genetika adalah ilmu tentang gen dan segala aspeknya.

Istilah “genetika” diperkenalkan oleh

William Bateson

Materi genetic adalah informasi yang terdapat pasda setiap sel makhluk hidup yang dapat
diturunkan pada keturunan berikutnya.Materi genetik makhluk hidup disebut juga dengan istilah
asam nukleat dan juga ada yang mengatakan faktor heriditas. Materi genetik tersusun atas DNA
(Deoxyribonucleic acid) dan RNA (ribonucleic acid). DNA adalah informasi yang berisi sifat-
sifat makhluk hidup, sedangkan RNA merupakan turunan dari DNA, yang terbentuk ketika
informasi DNA akan diterjemahkan dalam bentuk nyata.

DNA (Deoxyribonucleic acid)

Pada eukariota DNA dapat ditemukan dalam nucleus, mitokondria, dan kloroplas. DNA yang
terdapat di nucleus disebut DNA inti sedangkan yang berada di luar nucleus disebut DNA inti
luar inti. Dalam keadaan sel tidak membelah, DNA Nampak sebagai benang-benang yang melilit
protein sehingga Nampak seperti ronce-ronce. Pada saat sel sedang melakukan pembelahan
barulah DNA akan membentuk struktur kromosom. Kromosom adalah molekul DNA yang akan
melilit protein dan saling tumpuk menumpuk dan mampat. DNA tersusun atas dua rantai
membentuk struktur double helix.

Tiap rantai DNA merupakan suatu polinukleotida yang tersusun atas nukleotida yang saling
sambung menyambung. Sebuah nukleotida tersusun atas :

 Gula deoksiribosa, merupakan gula berkarbon 5 atau pentose.

 Fosfat, terikat pada atom C nomor 5 dari gula deoksiribosa
 Basa nitrogen, terikat pada atom C nomor 1 dari gula deoksiribosa.

Basa nitrogen penyusun DNA digolongkan menjadi 2 macam, yaitu basa purin dan basa
pirimidin. Basa purin terdiri atas adenine (A) dan guanine (G), sedangkan basa pirimidin terdiri
atas Sitosin dan timin (T).
Dalam DNA, basa adenine selalu berpasangan dengan basa timin, sedangkan guanine selalu
berpasangan dengan sitosin. Pasangan antara adenine dengan timin terjadi dengan 2 ikatan
hydrogen, sedangkan ikatan antara guanine dengan sitosin terjadi dengan 3 ikatan hydrogen. Hal
ini menyebabkan ikatan antara basa G-S lebih kuat dibandingkan ikatan A-T.

Struktur double helix DNA ditemukan oleh james Watson dan Francis Crick menggunakan
teknik refraksi sinar X pada tahun 1953. DNA dapat dianalogikan sebagai tangga, dengan anak
tangga berupa basa nitrogen dan tiang penyangganya berupa gula deoksiribosa dan fosfat.

RNA (Ribonucleic acid)

RNA merupakan materi genetik selain DNA yang terdapat pada makhluk hidup. Tidak seperti
DNA yang berantai ganda dan double helix, RNA memiliki struktur rantai tunggal. RNA
terbentuk dari DNA melalui proses transkripsi dalam nukleus. RNA dibentuk ketika informasi
dalam DNA akan diterjemahkan dalam bentuk protein penentu sifat.
Perbedaan antara DNA dan RNA adalah sebagai berikut.

DNA
Terdapat dalam nukleus, mitokondria, dan
kloroplas
Berupa rantai ganda yang panjang
Kadarnya dalam sel selalu tetap, tidak
dipengaruhi kecepatan sintesis protein
Gula penyusunnya berupa deoksiribosa
Basa nitrogennya berupa adenine (A), timin
(T), guanine (G), dan sitosin (S)
RNA
Terdapat dalam nukleus, sitoplasma, dan
ribosom
Berupa rantai tunggal yang pendek
Kadarnya dalam sel berubah-ubah,
dipengaruhi kecepatan sintesis protein
Gula penyusunnya berupa ribosa
Posisi timin (T) digantikan oleh urasil (U),
sehingga dalam RNA adenine (A) akan
berpasangan dengan urasil (U)

Dalam tubuh makhluk hidup terdapat beberapa jenis RNA, yaitu:

RNA-m
RNA-m atau singkatan dari RNA messenger adalah RNA yang terbentuk dari hasil transkripsi
DNA dalam nukleus. RNA-m akan dikeluarkan dari nukleus menuju sitoplasma, menempel pada
ribosom untuk selanjutnya terjadi proses translasi. RNA-m disebut juga RNA duta (RNA d).

RNA-t
RNA-t atau singkatan dari RNA transfer adalah RNA yang terdapat pada sitoplasma. RNA-t
memiliki basa nitrogen yang dapat berpasangan dengan basa nitrogen dalam RNA-m. RNA t
mengikat asam amino yang nantinya akan menjadi bahan baku dalam sintesis protein.

RNA-r
RNA-r atau singkatan dari RNA ribosom merupakan RNA yang menyusun organel ribosom.
RNA-r dibentuk dalam nukleolus (anak inti) dikeluarkan menuju sitoplasma, bergabung dengan
protein tertentu untuk membentuk ribosom dan berperan dalam aktivitas sintesis protein.

Setiap spesies memiliki seperangkat unik karakteristik bawaan yang membuat mereka berbeda
dari masing-masing spesies lain. Biasanya karakteristik ini dikodekan dalam DNA (asam
deoksiribonukleat) molekul yang terdapat dalam sel mereka. Sifat gen dan sifat genom bervariasi
dari satu spesies ke spesies lain.
Gen dan genom, kedua istilah yang terkait dengan DNA dan kedua istilah yang didefinisikan
dengan menggunakan molekul DNA. DNA adalah unit dasar hereditas yang terutama ditemukan
pada kromosom dalam inti sel atau dalam organel lainnya.

GENOM

Seluruh rangkaian DNA inti organisme disebut sebagai genom. Genom adalah kandungan DNA
keseluruhan dalam satu sel. Hal ini berlaku bagi banyak organisme, tetapi dalam beberapa virus,
mereka hanya memiliki RNA sehingga genom mereka adalah jumlah total konten RNA. Dalam
biologi molekuler modern, genom adalah seluruh kuantitas informasi keturunan, sehingga
mencakup gen dan urutan DNA / RNA non-koding. Istilah ‘genom’ juga dapat diterapkan untuk
merujuk kepada isi genetik tertentu. Misalnya, kandungan total DNA inti pada sel disebut
‘genom inti’ dan kandungan DNA total mitokondria disebut ‘genom mitokondria’. Selain itu,
genom juga dapat terdiri dari unsur-unsur genetik non-kromosom seperti virus, plasmid dan
unsur yang dapat berpindah.

Studi tentang sifat terkait genom organisme disebut genomik. Evolusi genom dapat diidentifikasi
dengan bantuan komposisi genom, yang meliputi ukuran genom dan proporsi DNA non berulang
dan berulang-ulang. Jika kita mempertimbangkan genom manusia, mengandung 23 kromosom.
Dari 23, hanya satu kromosom yang menentukan jenis kelamin sedangkan sisanya 22 kromosom
adalah kromosom autosomal. Ada sekitar 20.000 sampai 25.000 gen dari genom manusia. Untuk
mengidentifikasi dan memetakan urutan pasangan basa kimia yang membentuk DNA manusia.

Gen adalah unsur hereditas yang menentukan gen yang diwariskan yang ditularkan dari orang
tua ke anaknya dalam reproduksi. Keberadaan gen dan proses transmisi mereka pertama kali
diusulkan oleh Gregor Mendel. Dia disebut gen sebagai ‘faktor’ dan menemukan bahwa
sebagian besar elemen keturunan ditularkan dari orang tua kepada keturunannya. Namun,
Mendel tidak tahu tentang DNA. Kemudian para ilmuwan menemukan DNA sebagai materi
genetik utama yang menentukan dalam organisme.

GEN

Gen terdiri dari bagian DNA tertentu atau segmen. Segmen tertentu mampu mengendalikan
karakteristik keturunan tertentu. Hal ini biasanya dilakukan oleh proses transkripsi DNA dan
translasi DNA. Dalam reproduksi generatif, keturunan memperoleh satu gen dari masing-masing
jenis dari kedua orang tuanya. Bentuk-bentuk yang berbeda dari gen yang dikenal sebagai alel.
Sebuah alel tunggal, atau beberapa alel bertanggung jawab untuk mengendalikan karakteristik
tertentu dalam organisme.

Gen terdiri dari bagian DNA tertentu atau segmen. Segmen tertentu mampu mengendalikan
karakteristik keturunan tertentu. Hal ini biasanya dilakukan oleh proses transkripsi DNA dan
translasi DNA. Dalam reproduksi generatif, keturunan memperoleh satu gen dari masing-masing
jenis dari kedua orang tuanya. Bentuk-bentuk yang berbeda dari gen yang dikenal sebagai alel.
Sebuah alel tunggal, atau beberapa alel bertanggung jawab untuk mengendalikan karakteristik
tertentu dalam organisme.
 Konsep gen dan pola pewarisannya berasal dengan temuan Gregor Mendel pada 1860-an. Studi
tentang sifat-sifat gen atau kelompok gen disebut sebagai genetika. Kebanyakan gen terbuat dari
DNA tetapi beberapa dapat dibuat dari RNA. Beberapa virus terdiri dari gen RNA karena materi
genetik mereka adalah RNA. Pada prokariota, operon terbentuk dengan mengelompokkan gen-
gen yang terkait secara fungsional. Urutan pengkodean protein banyak ditranskripsikan bersama.

Struktur gen eukariotik terutama terdiri dari dua wilayah: urutan pengkodean dan urutan regulasi.
Urutan pengkodean eukariotik terdiri dari ekson, intron dan daerah yang tidak diterjemahkan
sedangkan gen prokariotik tidak memiliki intron. Gen ditranskripsi dengan intron. Akibatnya,
mereka dihapus oleh splicing ekson. Di sisi lain, beberapa protein dapat diproduksi oleh splicing
alternatif. Ekspresi gen diatur pada tingkat transkripsi dan translasi. Variasi gen disebut sebagai
alelnya. Alel-alel yang berbeda dari gen yang sama menghasilkan fenotip yang berbeda di antara
populasi.

