2. wadah sampel, Wadah sampel diperlukan untuk semua teknik spektroskopi kecuali spektroskopi emisi.
Umumnya wadah sampel disebut kuvet atau sel.
Kuvet yang terbuat dari kuarsa baik untuk spektroskopi ultra violet dan juga untuk spektroskopi sinar tampak.
Kuvet plastik dapat digunakan untuk spektroskopi sinar tampak.
Panjang sel untuk spektroskopi UV-Vis biasanya 1 cm, ada juga sel dengan panjang 0,1 cm.
Sel untuk spektroskopi infra merah dengan sampel padatan atau cairan umumnya mempunyai tebal sel kurang dari 1 mm. Yang paling banyak dipakai untuk spektroskopi infra merah adalah
kristal NaCl, KBr, LiF dan sebagainya.
3. monokromator, Monokromator adalah alat yang paling umum dipakai untuk menghasilkan berkas radiasi dengan satu panjang gelombang. Monokromator untuk radiasi ultra violet, sinat tampak dan infra merah
adalah serupa, yaitu mempunyai celah (slit), lensa, cermin dan prisma atau grating.
Terdapat 2 macam monokromator yaitu monokromator prisma Bunsen dan monokromator grating Czerney-Turney.
4. detektor, dan Dikenal 2 macam detektor, yaitu detektor foton dan detektor panas. Detektor foton termasuk (1) sel photovoltaic, (2) phototube, (3) photomultiplier tube, (4) detektor semi konduktor, dan (5)
detektor diode silikon. Detektor panas biasa dipakai untuk mengukur radiasi infra merah, termasuk thermocouple dan bolometer.
5. rekorder. Signal listrik dari detektor bisanya diperkuat dengan amplifier kemudian direkam sebagai spektrum yang berbentuk puncak-puncak.
Plot antara panjang gelombang dan absorban akan dihasilkan spektrum.
Spektroskopi: ilmu yang mempelajari hubungan antara radiasi (energi/sinar) dengan respon suatu benda/zat dimana hubungannya tersebut merupakan fungsi panjang gelombang (frekuensi)
Spektrofotometri: hanya untuk UV visibel&IR [suatu teknik pengukuran tentang hubungan radiasi, respon]
Colarimetri: pengamatan terhdapat warna yang diberikan benda dimana benda memberikan respon terhadap suatu energi atau sinar
Tipe Spektroskopi
• Spektroskopi Ultraviolet (UV) ---- Keadaan energi elktronik
• Digunakan untuk ---- molekul konjugasi, gugus karbonil, gugus nitro
• Spektroskopi Infrared (IR) ---- keadaan energi vibrasi
• Digunakan untuk ---- gugus fungsional, struktur ikatan
• Spektroskopi NMR ---- keadaan spin inti
• Digunakan untuk ---- bilangan, tipe dan posisi relatif dari proton (inti hidrogen dan inti karbon 13)
• Spektroskopi Massa ---- Penembakan elektron berenergi tinggi
• Digunakan untuk ---- berat molekul, keberadaan nitrogen, halogen
Beberapa istilah dalam spektroskopi absorpsi adalah transmitansi, absorbansi dan absorptivitas.
Istilah tersebut digunakan dalam spektroskopi UV-Vis, spektroskopi absorpsi atom dan spektroskopi IR.
Transmitansi
Apabila suatu berkas sinar radiasi dengan intensitas Io dilewatkan melalui suatu larutan dalam wadah transparan maka sebagian radiasi akan diserap sehingga intensitas radiasi yang diteruskan It menjadi lebih kecil
dari Io.
Transmitansi dengan simbol T dari larutan merupakan fraksi dari radiasi yang diteruskan atau ditansmisikan oleh larutan, yaitu :
T = It/Io. Transmitansi biasanya dinyatakan dalam persen (%).
Absorbansi
Absorbansi dengan simbol A dari suatu larutan merupakan logaritma dari 1/T atau logaritma Io/It.
