSTRAT MINYAK
- Diambil 25 mL substrat
- Dimasukkan ke dalam Erlenmeyer
- Diatur pH substrat dengan buffer fosfat hingga mencapai pH 7,5
- Ditambah 1 mg serbuk lipase porcine pankreas
- Dikocok selama 30 detik
- Diinkubasi pada suhu 37°C selama 25 menit
- Dimasukkan ke waterbath mendidih selama 10 menit
- Ditambahkan 3 tetes indikator pp
- Dititrasi dengan NaOH 0,1 N
- Dilakukan metode yang sama untuk substrat kontrol
VOLUME NaOH HASIL TITRASI
SUBSTRAT AIR
- Diambil 25 mL substrat
- Dimasukkan ke dalam Erlenmeyer
- Diatur pH substrat dengan buffer fosfat hingga mencapai pH 7,5
- Ditambah 1 mg serbuk lipase porcine pankreas
- Dikocok selama 30 detik
- Diinkubasi pada suhu 37°C selama 25 menit
- Dimasukkan ke waterbath mendidih selama 10 menit
- Ditambahkan 3 tetes indikator pp
- Dititrasi dengan NaOH 0,1 N
- Digunakan air sebagai pengganti minyak zaitun
VOLUME NaOH HASIL TITRASI
Lampiran 3 (Lanjutan)
SUBSTRAT MINYAK
- Diambil 25 mL substrat
- Dimasukkan ke dalam Erlenmeyer
- Ditambah serbuk dari 1 kapsul Orlistat
- Diatur kondisi pH dengan buffer fosfat hingga mencapai pH 7,5
- Ditambah 1 mg serbuk lipase porcine pankreas
- Dikocok selama 30 detik
- Diinkubasi pada suhu 37°C selama 25 menit
- Dimasukkan ke waterbath mendidih selama 10 menit
- Ditambahkan 3 tetes indikator pp
- Dititrasi dengan NaOH 0,1 N
- Digunakan air sebagai pengganti minyak zaitun
VOLUME NaOH HASIL INHIBISI
SUBSTRAT MINYAK
- Diambil 25 mL substrat
- Dimasukkan ke dalam Erlenmeyer
- Ditambah sari biji pepaya
- Diatur kondisi pH dengan buffer fosfat hingga mencapai pH 7,5
- Ditambah 1 mg serbuk lipase porcine pankreas
- Dikocok selama 30 detik
- Diinkubasi pada suhu 37°C selama 25 menit
- Dimasukkan ke waterbath mendidih selama 10 menit
- Ditambahkan 3 tetes indikator pp
- Dititrasi dengan NaOH 0,1 N
- Digunakan air sebagai pengganti minyak zaitun
VOLUME NaOH HASIL INHIBISI
Lampiran 3 (Lanjutan)
SUBSTRAT MINYAK
- Diambil 25 mL substrat
- Dimasukkan ke dalam Erlenmeyer
- Ditambah serbuk biji pepaya
- Diatur kondisi pH dengan buffer fosfat hingga mencapai pH 7,5
- Ditambah 1 mg serbuk lipase porcine pankreas
- Dikocok selama 30 detik
- Diinkubasi pada suhu 37°C selama 25 menit
- Dimasukkan ke waterbath mendidih selama 10 menit
- Ditambahkan 3 tetes indikator pp
- Dititrasi dengan NaOH 0,1 N
- Digunakan air sebagai pengganti minyak zaitun
VOLUME NaOH HASIL INHIBISI
SUBSTRAT MINYAK
- Diambil 25 mL substrat
- Dimasukkan ke dalam Erlenmeyer
- Ditambah ekstrak kental biji pepaya
- Diatur kondisi pH dengan buffer fosfat hingga mencapai pH 7,5
- Ditambah 1 mg serbuk lipase porcine pankreas
- Dikocok selama 30 detik
- Diinkubasi pada suhu 37°C selama 25 menit
- Dimasukkan ke waterbath mendidih selama 10 menit
- Ditambahkan 3 tetes indikator pp
- Dititrasi dengan NaOH 0,1 N
- Digunakan air sebagai pengganti minyak zaitun
VOLUME NaOH HASIL INHIBISI
Lampiran 3 (Lanjutan)
SUBSTRAT MINYAK
- Diambil 25 mL substrat
- Dimasukkan ke dalam Erlenmeyer
- Ditambah isolat hasil KLT preparatif
- Diatur kondisi pH dengan buffer fosfat hingga mencapai pH 7,5
- Ditambah 1 mg serbuk lipase porcine pankreas
- Dikocok selama 30 detik
- Diinkubasi pada suhu 37°C selama 25 menit
- Dimasukkan ke waterbath mendidih selama 10 menit
- Ditambahkan 3 tetes indikator pp
- Dititrasi dengan NaOH 0,1 N
- Digunakan air sebagai pengganti minyak zaitun
- Dibandingkan
Kontrol negatif
Lampiran 5. Diagram Alir Pengujian In-Vivo
DARAH MENCIT
Endapan Supernatan
= 2,2053 g
= 17,55 g
= 3,56 g
= 1,3797 g
f. Larutan NaOH 0,1 M
Larutan NaOH 0,1 M dibuat sebanyak 1000 mL (BM NaOH = 40)
Berat NaOH = [NaOH] x Vlarutan x Massa molar
0,1 𝑚𝑜𝑙 1𝐿 40,00 𝑔
= 𝑥 𝑥 1000 𝑚𝐿
1𝐿 1000 𝑚𝐿 1 𝑚𝑜𝑙
=4g
M H2C2O4 =MxV
= 0,05 M x 0,05 L
= 0,0025 mol
= 0,315 g
h. Pembakuan Larutan NaOH 0,097 M
Tabel Lampiran 7.1 Pembakuan larutan NaOH 0,097 M dengan Asam Oksalat 0,1 M
Volume Asam Volume NaOH (mL) Volume
NaOH
oksalat 1 2 3 rata-rata
5 5,2 5,1 5,2 5,2