Perbedaan antara gen dan genom

1. Gen adalah segmen atau bagian dari molekul DNA sementara genom adalah kandungan total
DNA dalam sel.
2. Gen mengkode untuk protein. Genom itu sendiri tidak dapat mengkode untuk protein karena
mengandung hampir semua DNA. Karena gen ini hanya sebagian dari molekul DNA, bagian
yang cukup untuk kode untuk protein. Hal ini menghasilkan variasi yang luas dari molekul
protein dalam organisme.
3. Genom terdiri dari semua pasangan basa dalam sel. Gen terdiri dari hanya beberapa pasangan
basa karena hanya mewakili segmen DNA.
4. Studi tentang sifat gen yang disebut sebagai ‘genetika’ sementara studi tentang sifat dari genom
yang disebut sebagai ‘genomik’.
5. Secara umum, organisme memiliki satu genom, tetapi memiliki ribuan jutaan gen dalam
organisme tertentu.
Variasi gen yang disebut alel diciptakan oleh mutasi titik. Mutasi titik terjadi pada tingkat
pasangan basa. Di sisi lain, perubahan yang terjadi pada tingkat genom relatif besar. Transfer gen
horizontal dan duplikasi gen memperkenalkan dan meningkatkan produk gen masing-masing.
Oleh karena itu, perbedaan utama antara gen dan genom adalah ukuran nukleotida yang dibawa
oleh mereka.

Semua aktivitas sel dikendalikan oleh aktivitas nukleus. Cara pengendalian ini berkaitan
dengan aktivitas nukleus memproduksi protein, dimana protein ini merupakan penyusun utama
dari semua organel sel maupun penggandaan kromosom. Contoh protein yang dapat dihasilkan
seperti protein struktural yang digunakan sebagai penyusun membran sel dan protein
fungsional (misalnya enzim) yang digunakan sebagai biokatalisator untuk berbagai proses
sintesis dalam sel.
Protein adalah polipeptida (gabungan dari beberapa asam amino). Maka untuk membentuk
suatu protein diperlukan bahan dasar berupa asam amino. Polipeptida dikatakan protein jika
paling tidak memiliki berat molekul kira-kira 10.000. Di dalam ribosom, asam amino-asam
amino dirangkai menjadi polipeptida dengan bantuan enzim tertentu. Polipeptida dapat terdiri
atas 51 asam amino (seperti pada insulin) sampai lebih dari 1000 asam amino (seperti pada
fibroin, protein sutera). Macam molekul polipeptida tergantung pada asam amino penyusunnya
dan panjang pendeknya rantai polipeptida. Seperti yang telah kita pelajari sebelumnya bahwa
ada 20 macam asam amino penting yang dapat dirangkai membentuk jutaan macam
kemungkinan polipeptida.

 Lalu bagaimana sesungguhnya mekanisme pembentukan protein itu?

 Apakah DNA terlibat dalam pembentukan protein?

Sintesis protein melibatkan DNA sebagai pembuat rantai polipeptida. Meskipun begitu, DNA
tidak dapat secara langsung menyusun rantai polipeptida karena harus melalui RNA. Seperti
yang telah kita ketahui bahwa DNA merupakan bahan informasi genetik yang dapat diwariskan
dari generasi ke generasi. Informasi yang dikode di dalam gen diterjemahkan menjadi urutan
asam amino selama sintesis protein. Informasi ditransfer secara akurat dari DNA melalui RNA
untuk menghasilkan polipeptida dari urutan asam amino yang spesifik.
Suatu konsep dasar hereditas yang mampu menentukan ciri spesifik suatu jenis makhluk
menunjukkan adanya aliran informasi bahan genetik dari DNA ke asam amino (protein).
Konsep tersebut dikenal dengan dogma genetik.

Dogma sentral adalah proses ekspresi gen yang mengikuti tahapan-tahapan dalam info genetik
yang terdiri proses dasar replikasi DNA,transkripsi DNA menjadi RNA, dan translasi RNA
menjadi protein atau polipeptida.

Dalam sentral dogma, bahwa semua sel memiliki DNA yang merupakan kode genetik yang dapat
dipergunakan untuk memproduksi protein dengan cara memproduksi mRNA. Perlunya mRNA
dalam produksi protein karena DNA merupakan kode genetik yang sangat berharga sehingga
perlu dibuat salinannya, yaitu dengan proses transkripsi. Setelah diperoleh salinan, maka salinan
tersebut ditranslasi (diterjemahkan) menjadi urutan AA (asam amino).
Tiga proses molekuler utama yang memiliki peranan penting dalam aliran informasi genetik
tersebut adalah replikasi, transkripsi dan translasi. Untuk beberapa spesies virus, di mana materi
genetiknya terdapat dalam bentuk RNA, memerlukan suatu proses yang merupakan kebalikan
dari transkripsi yang disebut reverse transcription. Untuk berlangsungnya tiap proses molekuler
tersebut, diperlukan enzim-enzim tertentu, di antaranya adalah :
 DNA polymerase - mensintesis DNA dari cetakan DNA (DNA template); digunakan untuk
kloning DNA
 DNA ligase - membentuk ikatan kovalen antara ujung-ujung untaian satu rantai DNA yang
bebas saat proses replikasi DNA; digunakan untuk kloning DNA
 Reverse transcriptase - Mensintesis DNA dari cetakan (template) RNA; digunakan untuk
kloning cDNA

REPLIKASI
Proses replikasi DNA adalah proses pengandaan DNA dimana proses ini diperlukan
dalam pembelahan sel. Sebelum proses ekspresi gen, biasanya DNA dilipatgandakan menjadi
lebih banyak. Proses replikasi DNA pada dasarnya adalah 1 double stranded DNA dicopy
menjadi 2 buah, dari 2 buah akan dicopy menjadi 4 buah. Jadi berawal dari denaturasi DNA yang
akan membuka pilinan dari double stranded menjadi single stranded. Kemudian dengan bantuan
sebuah enzim yang disebut DNA polimerase, DNA akan terikat DNA polimerase kemudian copy
DNA terjadi. Melalui prinsip replikasi DNA ini lah PCR (Polymerase Chain Reaction)
dilakukan.
TRANSKRIPSI
Proses replikasi DNA adalah proses pengandaan DNA dimana proses ini diperlukan
dalam pembelahan sel. Sebelum proses ekspresi gen, biasanya DNA dilipatgandakan menjadi
lebih banyak. Proses replikasi DNA pada dasarnya adalah 1 double stranded DNA dicopy
menjadi 2 buah, dari 2 buah akan dicopy menjadi 4 buah. Jadi berawal dari denaturasi DNA yang
akan membuka pilinan dari double stranded menjadi single stranded. Kemudian dengan bantuan
sebuah enzim yang disebut DNA polimerase, DNA akan terikat DNA polimerase kemudian copy
DNA terjadi. Melalui prinsip replikasi DNA ini lah PCR (Polymerase Chain Reaction)
dilakukan.
Sintesis mRNA dari salah satu rantai DNA, yaitu rantai cetakan atau sense. RNA
dihasilkan dari aktivitas enzim RNA polimerase. Enzim ini membuka pilinan kedua rantai DNA
hingga terpisah dan merangkainkan nukleotida RNA dari arah 5’ ke 3’.

INISIASI
Daerah DNA dimana RNA polimerase melekat dan mengawali transkripsi disebut
promoter.Salah satu bagian terpenting dari promoter adalah kotak Pribnow (TATA box). Inisiasi
dimulai ketika holoenzim RNA polimerase menempel pada promotor. Tahapan dimulai dari
pembentukan kompleks promoter tertutup, pembentukan kompleks promoter terbuka,
penggabungan beberapa nukleotida awal, dan perubahan konformasi RNA polimerase karena
struktur sigma holoenzim kompleks dihapus.

ELONGASI
Pilinan heliks ganda DNA terbuka secara berurutan. Setelah sintesis RNA berlangsung,
DNA heliks ganda terbentuk kembali dan molekul RNA baru akan lepas dari cetakan DNA-
nya. Setelah promotor RNA polimerase melekat pada enzim tersebut akan terus bergerak
sepanjang molekul DNA, mengurai dan meluruskan heliks tersebut. Dalam pemanjangan,
nukleotida ditambahkan secara kovalen pada ujung 3 ‘molekul RNA yang baru
dibentuk. Misalnya, DNA template nukleotida A, maka nukleotida RNA yang ditambahkan
adalah U, dan seterusnya. Pemanjangan maksimum tingkat molekul transkrip RNA berrkisar
antara 30-60 nukleotida per detik. Pemanjangan kecepatan tidak konstan.

TERMINASI
RNA polimerase mencapai titik akhir

TRANSLASI
Proses mRNA mengarahkan serangkaian asam amino dan sintesis protein.

INISIASI
Terjadi dengan adanya mRNA, sebuah RNAt yang memuat asam amino pertama dari
polipeptida dan 2 subunit RNAr. Pertama, subunit ribosom kecil mengikatkan diri pada RNAd
dan RNAt inisiator. Pada mRNA terdapat kodon inisiasi AUG (start codon), yang memberi
sinyal dimulainya proses translasi. RNAt inisiator yang membawa asam amino metionin,
melekat pada kodon inisiasi AUG.
ELONGASI
Asam amino-asam amino berikutnya ditambahkan satu persatu pada asam amino pertama
(metionin). Molekul RNAr dari subunit ribosom besar berfungsi sebagai enzim, yaitu
mengkatalis pembentukan ikatan peptida yang menggabungkan polipeptida yang memanjang ke
asam amino yang baru tiba.

TERMINASI
Elongasi berlanjut terus hingga ribosom mencapai kodon stop (UAA, UAG, atau UGA).
Kodon stop hanya bertindak sebagai sinyal untuk menghentikan translasi. Akhirnya, rantai
protein terbentuk.