A = log (1/T) = log (Io/It) = - log (T)
Contoh : Bila A = 0 artinya radiasi diteruskan 100%, bila A = 1
artinya radiasi diteruskan 10%. Nama lain dari absorbansi adalah Optical Density (OD)
Absortivitas dan Absortivitas Molar
Absorbansi berbanding langsung dengan tebal larutan dan konsentrasi larutan (hukum Beer), yaitu :
A=abc
dimana:
A = absorbansi
a = konstanta disebut absortivitas
b = tebal larutan
c = konsentrasi larutan
Jika konsentrasi c dinyatakan dalam mol/liter (Molar) dan tebal larutan dalam cm maka absortivitas disebut absortivitas molar (), sehingga
A=bc
Hukum Beer menyatakan bahwa absorbansi berbanding langsung dengan tebal larutan dan konsentrasi seperti telah dikemukakan sebelumnya.
Rumus ini dapat dijelaskan sebagai berikut : Radiasi dengan intensitas Io yang dilewatkan bahan setebal b berisi sejumlah n partikel (atom, ion atau molekul) akan mengakibatkan intensitas berkurang menjadi It
IR
Prinsip: vibrasi dan rotasi pada gugus fungsi, menunjukkan serapan IR yang spesifik
Syarat sampel: punya gugus fungsi berupa ikatan kovalen tunggal, dimana momen dipol berubah saat bervibrasi
Setiap ikatan mempunyai bilangan gelombang tertentu
Ikatan yang sama pada dua senyawa berbeda mempunyai spektra IR berbeda
Tidak ada dua molekul yang berbeda yang mempunyai IR pesis sama
IR dapat digunakan untuk menentukan purity indeks (indeks kemurnian)
Uji kualitatif:daerah finger print/sidik jari
4000-1500 cm-1 = daerah vibrasi terlokalisasi
1500-900 cm-1 = daerah sidik jari
Jenis vibrrasi
Streching (ulur): simetri (momen dipol =0), asimetri
Bending (tekuk), meliputi:
Twisting
Rocking
Wagging
Scicoring
Faktor yang mempengaruhi frkuensi vibrasi
1. Kopling vibrasi Diagram Skematik dari Spektrometer IR
2. Ikatan hidrogen (intra molekul&antar molekul)
3. Efek elektronik (resonansi&induksi)
4. Sudut ikatan
5. Efek ruang
• Pada dasarnya Spektrometer FTIR (Fourier Trasform Infra Red) adalah sama dengan Spektrometer IR dispersi, yang membedakannya adalah pengembangan pada sistim optiknya sebelum berkas sinar
infra merah melewati contoh. Dasar pemikiran dari Spektrofotometer FTIR adalah dari persamaan gelombang yang dirumuskan oleh Jean Baptiste Joseph Fourier (1768-1830) seorang ahli matematika
dari Perancis.
• Dari deret Fourier tersebut intensitas gelombang dapat digambarkan sebagai daerah waktu atau daerah frekwensi. Perubahan gambaran intensitas gelobang radiasi elektromagnetik dari daerah waktu ke
daerah frekwensi atau sebaliknya disebut Transformasi Fourier (Fourier Transform).
Keunggulan Spektrofotometer FTIR
• Dapat digunakan pada semua frekwensi dari sumber cahaya secara simultan sehingga analisis dapat dilakukan lebih cepat daripada menggunakan cara sekuensial atau scanning.
• Sensitifitas dari metoda Spektrofotometri FTIR lebih besar daripada cara dispersi, sebab radiasi yang masuk ke sistim detektor lebih banyak karena tanpa harus melalui celah (slitless).
UV
Komponen Instrumentasi UV-Vis Syarat pelarut:
• Sumber Radiasi Harus dapat melarutkan sampel
– Lampu wolfram Meneruskan radiasi pada λ yang sedang dianalisis
• Kuvet (Sample Container) Bisa ditambahkan kosolven untuk meningkatkan kelarutan
– Kuarsa atau silika Tidak menimbulkan UV cut off
• Monokromator UV cut off/transparency limit: panjang gelombang dimana pelarut memberikan serapan, diusahakan
– Prisma kaca atau kuarsa agar λ pelarut berbeda dengan λ sampel.