REPLIKASI DNA
Replikasi DNA merupakan tahapan penting yang mengawali proses mitosis dan meiosis. Secara
umum, replikasi DNA merupakan proses pengkopian rangkaian molekul DNA indukan sehingga
dihasilkan molekul anakan yang indentik. Terdapat 3 model hipotesis replikasi DNA, yaitu :

1. Model konservatif
2. Model dispersive
3. Model semi konservatif

Pada tahun 1958 mattew maselson berhasil membuktikan bahwa replikasi DNA berlangsung
dengan mekanisme semi konservatif. Model semikonservatif menggambarkan bahwa untaian
molekul DNA anakan (baru) terdiri dari pasangan untai DNA induk dan DNA anakan. Untai
DNA anakan akan dibentuk dari arah 5’-3’ secara komplementer berdasarkan untai DNA
induk sebagai template. Secara ringkas, proses replikasi DNA akan dibagi ke dalam 5 tahapan
yaitu :
1. Denaturasi
Sebelum replikasi dimulai, DNA akan mengalami perubahan struktur yang
memungkinkan terjadinya proses replikasi. Denaturasi akan berawal dari titik yang
disebut ori (origin of replication) yang ditandai adanya buble of replication, pembukaan
ikatan hydrogen yang menyebabkan pembukaan untaian DNA induk akan membentuk
suatu struktur yang disebut garpu replikasi (replication fork). Dari awalan garpu replikasi
inilah DNA induk sebagai template akan terbuka secara bertahap dan kemudian
direplikasi.

Untaian DNA induk akan mengalami denaturasi yaitu proses pemutusan ikatan hydrogen
antara basa-basa nitrogen penyusun DNA, ikatan hidrogen A-T dan G-C akan diputuskan
melalui proses enzimatik oleh enzim girase pada prokariot, sedangkan pada eukariot oleh
enzim helicase, selama pembukaan ikatan hidrogen ini supaya molekul DNA tidak tegang
maka diperlukan bantuan enzim topoisomerase untuk melonggarkan lilitan DNA induk.
Setalah untaian DNA induk terbuka maka agar untai yang telah terbuka tidak berikatan
kembali maka untai DNA induk akan diikat oleh protein SSB (Single Strand Binding).

Pembukaan Untai DNA

 Kedua untai DNA anakan disintesis dengan arah geometris yang berlawanan, satu untai
DNA anakan dibentuk searah pembukaan garpu replikasi yang menjadi untai kontinu
(Leading strand), sedangkan satu untai diskontinu (lagging Strand) menghasilkan berupa
fragmen-fragmen yang disebut fragmen Okazaki
2. Inisiasi
Proses inisasi atau pengawalan dimulai dari titik ori. Pada prokariotik hanya diperlukan
satu titik ori, sedangkan pada eukariot diperlukan banyak titik ori. Titik ori ditandai
dengan susunan 245 pb yang mengandung urutan nukleotida TTATCCACA sebanyak 4
kali.
Untuk memulai polimerisasi untai DNA anakan diperlukan primer, yaitu suatu molekul
yang digunakan untuk mengawali proses polimerisasi untai DNA baru. Molekul primer
dapat berupa DNA, protein spesifik, atau RNA. RNA Primer terdiri dari untaian 10-12
nukleotida yang disintesis oleh RNA polymerase sedangkan pada E.Coli, sintesis RNA
primer dilakukan oleh kompleks protein yang disebut primosom yang terdiri atas enzim
khusus yang disebut primase.
Primer yang telah disintesis kemudian menempel (anneal) pada DNA induk yang
menjadi template. Molekul primer ini digunakan untuk awalan polimerisasi untai DNA
anakan yang komplementer dari untai DNA induk. Pada leading strand hanya diperlukan
1 primer, sedangkan pada lagging strand diperlukan banyak primer.
3. Elongasi
Aktivitas elongasi ditandai dengan adanya polimerisasi untai DNA anakan yang dimulai
dari primer, rangkaian nukleotida pada untai anakan bersifat komplementer dengan untai
DNA induk. Aktivitas polimerisasi ini akan berlangsung dari arah 5’->3’

Polimerisasi DNA

Pada tahap ini diperlukan dNTP yaitu molekul deoksiribonukleotida trifosfat yang terdiri
dari dATP, dTTP,dGTP,dCTP sebagai bahan monomer untuk pembentukan polimer untai
DNA anakan. Proses polimerisasi monomer dNTP akan dibantu dengan enzim DNA
polymerase.
 DNA polymerase berperan merangkai untai DNA baru pada leading strand membentuk
untai kontinu dan pada lagging strand membentuk untai diskontinu yang disebut fragmen
okazaki. Untaian DNA baru terbentuk dari dNTP yang merupakan precursor. Nukleotida
dari dNTP membentuk pasangan basa dengan nukleotida komplementer pada untai
cetakan, membentuk ikatan ester pada ujung 3’-hidroksil bebas di ujung rantai yang
sedang tumbuh, dan pirofosfat dilepaskan.

Polimerisasi DNA

Pelepasan pirofosfat dan pemutusan selanjutnya oleh pirofosfatase menghasilkan energy

yang mendorong proses polymerase lebih lanjut. Ada beberapa perbedaan system
replikasi DNA eukariot dengan prokariot. Pada prokariot, DNA polymerase terdiri atas
tiga jenis yaitu DNA polymerase I, DNA polymerase II, dan DNA polymerase III.
Sedangkan pada eukariot, enzim DNA polymerase terdiri atas 5 jenis yaitu DNA
polymerase α, β, ε, ϒ, δ.
Pada prokariot DNA polymerase III lah yang berperan dalam proses polimerisasi.
Sedangkan pada eukariot yang berperan dalam polimerisasi adalah DNA polymerase α
dan ϒ (pada mtDNA). Proses replikasi akan berlangsung secara bidireksional. Sedangkan
DNA polymerase lainnya berperan dalam proses reparasi DNA.
4. Ligasi
Pada fragmen okazaki DNA polymerase akan terdisosiasi ketika bertemu dengan ujung
5’P-RNA primer. Sedangkan pada leading strand baru akan terdisoasi pada titik
terminasi. Bagian RNA primer pada fragmen okazaki selanjutnya akan didegredasi oleh
enzim DNA polymerase I.
 Fragmen Okazaki

Maka untuk menyambungkan antar fragmen tersebut menjadi untai yang kontinu
diperlukan sebuah sambungan dengan bantuan enzim ligase.
5. Terminasi
Pada prokariot, replikasi genom berbentuk lingkar berakhir pada waktu kedua garpu
replikasi bertemu pada suatu titik. Titik tempat pengakhiran replikasi disebut sisi
terminasi yang ditandai dengan urutan AATTAGTATGTTGTAACTAANT, urutan ini
diperlukan untuk menghentikan garpu replikasi yang mendekati daerah tersebut dari
ujung 5’.
Pada eukariot, replikasi genom berbentuk linier. Urutan consensus sisi terminasi pada
vertebrata termasuk manusia adalah TTAGGG/AATTCCC. Pada saat menjelang akhir
replikasi, kedua untai DNA hasil replikasi masih saling berlilitan, maka harus segera
dipisahkan sehingga dapat diturunkan kesel anakan.

PEMBENTUKAN LEADING STRAND

Pembentukan leading strand dimulai pada saat penempelan RNA primer pada DNA induk
sebagai tenplate, untai ini merupakan untai anakan yang dibentuk secara kontinu mengikuti arah
pembukaan garpu replikasi, untai ini akan terbentuk dari arah 5’->3’

PEMBENTUKAN LAGGING STRAND

Pembentukan lagging strand dimulai pada saat penempelan RNA primer pada DNA induk
sebagai tenplate, untai ini merupakan untai anakan yang dibentuk secara diskontinu yang
berlawanan arah dengan pembukaan garpu replikasi, untai ini akan terbentuk dari arah 5’->3’
menghasilkan fragmen-fragmen yang disebut fragmen okazaki. Fragmen okazaki akan
disambungkan menjadi sebuah untai DNA anakan yang kontinu setelah RNA primer didegredasi
oelh enzim DNA polymerase I, adanya celah antar fragmen akan disambungkan dengan bantuan
enzim ligase, enzim ini akan membuat jembatan ikatan antara ujung 3’-OH dan 5’P membentuk
ikatan fosfodiester, sehingga terbentuk untai anakan yang bersambung.

TRANSFER DNA

Transfer DNA atau perpindahan DNA ke dalam bakteri dapat melalui tiga cara yaitu konjugasi,
transformasi, dan transduksi.

1. Transformasi

Transformasi merupakan peristiwa dimana bakteri memperoleh DNA dari lingkungan

sekitarnya. Permukaan sel bakteri memiliki protein yang dapat mengenali DNA dari jenis
yang masih berkerabat kemudian mentransport DNA tersebut masuk ke dalam sel. Di
dalam sel, DNA asing tersebut akan menyatu dengan DNA inang dan menyebabkan
perubahan pada struktur DNA awal. Perubahan struktur DNA ini akan menyebabkan
perubahan sifat bakteri tersebut.

Contoh peristiwa ini adalah ketika bakteri Streptococcus pneumoniae strain yang tidak
berbahaya dibiakkan dalam medium yang di dalamnya terkandung DNA dari
Streptococcus penumoniae yang berbahaya. Bakteri strain tidak berbahaya tersebut akan
menyerap DNA yang ditemukannya, menyatukannya dengan DNA yang dimilikinya
sehingga terjadi rekombinasi DNA. Setelah terjadi rekombinasi, strain yang tadinya tidak
berbahaya tadi akan berubah menjadi strain berbahaya dan dapat mengakibatkan penyakit
pneumonia.

2. Transduksi
Transduksi merupakan peristiwa dimana bakteri memperoleh DNA dari bakteriofag yang
menginfeksinya. Bakteriofag merupakan virus yang menyerang bakteri. Virus ini akan
menyerang dengan cara menyuntikkan materi genetik ke dalam sel bakteri. Dalam kasus
transduksi virus menyuntikkan DNA virus juga menyuntikkan DNA bakteri lain yang
diperoleh setelah virus tersebut berkembang dalam sel bakteri lain. DNA asing yang
disuntikkan tersebut akan menyatu dengan DNA bakteri dan menyebabkan terjadinya
rekombinasi genetik.

Tidak semua bakteri yang diserang virus akan lisis dan mati. Bila virus melakukan
reproduksi secara lisogenik yang terjadi hanyalah materi genetik virus yang ikut
mengganda ketika sel bakteri membelah diri. Sehingga dalam tahap ini dapat terjadi
rekombinasi DNA yang menyebabkan terjadinya variasi pada DNA bakteri tersebut.

3. Konjugasi

Konjugasi merupakan proses transfer DNA dari satu bakteri menuju bakteri yang
lain. Jadi konsepnya adalah satu bakteri memberikan DNA sedangkan bakteri
lainnya menerima DNA tersebut. Transfer DNA tersebut terjadi melalui
terbentuknya jembatan antar 2 bakteri yang disebut pilus. DNA akan berjalan
melalui pilus tersebut sehingga bisa sampai pada bakteri penerima. Setelah
sampai di bakteri penerima, DNA tersebut akan menyatu sehingga terjadi
rekombinasi.
 Konjugasi merupakan proses transfer DNA dari satu bakteri menuju bakteri yang
lain. Jadi konsepnya adalah satu bakteri memberikan DNA sedangkan bakteri
lainnya menerima DNA tersebut. Transfer DNA tersebut terjadi melalui
terbentuknya jembatan antar 2 bakteri yang disebut pilus. DNA akan berjalan
melalui pilus tersebut sehingga bisa sampai pada bakteri penerima. Setelah
sampai di bakteri penerima, DNA tersebut akan menyatu sehingga terjadi
rekombinasi.

MUTASI

Mutasi berasal dari kata Mutatus (bahasa latin) yang artinya adalah perubahan. mutasi
didefenisikan sebagai perubahan materi genetic (DNA) yang dapat diwariskan secara
genetis keketurunannya. Istilah mutasi petama kali digunakan oleh Hugo de Vries, untuk
mengemukakan adanya perubahan fenotipe yang mendadak pada bunga Oenothera
lamarckiana dan bersifat menurun. Ternyata perubahan tersebut terjadi karena adanya
penyimpangan dari kromosomnya. Seth wright juga melaporkan peristiwa mutasi pada
domba jenis Ancon yang berkaki pendek dan bersifat menurun. Penelitian ilmiah tentang
mutasi dilakukan pula oleh Morgan (1910) dengan menggunakan Drosophila
melanogaster (lalat buah). Akhirnya murid Morgan yang bernama Herman Yoseph
Muller berhasil dalam percobaannya terhadap lalat buah, yaitu menemukan mutasi buatan
dengan menggunakan sinar X (Anonim, 2009). Mutasi adalah perubahan pada materi
genetik suatu makhluk yang terjadi secara tiba-tiba, acak, dan merupakan dasar bagi
sumber variasi organisme hidup yang bersifat terwariskan (heritable). Mutasi juga dapat
diartikan sebagai perubahan struktural atau komposisi genom suatu jasad yang dapat
terjadi karena faktor luar (mutagen) atau karena kesalahan replikasi. Peristiwa terjadinya
mutasi disebut mutagenesis. Makhluk hidup yang mengalami mutasi disebut mutan dan
factor penyebab mutasi disebut mutagen (mutagenic agent). Perubahan urutan nukleotida
yang menyebabkan protein yang dihasilkan tidak dapat berfungsi baik dalam sel dan sel
tidak mampu mentolerir inaktifnya protein tersebut, maka akan menyebabkan kematian
(lethal mutation). Mutasi dapat mempengaruhi DNA maupun kromosom. DNA dapat
dipengaruhi pada saat sintesis DNA (replikasi). Pada saat tersebut factor mutagenic
mempengarugi pasangan basa nukleutida sehingga tidak berpasangan dengan basa
nukleutida yang seharusnya (mismatch). Misalnya triplet DNA cetakan adalah TTA.
Namun karena adanya mutagen menyebabkan DNA polymerase memasangkan A dengan
C, bukan dengan T . Untuk lebih jelasnya mekanisme mutasi dapat dilihat pada gambar di
bawah ini:

A. Jenis-jenis Mutasi

1. Menurut Kejadiannya

Mutasi dapat terjadi secara spontan (spontaneous mutation) dan juga dapat
terjadi melalui induksi (induced mutation). Mutasi spontan adalah mutasi
(perubahan materi genetik) yang terjadi akibat adanya sesuatu pengaruh
yang tidak jelas, baik dari lingkungan luar maupun dari internal organisme
itu sendiri. Sedangkan mutasi terinduksi adalah mutasi yang terjadi akibat
paparan dari sesuatu yang jelas, misalnya paparan sinar UV. Secara
mendasar tidak terdapat perbedaan antara mutasi yang terjadi secara alami
dan mutasi hasil induksi. 2.Berdasarkan Sel yang Bermutasi

2. Berdasarkan sel yang bermutasi

Berdasarkan jenis sel yang mengalami mutasi, mutasi dibedakan atas

mutasi somatik dan mutasi gametik atau germinal. Mutasi somatik adalah
mutasi yang terjadi pada sel-sel somatik. Sedangkan mutasi gametik atau
germinal adalah mutasi yang terjadi pada sel gamet. Mutasi somatik dapat
diturunkan dan dapat pula tidak diturunkan. Sedangkan mutasi gametik,
karena terjadinya di sel gamet, maka akan diwariskan oleh keturunannya.
3.Berdasarkan Bagian yang Bermutasi Berdasarkan bagian yang
bermutasi, mutasi dibedakan menjadi mutasi DNA, mutasi gen dan mutasi
kromosom.

MUTASI DNA

Terdiri atas :

1. Mutasi transisi

yaitu suatu pergantian basa purin dengan basa purin lain atau pergantian basa
pirimidin dengan basa pirimidin lain; atau disebut juga pergantian suatu pasangan
basa purin-pirimidin dengan pasangan purin-pirimidin lain. Misalnya: ATdan GS,
GS dan AT, SG dan TA.
2. Mutasi transversi

yaitu suatu pergantian antara purin dengan pirimidin pada posisi yang sama.
Seperti tampak pada gambar di bawah ini

3. Insersi

penambahan satu atau lebih pasangan nukleotida pada suatu gen. seperti tampak
pada gambar di bawah ini

4. Delesi

Delesi terjadi jika suatu bagian atau segmen dari kromosom hilang. Jika bagian
segmen yang hilang tersebut pindah ke kromosom homolognya, disebut duplikasi.
Disebut duplikasi karena pada kromosom homolog yang menerima patahan
terjadi penggandaan gen-gen.
Silent mutation

Perubahan suatu pasangan basa dalam gen (pada posisi 3 kodon) yang
menimbulkan perubahan satu kode genetik tetapi tidak mengakibatkan perubahan
atau pergantian asam amino yang dikode. Mutasi diam biasanya disebabkan
karena terjadinya mutasi transisi dan transversi.

Genetic rearrangement

Adalah mutasi yang merupakan jenis kelainan kromosom yang melibatkan

struktur kromosom asli. Perubahan semacam ini mungkin melibatkan
beberapa kelas peristiwa yang berbeda, seperti penghapusan, duplikasi,
inversi, dan translokasi. Biasanya peristiwa peristiwa ini disebabkan oleh
kerusakan pada heliks ganda DNA di dua lokasi yang berbeda, diikuti oleh
rejoining dari ujung yang putus untuk meghasilkan susunan gen kromosom
baru, berbeda dari urutan gen kromosom sebelum mereka rusak.

Variasi
 Berasal dari mutasi bahan genetika, migrasi antar populasi (aliran gen), dan
perubahan susunan gen melalui reproduksi seksual.variasi juga dating dari
tukar ganti gen antara spesies yang berbeda, contohnya melalui transfer gen
horizontal pada bakteria dan hibridisasi pada tanaman. Walaupun terdapat
variasi yang terjadi secara terus menerus melalui proses-proses ini,
kebanyakan genom spesies adalah identic pada seluruh individu spesies
tersebut. Namun perubahan kecil pada genotipe dapat mengakibatkan
perubahanyang dramatis pada fenotipenya. Misalnya simpase dan manusia
hanya berbeda pada 5% genomnya.

Bahan bahan penyebab mutasi disebut MUTAGEN. Mutagen dibagi menjadi 3 :

1. Mutagen bahan kimia

Contohnya adalah kolkisin dan zat digitonin. Kolkisin adalah zat yang dapat
menghalangi terbentuknya benang benang spindle pada proses anafase dan dapat
menghambat pembelahan sel pada anaphase.

2. Mutagen bahan fisika

Contohnya sinar ultraviolet, sinar radioaktif, dll. Sinar ultraviolet dapat

menyebabkan kanker kulit.

3. Mutagen bahan biologi

Diduga virus dan bakteri dapat menyebabkan terjadinya mutasi. Bagian virus
yang dapat menyebabkan terjadinya mutasi adalah DNA-nya.

Macam macam mutasi berdasarkan bagian yang mengalami mutasi

1. Mutasi titik (Mutasi Gen)

Mutasi titik merupakan perubahan pada basa N dari DNA atau RNA. Mutasi titik
relatif sering terjadi namun efeknya dapat dikurangi oleh mekanisme pemulihan
gen. Mutasi titik dapat berakibat berubahnya urutan asam amino pada protein, dan
dapat mengakibatkan berkurangnya, berubahnya atau hilangnya fungsi enzim.
Teknologi saat ini menggunakan mutasi titik sebagai marker (disebut SNP) untuk
mengkaji perubahan yang terjadi pada gen dan dikaitkan dengan perubahan
fenotipe yang terjadi. Contoh mutasi gen adalah reaksi asam nitrit dengan
adenine menjadi zat hypoxanthine. Zat akan menempati tempat adenine asli dan
berpasangan dengan sitosin, bukan lagi dengan timin.
 2. Aberasi (Mutasi Kromosom)

Mutasi kromosom sering juga disebut dengan mutasi besar/gross mutation atau
aberasi kromosom adalah perubahan jumlah kromosom dan susunan atau urutan
gen dalam kromosom. Mutasi kromosom sering tejadi karena kesalahan meiosis
dan sedikit dalam mitosis.

Aneuploidy adalah perubahan jumlah n-nya dibagi menjadi 2, yaitu:

Allopoliploidi->yaitu n-nya mengganda sendiri karena kesalahan meiosis.

Autopoliploidi->yaitu perkawinan atau hybrid antara spesies yang berbeda jumlah

set kromosomnya.

Aneusomi adalah perubahan jumlah kromosom. Penyebabnya adalah anaphase

lag (peristiwa tidak melekatnya benang benang spindle ke sentromer) dan non
disjunctions (gagal berpisah).