• Detektor Daerah absorbansi yang tercatat biasanya 0,2-0,8 tergantung kecanggihan alat, apabila serapan yang
– Fotolistrik dihasilkan lebih dari 0,8 maka dapat dilakukan pengenceran
• Pencatat
Menurut konfigurasi optiknya, spektrofotometer UV-Vis dibagi menjadi Alasan mengapa harus menggunakan panjang gelombang maksimal
– Single Beam Pada panjang gelombang maksimal, kepekaannya juga maksimal karena pada panjang gelombang
– Double Beam maksimal tersebut, perubahan absorbansi untuk setiap satuan konsentrasi adalah yang paling besar
– Multi Channel Disekitar panjang gelombang maksimal, bentuk kurva absorbansi datar dan pada kondisi tersebut
Prosedural hukum Lambert-Beer akan terpenuhi
1. Pembuatan larutan baku (ppm) Jika dilakukan pengukuran ulang maka kesalahan yang disebabkan oleh pemasangan ulang panjang
2. Pembuatan variasi konsentrasi (minimal 5 titik) gelombang akan kecil sekali, ketika digunakan panjang gelombang maksimal
3. Penentuan λ maksimum, agar deviasi yang terjadi semakin kecil
4. Pengukuran serapan/absorbansi pada λ maks Syarat sampel yang bisa dianalisis:
5. Pembuatan kurva baku....y=a+bx Memiliki kromofor dan auksokrom
(y=absorbansi,a=interseption,b=slope/gradien,x=konsentrasi) Kromofor= gugus kovalen tak jenuh yang mengalami transisi n π* dan ππ*
6. Pengukuran sampel Auksokrom= unsur yang menempel langsung di pasangan konjugasi, mempunyai peb
Untuk senyawa yang tidak memiliki kromofor dapat dilakukan derivatisasi
Derivatisasi: mengubah senyawa menjadi senyawa lain atau direaksikan dengan pereaksi tertentu
sehingga memiliki gugus kromofor.
Elektron yang terlibat pada penyerapan radiasi ultraviolet dan visibel ini ada tiga, yaitu elektron sigma, elektron phi, dan elektron bukan ikatan atau non bonding elektron
elektron sigma (σ) orbital molekul ikatan yang menyebabkan terjadinya ikatan tunggal disebut ikatan sigma. Elektron-elektron yang menempatinya disebut
dengan elektron sigma.
ikatan phi (π) dalam molekul organik yang berikatan rangkap, terdapat dua macam orbital molekul, yaitu orbital sigma (mengandung sepasang elektron)
dan orbital phi (mempunyai sepasang elektron). Orbital phi terjadi karena tumpang tindih (overlapping) dua orbital atom p
elektron bukan ikatan disebut non bonding elektron karena elektron tersebut tidak ikut serta dalam pembentukan ikatan kimia dalam suatu molekul. Non
(elektron n=non bonding) bonding elektron ini biasanya terdapat di sekitar atom N,O,S, dan halogen
Transisi-transisi elektronik yang terjadi diantara tingkat-tingkat energi di dalam suatu molekul ada 4, yaitu:
transisi sigma-sigma star (σσ*) jenis transisi ini terjadi pada daerah ultrabiolet vakum sehingga kurang begitu bermanfaat untuk analisis dengna cara spektrofotometri UV-Vis
transisi n-sigma star(nσ*) jenis transisi ini terjadi pada senyawa organik jenuh yang mengandung atom-atom yang memiliki elektron bukan iktan (elektron n). Energi yang
diperlukan lebih kecil dibanding transisi σσ* sehingga sinar yang diserap pun mempunyai panjang gelombang yang lebih panjang
*
transisi n-phi star (n π ) dan untuk memungkinkan terjadinya transisi ini, maka molekul organik harus mempunyai gugus fungsional yang tidak jenuh sehingga ikatan rangkap
transisi phi-phi star (π π*) dalam gugus tersebut memberikan orbital phi yang yang diperlukan. Jenis transisi ini merupakan transisi yang paling cocok untuk analisis sebab
sesuai dengna panjang gelombang antara 200-700nm dan panjang gelombang ini secara teknis dapat diaplikasikan pada spektrofotometer
Menentukan senyawa campuran:
Spktofotometri derivative
Metode peak to peak
Metode tangensial
Spektrofotometri derivative
Mengalihkan bentuk data spektrum
Mempoltkan turunan pertama/turunan lebih tinggi absorben terhadap panjang gelombang
1. Menentukan λ maks zat x dan zat y
2. Menentukan λ zero crossing zat x dan zat y
3. Membuat kurva baku (di λ zero crossing masing-masing)
Pengukuran kurva baku zat x dibuat pada λ zero crossing zat y
dengan membuat campuran larutan x dan y sbb:
0 : 10
10 : 10
20 : 10
30 : 10
40 : 10