DNA repair

DNA sebagai materi genetic yang selalu mengalami berbagai reaksi kimia dan selalu
melakukan kopi DNA. Perubahan struktur DNA ini disebut mutasi DNA yang dapat
terjadi pada saat proses replikasi DNA. Untuk menstabilkan hal tersebut maka DNA
memiliki kemampuan untuk memperbaiki (repair) kesalahan yang terjadi pada dirinya
sendiri. Jika mutasi DNA yang terjadi cukup banyak dan DNA tidak sempat untuk
memperbaiki (repair) dirinya sendiri maka akan terjadi kelainan ekspresi genetik bahkan
menyebabkan terjadinya penyakit genetic. Konsumsi makanan yang bergizi serta istirahat
yang cukup memungkinkan tubuh untuk dapat melakukan repair DNA.

DNA repair merupakan suatu mekanisme perbaikan DNA yang mengalami

kerusakan/kesalahan yang diakibatkan oleh proses metabolism yang tidak normal, radiasi
dengan sinar UV, radiasi ion, radiasi dengan bahan kimia, atau karena adanya kesalahan
dalam replikasi DNA. Mekanisme perbaikan yang terdapat ditingkat selular secara garis
besar disesuaikan dengan jenis kerusakan yang tentu saja terkait erat dengan faktor
penyebabnya. Sel sel menggunakan mekanisme-mekanisme perbaikan DNA untuk
memperbaiki kesalahan-kesalahan pada sekuens basa molekul DNA. Kesalahan dapat
terjadi saat aktivitas selular normal, ataupun diinduksi. DNA merupakan sasaran untuk
berbagai kerusakan baik eksternal agent maupun secara spontan.

Apabila ada kesalahan/kerusakan DNA, sel mempuyai dua pilihan :

1. Kesalahan tersebut diperbaiki dengan cara mengaktifkan DNA repair. Namun
apabila kesalahan yang ada sudah tidak mampu lagi ditanggulangi, sel
memutuskan untuk berdalih ke pilihan kedua.
2. Apabila DNA tidak mampu diperbaiki lagi, akibat dari adanya kesalahan yang
fatal maka akan dimatikan daripada hidup membawa pengaruh yang buruk bagi
lingkungan sekelilingnya. Kemudian sel dengan DNA yang normal akan
meneruskan perjalanan untuk melengkapi siklus yang tersisa yaitu S (sintesis)
G2(Gap 2) dan M(Mitosis).

Proses perbaikan DNA itu harus melibatkan berbagai macam komponen, yang sangat
berperan penting dalam mekanisme perbaikan DNA tersebut. Komponen-komponen
yang terlibat dalam mekanisme perbaikan DNA dapat dijelaskan secara rinci pada
penjelasan berikut ini.

Komponen yang terlibat dalam proses DNA Repair

Mekanisme DNA repair

Pada dasarnya perbaikan DNA dapat dikelompokkan menjadi 3 yaitu :

1. Damage reversal :

Penggantian secara langsung, photoreactivation merupakan cara perbaikan DNA

dengan melibatkan pembuangan atau pembalikan DNA yang rusak oleh sebuah
enzim tunggal yang tergantung oleh cahaya. Pada bakteri E. coli enzim itu
dikodekan oleh gen phr. Adanya kerusakan pada suatu segmen pirimidin (timin
dan sitosin) yang telah berpasangan (dimer) pada suatu struktur DNA, akan
 mengaktifkan suatu proses perbaikan dimana suatu kompleks protein enzim
fotoreaktif akan memutuskan ikatan hidrogen tetapi tanpa memutuskan ikatan
fosfodiester antar nukleotida. Perubahan urutan akan diperbaiki dengan
pergantian sesame nukleotida dengan basa pirimidin, dan akan diikuti proses
penangkupan kembali celah yang semula tercipta.

2. Damage removal

Proses ini lebih kompleks karena melibatkan replacing atau penggantian dengan
dipotong potong. Pada excision repair diawali dengan proses pengindentifikasian
ketidaksesuain sekuen/urutan DNA dalam suatu proses pengawasan yang
dilakukan oleh endonuclease perbaikan sekuen/urutan DNA dalam suatu proses
pengawasan yang dilakukan oleh endonuclease perbaikan DNA. Kompleks enzim
tersebut akan menginisiasi proses pemisahan DNA heliks utas ganda menjadi
suatu segmen utas tunggal. Proses ini akan diakhiri dengan pertautan kembali
antara dua utas tunggal menjadi suatu segmen utas tunggal. Proses ini akan
diakhiri dengan pertautan kembali antara dua utas tunggal tersebut untuk kembali
menjadi bagian dari heliks utas ganda, dengan perantaraenzim DNA ligase.

3. Damage tolerance

Mentoleransi kesalahan. Hal ini dilakukan bila kesalahan tidak dapat diperbaiki
sehingga kesalahan terpaksa ditoleransi dan yang memperbaiki adalah kedua
strand. Mekanisme ini adalah sebentuk replikasi sekuens basa awal. Tipe
perbaikan ini bisa dipicu oleh kerusakan pada DNA tanpa mengembalikan
sekuens basa awal. Tipe perbaikan ini bisa dipicu oleh kerusakan-kerusakan pada
DNA dalam tingkat tinggi. Pada bakteri E.coli, system tersebut diatur oleh gen
gen recA dan umu yang dihipotesiskan mengubah fidelitas (ketepatan) polymerase
DNA setempat. Dalam rose situ, polymerase melakukan replikasi melewati
kerusakan DNA, sehingga memungkinkan sel untuk bertahan hidup atau sintas.
Jika sel tersebut berhasil sintas melalui seluruh kerusakan DNA, besar
kemungkinan sel itu mengandung satu atau lebih mutasi.

Ada 3 tipe damage removal yaitu

1. Basa excision repair

hanya 1 basa yang rusak dan digantikan dengan yang lain. Basa basa DNA yang
dapat dirusak melalui deaminasi. Tempat kerusakan basa tersebut dinamakan
dengan “Abasic site” atau “AP site”. Pada E.Coli enzim DNA glycosilase dapat
mengenal AP site dan membuang basanya. Kemudian AP endonuclease
 membuang AP site dan nukleotida sekitarnya. Kekosongan akan diisi dengan
bantuan DNA Polymerase I dan DNA polymerase I berperan dididalam
mensintesis atau menambahkan pasangan basa yang sesuai dengan pasangan
sedangkan DNA ligase berperan dalam menyambungkan pasangan basa yang
telah disintesis oleh DNA polymerase I.

2. Nucleotide excision repair

Adalah memotong pada bagian/salah satu segmen DNA,dari DNA yang

mengalami kerusakan. Kerusakan nukleotida yang disebabkan oleh sinar UV,
sehingga terjadi kesalahan pirimidin dimer (kesalahan dua basa tetangga). Pada E
Coli terdapat protein yang terlibat dalam proses pembuangan atau pemotongan
DNA yang mengalami kerusakan, protein tersebut adalah UVr,UVB,UVrC,
setelah protein tersebut mengenali kesalahan, maka nukleotida yang rusak
tersebut dihilangkan (dipotong) sehingga terjadi kekosongan pada segmen untaian
nukleotida tersebut. Selanjutnya untuk mrngisi kekosongan tersebut maka RNA
polymerase I mensintesis nukleotida yang baru untuk dipasangkan pada segmen
DNA yang mengalami kekosongan tadi, tentu saja dengan bekerja sama dengan
DNA ligase dalam proses penyambungan segmen DNA tersebut.
3. Mismatch repair

Pada tahap ini yaitu memperbaiki kesalahan kesalahan yang terjadi ketika DNA
disalin. Selama replikasi DNA, DNA polymerase sendirilah yang melakukan
perbaikan pasang. Polymerase ini mengkoreksi setiap nukleotida terhadap
cetakannya begitu nukleotida ditambahkan pada untaian. Dalam rangka mencari
nukleotida hang pasangannya tidak benar, polymerase memindahkan nukleotida
tersebut kemudian melanjutkan kembali sintesis ( tindakan ini mirip dengan
mengkoreksi kesalahan pada pengolah kata dengan menggunakan tombol “delete”
dan kemudian menuliskan kata yang benar). Protein protein lain selain DNA
polymerase juga melakukan perbaikan salah pasang. Para peneliti mempertegas
pentingnya protein protein tersebut ketika mereka menemukan bahwa suatu cacat
herediter pada salah satu dari protein protein ini terkait dengan salah satu bentuk
dari kanker usus besar. Rupanya cacat ini mengakibatkan kesalahan penyebab
kanker yang berakumulasi didalam RNA. Pada intinya mekanisme perbaikan
mismatch ini mendeteksi terlebih dahulu pasangan basa yang tidak cocok
(matched) atau tidak berpasangan dengan benar. Kesalahan berpasangan basa atau
mismatch dapat terjadi saat replikasi ataupun rekombinasi DNA, dimana untuk
memperbaiki basa yang tidak berpasangan, terlebih dahulu harus diketahui
pasangan basa yang salah dibuang. Sehingga terdapat celah (gap) didalam untai
DNA. Selanjutnya dengan bantuan enzim polymerase celah ini akan diisi oelh
segmen baru yang membawa basa yang telah diperbaiki, yang kemudian
dilekatkan dengan bantuan enzim lipase
Genetic code
Kode genetik adalah seperangkat aturan di mana informasi yang dikodekan dalam materi genetik
(DNA atau sekuens RNA) diterjemahkan ke dalam protein (urutan asam amino) oleh sel-sel
hidup.
Secara khusus, kode mendefinisikan pemetaan antara sekuens tri-nukleotida yang disebut kodon
dan asam amino; setiap triplet nukleotida dalam urutan asam nukleat menentukan asam amino
tunggal.
Karena sebagian besar gen dikodekan dengan kode yang persis sama, kode khusus ini sering
disebut sebagai kode genetik kanonik atau standar, atau hanya kode genetik, meskipun
sebenarnya ada banyak kode varian; dengan demikian, kode genetik kanonik tidak universal.
Sebagai contoh, pada manusia, sintesis protein di mitokondria bergantung pada kode genetik
yang bervariasi dari kode kanonik. Genom dari suatu organisme tertulis dalam DNA, atau pada
beberapa virus RNA.
Bagian dari genom yang mengkode protein atau RNA disebut sebagai gen.
Gen-gen yang mengkode protein ini terdiri dari unit tri-nukleotida yang disebut kodon, masing-
masing mengkodekan asam amino tunggal.
Setiap sub-unit nukleotida terdiri dari fosfat, gula deoksiribosa dan salah satu dari 4 basa
nukleotida nitrogen.
Basa purin adenin (A) dan guanin (G) lebih besar dan terdiri dari dua cincin aromatik.
Basa pirimidin cytosine (C) dan thymine (T) lebih kecil dan hanya terdiri dari satu cincin
aromatik.
Dalam konfigurasi double-helix, dua untai DNA bergabung satu sama lain oleh ikatan hidrogen
dalam pengaturan yang dikenal sebagai pasangan basa. katan ini hampir selalu terbentuk antara
basa adenin pada satu untai dan timin pada untaian lainnya dan antara basa sitosin pada satu
untai dan guanin di sisi lainnya.
Ini berarti bahwa jumlah residu A dan T akan sama pada heliks ganda yang diberikan seperti
halnya jumlah residu G dan C.
Dalam RNA, timin (T) digantikan oleh urasil (U), dan deoksiribosa digantikan oleh ribosa.
Gene regulation
Regulasi gen adalah istilah informal yang digunakan untuk menggambarkan setiap mekanisme
yang digunakan oleh sel untuk menambah atau mengurangi produksi produk gen tertentu
(protein atau RNA). Sel dapat memodifikasi pola ekspresi gen mereka untuk memicu jalur
perkembangan, menanggapi rangsangan lingkungan, atau beradaptasi dengan sumber makanan
baru. Semua poin ekspresi gen dapat diatur. Ini termasuk transkripsi, pengolahan RNA dan
transportasi, terjemahan dan modifikasi pasca-translasi protein, dan degradasi mRNA.
Operon adalah bagian dari materi genetik (atau DNA) yang bertindak sebagai unit yang diatur
tunggal yang memiliki satu atau lebih gen struktural, gen operator, gen promotor, gen regulator,
represor dan inducer atau corepressor (dari luar). Operator, promotor dan gen regulator
merupakan wilayah regulasi.
Sistem operasi umum dalam prokarytoes. Operon opera- lon pertama ditemukan oleh Jacob dan
Monad (1961). Kemudian sejumlah operon seperti itu ditemukan, misalnya, trp-operon, ara-
operon, operon-nya,vol-operon. Operasi terdiri dari dua jenis, dapat diinduksi dan direplikasi.

Sistem operon yang dapat diinduksi adalah unit materi genetik yang diatur yang diaktifkan
sebagai respons terhadap keberadaan bahan kimia. Ini terdiri dari bagian-bagian berikut:
Gen Struktural:
Adalah gen-gen yang sebenarnya mensintesis mRNA. Sebuah mRNA mengontrol aktivitas
metabolik sitoplasma melalui pembentukan protein atau enzim di atas ribosom.Operon memiliki
satu atau lebih gen struktural. Mereka mentranskripsikan molekul mRNA poiycistronic yang
membantu dalam sintesis tiga enzim-P-galactosidase untuk menghidrolisis laktosa atau
galactoside, laktosa atau galactoside permease untuk memungkinkan masuknya laktosa dari luar
dan thiogalactoside acetylase atau transacetylase untuk metabolising thiogalactosides beracun
yang juga diperbolehkan masuk oleh permease laktosa.
Ketiga enzim tersebut, bagaimanapun, diproduksi dalam konsentrasi molar yang berbeda.Tingkat
ekspresi lakon yang sangat rendah dan akibatnya enzim-enzimnya selalu ada.Masuknya laktosa
ke dalam bakteri hanya akan terjadi karena kegiatan ini.

Operator Gene:
Ini adalah gen yang secara langsung mengontrol sintesis mRNA pada gen struktural.Dimatikan
oleh kehadiran represor. Seorang inducer dapat mengambil represor dan mengaktifkan gen. Gen
kemudian mengarahkan gen struktural untuk ditranskripsi. Gen operator lac operon dibuat hanya
dari 27 pasang basa.
Promoter Gene:
Bertindak sebagai sinyal inisiasi yang berfungsi sebagai pusat pengenalan untuk RNA-
polymerase asalkan gen operator dinyalakan. RNA polimerase terikat pada gen promotor.Ketika
gen operator berfungsi, polimerase bergerak di atasnya dan mencapai gen struktural untuk
melakukan transkripsi.
Regulator Gene (lac i-Gene):
Dalam lac-operon, ini disebut i-gen karena menghasilkan inhibitor atau represor. Repressor
mengikat gen operator dan menghentikan kerja yang terakhir. Ini memberikan kontrol negatif
atas kerja gen struktural.
Repressor:
Ini adalah protein regulator disintesis sepanjang waktu (konstitutif) oleh regulator i-gen.Represor
dimaksudkan untuk memblokir gen operator sehingga gen struktural tidak dapat membentuk
mRNA. Ini memiliki dua situs alosterik, satu untuk melekat pada gen operator dan kedua untuk
mengikat inducer.
Setelah bersentuhan dengan induser, represor mengalami perubahan konformasi sedemikian rupa
sehingga tidak dapat bergabung dengan operator. Penolak laktosa atau lac-operon adalah protein
yang memiliki berat molekul 160.000. Ini terdiri dari empat subunit, masing-masing memiliki
berat molekul 40.000.
Inducer:
Ini adalah zat kimia (substrat, hormon atau beberapa metabolit lain) yang setelah bersentuhan
dengan represor, mengubah yang terakhir menjadi keadaan pengikatan non-DNA sehingga
membebaskan gen operator. Induser untuk lac-operon Escherichia coli adalah laktosa
(sebenarnya allolactose, atau metabolit laktosa).

CAP
Ini adalah aktivator yang disebut protein aktivator katabolik. Ini memberi kontrol positif pada
lac- operon karena dalam ketiadaan RNA polimerase tidak dapat mengenali gen
promotor. Gennya terletak jauh dari operon tetapi situs CAP reseptor terjadi di dekat promotor
lac. CAP mengaktifkan gen lac hanya ketika glukosa tidak ada.
RNA polimerase dikenali oleh gen promotor. Melewati gen operator dibebaskan dan kemudian
mengkatalisis transkripsi mRNAs atas gen struktural. MRNA masuk ke sitoplasma dan
membentuk protein atau enzim tertentu. Dari tiga enzim yang diproduksi oleh lac-operon,
laktosa-permease dimaksudkan untuk membawa laktosa di dalam sel. Β-galactosidase (= laktase)
memecah laktosa menjadi dua komponen, glukosa dan galaktosa.Enzim seperti laktase atau (3-
galaktosidase yang terbentuk sebagai respons terhadap keberadaan substratnya sering disebut
enzim induktif atau adaptif. Sistem operon inducible umumnya terjadi di jalur katabolik. Lac
operon tidak akan, bagaimanapun, tetap operatif tanpa batas meskipun kehadiran laktosa di
lingkungan eksternal.
Ini akan menghentikan aktivitasnya dengan akumulasi glukosa dan galaktosa di dalam sel di luar
kapasitas bakteri untuk metabolisme mereka. Lac-operon juga di bawah kendali regulasi positif.
Sistem Operasional Repressible (Gambar 6.35):
Sistem operon yang dapat direplikasi biasanya ditemukan di jalur anabolik. Operon aktif dan
enzim yang dihasilkan oleh gen strukturalnya biasanya ada di dalam sel. Berfungsi operon
dihentikan ketika konsentrasi produk akhir melintasi nilai ambang. Contoh sistem yang dapat
ditekan adalah tryptophan atau trp operon Escherichia coli. Itu juga dikerjakan oleh Jacob dan
Monod dan terdiri dari yang berikut:

Gen Struktural:
Gen terhubung ke transkripsi mRNA. MRNA menerjemahkan informasi yang dikodekan dalam
sintesis polipeptida. Polipeptida menimbulkan zat protein termasuk enzim. Operon Tryptophan
memiliki lima gen struktural - trp E, D, С, B, A. Mereka membentuk enzim untuk lima langkah
sintesis triptofan.
Operator Gene:
Ini mengontrol fungsi gen struktural. Biasanya dinyalakan karena aporepressor yang dihasilkan
oleh gen regulator tidak dapat sepenuhnya memblokir gen operator. Gen operator dimatikan
ketika corepressor tersedia bersama dengan aporepressor.
Promoter Gene:
Ini adalah situs untuk pengikatan awal RNA-polimerase. Yang terakhir bergerak dari gen
promotor ke gen struktural asalkan gen operator diaktifkan.

Aporepressor:
Ini adalah zat protein yang disintesis oleh gen regulator. Aporepressor membentuk komponen
represor untuk memblokir kerja gen operator. Untuk ini diperlukan sebuah corepressor. Ketika
yang terakhir tidak tersedia dalam kekuatan yang tepat, gen operator tetap diaktifkan karena
dengan sendirinya, aporepressor tidak dapat memblokir kerja gen operator.
Corepressor:
Ini adalah komponen represor nonproteinaceous yang juga merupakan produk akhir dari reaksi
yang dikatalisis oleh enzim yang dihasilkan melalui aktivitas gen struktural. Produk akhir sering
digunakan dalam beberapa reaksi lain sehingga jarang terakumulasi dan karenanya tidak
berfungsi sebagai corepressor.
Namun, setiap kali terakumulasi atau menjadi tersedia dari sumber luar, produk akhir menjadi
corepressor, bergabung dengan aporepressor, membentuk represor dan memblokir gen operator.
Gen struktural sekarang menghentikan transkripsi. Fenomena ini dikenal sebagai represi umpan
balik. Ini memberikan kontrol negatif. Dalam operon triptofan, triptofan (asam amino) berfungsi
sebagai corepressor.