50 : 10
Aliquot : sampel yang diambil sebagai perwakilan dari sampel yang sama
Y = ax + b
Y=luas area
X=konsentrasi
Kalibrasi internal
1. Larutan stock dibuat (sample yg dianalisis, c: vanilin) minimal 5 titik pengenceran
2. Internal standar dimasukkan ke 5 titik tersebut dengan volume & konsentrasi yang sama
3. Buat persamaan garis: konsentrasi vs rasio
4. Sampel yang belum diketahui (contoh: plasma yang ada vanilin)
dimasukkan Internal Standar dengan volume dan konsentrasi yang sama
5. Didapatkan rasio, masukkan ke persamaan garis dan didapat konsentrasi
vanilin luas area luas area IS rasio
(ppm) vanilin
1+2 100 200 100/200
2+2 200 200 200/200
3+2 300 200 300/200
4+2 400 200 400/200
5+2 500 200 500/200
Y = ax + b
Y=rasio
X= konsentrasi
IS = 2 ppm, dianggap titik tengah, digunakan 2 ppm agar terakomodir
Mass spektroskopi
Mengukur rasio massa terhadap muatan; dimana muatan=1
Proses radiasi menyebabkan molekul terfragmentasi menjadi gugus-gugus fungsi penyusunnya
Aplikasi: menentukan senyawa baru/murni dari tumbuhan
Simbol fisika: m/a (massa/muatan)
Terdapat 5 bagian utama Instrumen
1. Inlet sampel disuntikkan ke inlet, sampel berupa gas yang diuapkan
2. ionisation Chamber didalam ionisation chamber, sampel ditembak oleh elektron
3. Accelelator sampel yang bertumbukan berubah menjadi partikel yang terionisasi (menjadi bermuatan +/-)
4. Medan magnet adanya medan magnek yang kuat akan membelokan partikel menuju detektor, dimana ion tersebut
5. Detektor akan ditentukan massanya
detektor akan membaca dalam bentuk spektrum massa yang disambungkan dengan amplifier
Teknik pemisahan dengan kromatografi dan kegunaan utamanya
Teknik Dasar Penggunaan yang utama
Kromatografi lapis tipis (KLT) Perbedaan kecepatan migrasi analit melalui Analisis kualitatif campuran
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) fase diam dengan gerakan fase cair atau gas Penentuan kualitatif dan kuantitatif
senyawa-senyawa yang tidak mudah
menguap
Kromatografi Gas (KG) Penentuan kualitatif dan kuantitatif
senyawa-senyawa yang mudah menguap
Elektroforesis Perbedaan kecepatan migrasi analit melalui Analisis kualitatif dan kuantitatif senyawa-
medium buffer senyawa ionik
Kromatografi
DEFINISI
Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran didasarkan atas perbedaan distribusi dari komponen-komponen campuran tersebut diantara dua fase, yaitu fase diam (padat atau cair) dan fase
Jenis-Jenis Kromatografi
Berdasarkan fase gerak yang digunakan, kromatografi dibedakan menjadi dua golongan besar yaitu gas chromatography dan liquid chromatography. Masing-masing golongan dapat dibagi lagi seperti
yang telah disebutkan pada definisi di atas.
Kromatografi di dalam bentuk tempat
Komatografi Kolom : Kromatografi kolom merupakan teknik pemisahan di mana tempat
stasioner dalam tabung.
Kromatografi Planar
Kromatografi Kertas
Kromatografi Lapisan Tipis
Kromatografi Gas
Tidak mengandung baku pembanding
Terdapat library pada instrumen
Yang harus diperhatikan:
Sampel: senyawa volatil dan thermostabil
Senyawa yang tidak volatil dapat diderivatisasi
Harus tau suhu didih senyawa yang dianalisis
Menentukan suhu kolom dan detektor biasanya diset 300C diatas TD
Menentukan detektor
Suhu terprogram: suhu kolom ditingkatkan secara bertahap sehingga terjadi pemisahan bertahap
Tujuan suhu terprogram
Mencari pemisahan yang bagus/resolusi yang baik
Mencari kondisi yang akan ditetapkan sehingga bisa dilakukan dengan cara isokratik
Macam-macam detektor
FID (flame ionisation detector) memiliki sensitivitas yang baik untuk senyawa organik
TCD (thermal conductivity detector) memiliki sensitivitas rendah, jarang digunakan
ECD (electron capture detector) digunakan untuk sampel-sampel yang bersifat pembawa elektron
Respon detector terhadap molekul yang punya elektronegativitas
yang tinggi seperti:
halogen, quinon, peroksida, hidrokarbon,gugus nitro, amin, alkohol
FDP (flame photometry detector) fosfor dan sulfur
Kromatografi Cair
Kromatografi cair adalah kromatografi dengan fasa gerak berupa zat cair.