Genetic engineering

Rekayasa genetik adalah gambaran dari bioteknologi yang di dalamnya meliputi manipulasi gen,
cloning gen, DNA rekombinan, tegnologi modifikasi genetik, dan genetika modern dengan
menggunakan berbagai prosedur. Sebagian besar teknik yang banyak dilakukan adalah
memanipulasi langsung DNA dengan orientasi pada ekspresi gen tertentu. Dalam skala yang
lebih luas ,rekayasa genetik melibatkan penanda yang sering disebut Marker Assisted Selection (
MAS ) yang bertujuan meningkatkan efisiensi suatu organisme berdasarkan informasi
fenotipnya. Salah satu penerapan dari rekayasa genetik adalah manipulasi genom hewan. Dan
hewan yang sering digunakan menjadi baham percobaan adalah mamalia, karna mamalia
memiliki genom yang lebih besar dan kompleks dibandingkan dengan virus,
bakteri,dan tanaman. Dengan konsekunsinya untuk memodifikasi genetik dari hewan mamalia
harus menggunakan teknik genetika molekuler dan teknologi rekombinasi DNA yang memiliki
tingkar kerumitan yang kompleks dan mahalnya biaya yang diperlukan dalam penelitian.

Terdapat 3 sumber yang menyatakan tentang arti rekayasa genetika :

1. Rekayasa genetika adalah manipulasi sifat genetic suatu organisme dengan cara
mengintroduksi atau megeleminasi gen gen tertentu (Micklos, dkk, 1990)
2. Rekayasa genetika adalah manipulasi genetic dalam sel untuk menghasilkan sesuatu sifat
yang dikehendaki, kadang kadang disebut teknologi rekombinan DNA (Rasmussen,
dkk,1990)
3. Rekayasa genetic adalah teknik mengubah konstitusi genetic sel atau individu dengan
cara pemindahan selektif, insersi atau dengan cara modifikasi gen baik yang individual
maupun yang berupa perangkat gen (Klug,dkk,1994).

Kutipan dari ketiga pendapat tersebut memperlihatkan bahwa pada rekayasa genetika ada
manipulasi atas materi genetik dengan cara menambah atau menghilangkan gen tertentu. Dengan
manipulasi atas materi genetik dengan cara seperti itu, suatu macam bioteknologi seperti kultur
jaringan, bahkan kultur sel, tidak layak dikategorikan sebagai teknik rekayasa genetika.
Berbagai fenomena genetika alami, jika dicermati sebenarnya menjadi model alami dari
teknologi rekayasa genetika. Fenomena genetika alami itu antara lain crossing over, gene pick
up, transduksi, insersi, delesi, translokasi, fusi dan fisi.

Proses rekayasa genetika

Teknik teknik rekayasa genetika

Menurut smith dan Byars (1990) terdapat berbagai teknik yang digunakan dalam rekayasa
genetika, misalnya transfer vector, injeksi mikro, fusi protoplas, dan elektroporesi. Selain teknik-
teknik itu, klug dkk juga menambahkan teknik kopresipitasi kalsium fosfat dan endositosis.

Transfer vector merupakan cara memasukkan suatu gen ke sel baru dengan menggunakan
pembawa (carrier) khusus. Transfer semacam ini memanfaatkan proses alami seperti yang terjadi
pada transfer DNA oleh bakteri dan virus.

Syarat syarat DNA agar dapat dijadikan sebagai vector antara lain :

1. Molukel DNA itu harus mampu melakukan replikasi sendiri maupun replikasi segmen
DNA yang diinsersikan bebas dari replikasi kromosom sel inang dengan cara
membawahi suatu “ori”.
2. Molekul DNA itu seharusnya mengandung sejumlah tapak pemutusan enzim restriksi
khusus yang bermanfaat untuk insersi segmen-segmen DNA.
3. Molekul DNA itu seharusnya membawahi suatu penanda yang dapat dimanfaatkan untuk
indentifikasi sel sel inang yang mengandungnya.
4. Molekul DNA itu seharusnya mudah terbebas kembali dari sel inang.
5. Berat molekulnya rendah
6. Adanya kemampuan untuk memberikan sifat fenotip yang dipilih dengan segera pada sel
inang.

Plasmid

Contoh plasmid misalnya ColE1 dan RSF2124. Plasmid plasmid itu terbentuk secara alami in
vivo. Plasmid-plasmid itu terdapat pada E.Coli.

Bakteriofag
 Bakteriofag yang banyak digunakan dalam teknologi DNA rekombinan pada E.coli adalah
fag α.seluruh fag α sudah diindentifikasi dan dipetakan urut-urutan genom secara
keseluruhan sudah diketahui. Bakteriofag lain juga digunakan sebagai vector, dan salah satu
di antaranya adalah M13 (klug,dkk). Materi genetic M13 berupa DNA unting tunggal. Dalam
hal ini jika M 13 menginfeksi suatu sel bakteri, DNA unting tunggal yang disebut sebagai RF
(replication Form).

Sekuensing

Adalah proses atau teknik penentuan urutan basa nukleotida pada suatu molekul DNA.
Urutan tersebut dikenal sebagai sekuens DNA, yang merupakan informasi paling mendasar
suatu gen atau genom karena mengandung instruksi yang dibutuhkan untuk pembentukan
tubuh makhluk hidup. Sekuensing DNA dapat dimanfaatkan untuk menentukan identitas
maupun fungsi gen atau fragmen DNA lainnya dengan cara membandingkan sekuens-nya
dengan sekuens DNA lain yang sudah diketahui. Sekuens DNA menyandikan informasi yang
diperlukan bagi makhluk hidup untuk melangsungkan hidup dan berkembang biak. Dengan
demikian, penentuan sekuens DNA berguna di dalam ilmu pengetahuan 'murni' mengenai
mengapa dan bagaimana makhluk hidup dapat hidup, selain berguna dalam penerapan
praktis. Karena DNA merupakan ciri kunci makhluk hidup, pengetahuan akan sekuens DNA
dapat berguna dalam penelitian biologi manapun. Sebagai contoh, dalam ilmu
pengobatan sekuensing DNA dapat digunakan untuk mengidentifikasi, mendiagnosis, dan
mengembangkan pengobatan penyakit genetik. Demikian pula halnya, penelitian pada agen
penyebab penyakit (pathogen). dapat membuka jalan bagi pengobatan penyakit
menular. Bioteknologi, yang dapat pula memanfaatkan sekuensing DNA, merupakan bidang
yang berkembang pesat dan berpotensi menghasilkan banyak barang dan jasa berguna.
Pengetahuan akan sekuens DNA berguna untuk mengetahui sekuens asam amino yang
disandikan oleh gen.

Karena RNA dibentuk dengan transkripsi dari DNA, informasi yang dikandung RNA juga
terdapat di dalam DNA cetakannya sehingga sekuensing DNA cetakan tersebut sudah cukup
untuk membaca informasi pada RNA. Namun, sekuensing RNA dibutuhkan khususnya
pada eukariota, karena molekul RNA eukariota tidak selalu sebanding dengan DNA
cetakannya karena pemotongan intron setelah proses transkripsi.
Sekuensing adalah teknik untuk menentukan urutan basa nukleotida dari urutan suatu DNA
seperti adenin, timin, guanosin, dan sitosin. Teknologi sekuensing DNA mengalami
perkembangan sejak dua dekade lalu hingga saat ini. Pada awal 1970-an seseorang
membutuhkan waktu sekitar satu tahun hanya untuk menyelesaikan 100 urutan basa DNA.
Sebuah perjuangan panjang untuk mensekuensing urutan DNA pada saat itu.
Selanjutnya pada tahun 1976 ditemukan teknik sekuensing DNA yang dikembangkan oleh
Allan Maxam dan Walter Gilbert di Amerika Serikat. Dengan metode yang ditemukan
Maxam-Gilbert ini memungkinkan seseorang dapat mensekuensing ribuan urutan pasangan
basa DNA dalam waktu setahun. Beberapa tahun kemudian teknik sequencing DNA yang
baru kembali diperkenalkan oleh Sanger. Penghargaan terhadap usaha keras keduanya
dianugerahi dengan hadiah nobel. Penemuan teknik sekuensing DNA yang lebih cepat pada
pertengahan 1970-an menjadi landasan terjadinya ledakan jumlah sekuens DNA yang
berhasil diungkapkan pada 1980-an dan 1990-an (Shendure & Ji, 2008).

Sekuensing DNA memungkinkan para ilmuwan untuk menentukan urutan genom. Proyek
genom manusia adalah contoh terbesar dari sekuensing DNA. Ketika genom manusia
disekuensing kembali pada tahun 2001, banyak kontradiksi yang bermunculan tapi saat ini
kita bisa melihat dampaknya terhadap penelitian medis dan farmasi. Para ilmuwan sekarang
dapat mengidentifikasi gen yang bertanggung jawab untuk menyebabkan penyakit genetik
seperti penyakit Alzheimer, distrofi myotonic dan banyak penyakit lainnya yang disebabkan
oleh ketidakmampuan gen untuk berfungsi dengan baik. Banyak jenis penyakit yang
diperoleh seperti kanker juga dapat dideteksi dengan mengamati gen tertentu. Adapun
Manfaat dalam sequencing DNA adalah sebagai berikut menurut Tautz et al., (2003) antara
lain:
a) Bidang Forensik
Sekuensing DNA telah diterapkan dalam ilmu forensik untuk mengidentifikasi individu
tertentu karena setiap individu memiliki urutan yang unik pada DNA nya. Hal ini terutama
digunakan untuk mengidentifikasi pelaku criminal dengan mencari beberapa bukti yang
tertinggal pada TKP berupa sampel rambut, kuku, kulit atau darah. Sekuensing DNA juga
digunakan untuk menentukan orang tua dari seorang anak. Demikian pula, juga
mengidentifikasi spesies langka dan dilindungi. Melalui sequencing DNA juga dapat
diketahui identitas dari korban bencana maupun kecelakaan.

b) Bidang Kedokteran
Dalam penelitian medis, sekuensing DNA dapat digunakan untuk mendeteksi gen yang
terkait dengan beberapa faktor keturunan atau penyakit yang diperoleh. Para ilmuwan
menggunakan teknik yang berbeda dari rekayasa genetika seperti terapi gen untuk
mengidentifikasi gen yang cacat dan menggantinya dengan yang sehat.

c) Bidang Pertanian
Sekuensing DNA telah memainkan peran penting di bidang pertanian. Pemetaan dan
sekuensing seluruh genom mikroorganisme telah memungkinkan agriculturist memanfaatkan
mereka dalam pengendalian hama/ penyakit tanaman secara hayati. Pada contoh lain, gen
spesifik dari beberapa tanaman pangan digunakan untuk meningkatkan hasil produktivitas
dan nilai nutrisi tanaman pangan. Demikian pula, telah berguna dalam produksi ternak
dengan peningkatan kualitas daging dan susu.
 d) Bidang Taksonomi
Salah satu kegiatan dibidang taksonomi adalah mengklasifikasikan makhluk hidup kedalam
kelompok-kelompok tertentu sehingga dari pengelompokkan tersebut memudahkan kita
untuk mempelajari keanekaragaman makhluk hidup di alam. Pengelompokan makhluk hidup
dapat digunakan berbagai pendekatan. Dunia ilmu pengetahuan saat ini mengenal tiga aliran
dalam mengklasifikasikan mahkluk hidup yaitu aliran fenetik, kladistik, dan phyologenetik
evolusioner.