PROSES-PROSES DISTRIBUSI FASA
Adsorpsi
Pertukaran Ion
Partisi Cair - Cair
Adsorpsi adalah proses pemisahan bahan dari suatu campuran dengan cara pengikatan bahan tersebut pada seluruh bagian adsorben cair yang diikuti dengan pelarutan.
Persyaratan adsorben :
Memiliki daya melarutkan bahan yang akan diabsorpsi yang sebesar mungkin (kebutuhan akan cairan lebih sedikit, volume alat lebih kecil).
Selektif
Memiliki tekanan uap yang rendah
Tidak korosif
Mempunyai viskositas yang rendah
Stabil secara termis
Murah
Prinsip Pemisahan Ion
Untuk memisahkan sejumlah anion dan kation satu sama lainnya. Anorganik kation dipisahkan pada kolom resin pemisah kation, sementara anorganik anion dipisahkan pada kolom resin pemisah anion.
Analisa Kualitatif
Dasarnya adalah waktu retensi atau volume retensi suatu senyawa.
Membandingkan t atau V senyawa dalam sampel yang dianalisis dengan t atau V suatu senyawa standar (yang telah diketahui)
Analisis Kuantitatif
Metode pengukuran tinggi puncak
Tinggi puncak suatu kromatogram akan sebanding dengan kadar senyawa yang membentuk kromatogram tersebut. Pengukuran tinggi puncak didasarkan pada rumus pengukuran tinggi suatu segitiga,
yaitu suatu garis tegak lurus dari titik tengah alas kromatogram sampai dengan perpotongan sisi segitiga kromatogram tersebut.
Metode pengukuran luas puncak
Dapat memberikan hasil yang lebih akurat jika dibandingkan dengan cara pengukuran tinggi puncak. Luas puncak diukur seperti menghitung luas segitiga yaitu :
Rumus tersebut memberikan hasil yang baik jika kromatogramnya berbentuk lancip. Cara lain menggunakan rumus :
Jarak relative pada pelarut disebut sebagai nilai Rf. Untuk setiap senyawa berlaku rumus sebagai berikut:
Rf=jarak yang ditempuh oleh senyawa
jarak yang ditempuh oleh pelarut
1.Menggunakan pendarflour
Fase diam pada sebuah lempengan lapis tipis seringkali memiliki substansi yang
ditambahkan kedalamnya, supaya menghasilkan pendaran flour ketika diberikan sinar
ultraviolet (UV).
Pendaran ini ditutupi pada posisi dimana bercak pada kromatogram berada,
meskipun bercak-bercak itu tidak tampak berwarna jika dilihat dengan mata. Ketika
sinar UV diberikan pada lempengan, akan timbul pendaran dari posisi yang berbeda
dengan posisi bercak-bercak. Bercak tampak sebagai bidang kecil yang gelap.
Uap iodium dalam wadah dapat berekasi dengan bercak pada kromatogram, atau
dapat dilekatkan lebih dekat pada bercak daripada lempengan. Substansi yang
dianalisis tampak sebagai bercak-bercak kecoklatan.
Kromatografi Kolom
Kolom kromatografi berkerja berdasarkan skala yang lebih besar menggunakan material terpadatkan pada sebuah kolom gelas vertikal.
Penggunaan kolom
Misalnya memisahkan campuran dari dua senyawa yang berwarna,
yaitu kuning dan biru. Warna campuran yang tampak adalah hijau.
Pertama penutup kran dibuka untuk membiarkan pelarut yang sudah
berada dalam kolom mengering sehingga material terpadatkan rata
pada bagian atas, dan kemudian tambahkan larutan secara hati-hati
dari bagian atas kolom. Lalu buka kran kembali sehingga campuran
berwarna akan diserap pada bagian atas material terpadatkan,
sehingga akan tampak seperti gambar disamping.