Pengelompokkan makhluk hidup dengan menggunakan pendekatan fenetik menemui

masalah terkait dengan adanya proses evolusi baik evolusi konvergen maupun evolusi
divergen, sehingga organisme yang secara morfologi memiliki kemiripan belum tentu
memilki hubungan kekekrabatan yang dekat begitu pula sebaliknya. Penggunaan karakter
morfologi sebagai satu-satunya alat untuk mengelompokkan makhluk hidup sering
menghasilkan taksonomi yang kurang akurat sehingg dibutuhkan karakter yang tidak mudah
berubah walaupun terjadi perubahan habitat. Salah satu karakter yang tidak mudah berubah
tersebut adalah marka molekular yaitu DNA, RNA dan sequencing asam nukleat.

Salah satu kelebihan dari data sekunse DNA adalah tidak dipengaruhi oleh penilaian
subyektif sifatnya yang digital sehingga siapapun dapat mengakses informasi tersebut.
Sebuah klasifikasi yang baik adalah dapat menggambarkan hubungan evolusioner yang
terjadi pada kelompok taxa yang diamati. Hubungan evolusoner ini ditunjukkan melalui
sebuah pohon phylogenetik. Pohon phylogenetik dapat direkonstruksi karena adanya data
sequence DNA. Sequences DNA merupakan awal untuk hipotesis dari hubungan filogenetik,
khususnya pada tingkat spesies. Skala besar perbandingan antara berbagai bagian pohon
phylogenetik akan menjelaskan perbedaan tingkat dan modus evolusi molekuler, pola spesies
diversifikasi, variasi karakter ekologi, dan akan menghasilkan pemahaman yang lebih dalam
tentang keanekaragaman hayati.

Restriction enzyme

Enzim restriksi adalah enzim pemotongan DNA. Setiap enzim mengenali satu atau beberapa
target target dan memotong DNA pada atau mendekati sekuens tersebut. Banyak enzim restriksi
membuat sayatan yang tersendat sendat, menghasilkan ujung dengan DNA beruntai tunggal yang
menggantung. Namun, sebagian menghasilkan ujung yang tumpul.
DNA ligase adalah enzim yang bergabung dengan DNA. Jika dua bagian DNA memiliki ujung
yang sesuai, ligase dapat menghubungkannya untuk membentuk molekul DNA tunggal yang tak
terputus. Dalam kloning DNA, enzim restriksi dan ligase DNA digunakan untuk menyisipkan
gen dan bagian DNA lainnya ke dalam plasmid.
Dalam kloning DNA, peneliti membuat banyak salinan dari sepotong DNA, seperti gen. Dalam
banyak kasus, kloning melibatkan memasukkan gen ke dalam sepotong DNA melingkar yang
disebut plasmid, yang dapat disalin pada bakteri.
Bagaimana potongan DNA dari sumber yang berbeda (seperti gen manusia dan plasmid bakteri)
disatukan untuk membuat satu molekul DNA? Salah satu metode umum adalah berdasarkan
enzim restriksi dan DNA ligase.

Enzim restriksi adalah enzim pemotongan DNA yang mengenali situs tertentu dalam DNA.
Banyak enzim restriksi membuat luka terhuyung-huyung di atau di dekat situs pengakuan
mereka, menghasilkan berakhir dengan overhang single-stranded. Jika dua molekul DNA
memiliki ujung yang cocok, mereka dapat bergabung dengan ligase DNA enzim. DNA ligase
menutup celah antar molekul, membentuk satu bagian DNA.
Enzim restriksi dan DNA ligase sering digunakan untuk menyisipkan gen dan potongan DNA
lainnya ke dalam plasmid selama kloning DNA.
Enzim restriksi ditemukan pada bakteri (dan prokariota lainnya). Mereka mengenali dan
mengikat urutan DNA tertentu, yang disebut situs pembatasan. Setiap enzim restriksi hanya
mengenali satu atau beberapa situs restriksi. Ketika menemukan urutan targetnya, enzim restriksi
akan membuat potongan untai ganda dalam molekul DNA. Biasanya, potongan berada di atau di
dekat situs pembatasan dan terjadi dalam pola yang rapi dan dapat diprediksi.

Sebagai contoh bagaimana enzim restriksi mengenali dan memotong pada urutan DNA, mari kita
pertimbangkan EcoRI, enzim restriksi umum yang digunakan di laboratorium. Pemotongan EcoRI
di situs berikut:

Ketika EcoRI mengenali dan memotong situs ini, ia selalu melakukannya dalam pola yang
sangat spesifik yang menghasilkan ujung dengan DNA single-stranded "overhang":

Jika sepotong DNA lain memiliki overhang yang sesuai (misalnya, karena juga telah dipotong
oleh EcoRI), overhang dapat menempel bersama dengan pasangan basa pelengkap. Untuk alasan
ini, enzim yang meninggalkan overhang beruntai tunggal dikatakan menghasilkan ujung yang
lengket. Ujung lengket sangat membantu dalam kloning karena mereka memegang dua buah
DNA bersama-sama sehingga mereka dapat dihubungkan oleh DNA ligase.
Tidak semua enzim restriksi menghasilkan ujung yang lengket. Beberapa adalah "pemotong
tumpul," yang memotong lurus ke tengah-tengah urutan target dan tidak meninggalkan overhang.
Enzim restriksi SmaI adalah contoh pemotong tumpul:

Fragmen ujung yang tumpul dapat digabungkan satu sama lain oleh DNA ligase. Namun,
fragmen-fragmen yang tumpul lebih keras untuk mengikat bersama-sama (reaksi ligasi kurang
efisien dan lebih mungkin gagal) karena tidak ada overhang beruntai tunggal untuk menahan
molekul DNA pada posisinya.

DNA Ligase

Jika Anda telah belajar tentang replikasi DNA, Anda mungkin telah menemukan DNA ligase.
Dalam replikasi DNA, tugas ligase adalah menyatukan fragmen DNA yang baru disintesis untuk
membentuk untai yang mulus. Ligan yang digunakan dalam kloning DNA pada dasarnya
melakukan hal yang sama. Jika dua bagian DNA memiliki ujung yang sesuai, DNA ligase dapat
bergabung bersama untuk membentuk molekul tak terputus.

Bagaimana DNA ligase melakukan ini? Menggunakan ATP sebagai sumber energi, ligase
mengkatalisis reaksi di mana gugus fosfat yang menempel di ujung 5 'dari satu untai DNA terkait
dengan gugus hidroksil yang menempel di ujung 3' dari ujung yang lain. Reaksi ini
menghasilkan tulang punggung gula-fosfat utuh

Contoh: Membangun plasmid rekombinan

Mari kita lihat bagaimana pembatasan pencernaan dan ligasi dapat digunakan untuk
memasukkan gen ke dalam plasmid. Misalkan kita memiliki gen target, diapit dengan situs
pengakuan EcoRI, dan plasmid, yang berisi satu situs EcoRI:
Tujuan kami adalah menggunakan enzim EcoRI untuk memasukkan gen ke dalam plasmid.
Pertama, kita secara terpisah mencerna (memotong) fragmen gen dan plasmid dengan EcoRI.
Langkah ini menghasilkan fragmen dengan ujung yang lengket:

Selanjutnya, kita mengambil fragmen gen dan plasmid yang dilinearisasi (terbuka) dan
menggabungkannya dengan DNA ligase. Ujung lengket dari dua fragmen saling menempel
dengan pasangan basa komplementer:
Setelah mereka bergabung dengan ligase, fragmen menjadi satu bagian dari DNA yang tidak
terputus. Gen target sekarang telah dimasukkan ke dalam plasmid, membuat plasmid
rekombinan.

Pencernaan dan ligasi restriksi melibatkan banyak molekul DNA

Dalam contoh di atas, kami melihat satu hasil ligasi antara gen dan potongan plasmid dengan
EcoRI. Namun, hasil lain bisa terjadi pada ligasi yang sama persis ini. Misalnya, plasmid yang
dipotong dapat membentuk kembali (menutup kembali) tanpa mengambil gen. Demikian pula,
gen bisa masuk ke plasmid, tetapi membalik ke belakang (karena dua ujung lengkung EcoRI-nya
identik)
Pencernaan dan ligan restriksi seperti ini dilakukan menggunakan banyak salinan plasmid dan
DNA gen. Faktanya, milyaran molekul DNA digunakan dalam satu ligasi! Molekul-molekul ini
saling bertabrakan satu sama lain, dan menjadi DNA ligase, secara acak dengan cara yang
berbeda. Jadi, jika beberapa produk dapat dibuat, semuanya akan dibuat pada frekuensi tertentu -
termasuk yang tidak kita inginkan.

Bagaimana kita bisa menghindari plasmid "buruk"? Ketika kita mengubah bakteri dengan DNA
dari ligasi, masing-masing mengambil bagian DNA yang berbeda. Kami dapat memeriksa
bakteri setelah transformasi dan hanya menggunakan yang memiliki plasmid yang benar. Dalam
banyak kasus, plasmid dari bakteri yang ditransformasikan dianalisis menggunakan digest
restriksi lain untuk melihat apakah mengandung insert kanan dalam orientasi yang benar.

Cloning of DNA restriction fragmen

Cloning DNA adalah teknik biologi molekuler yang membuat banyak salinan identik dari sepotong DNA,
seperti gen. Plasmid diperkenalkan ke bakteri melalui proses yang disebut transformasi, dan bakteri yang
membawa plasmid dipilih menggunakan antibioti. Bakteri dengan plasmid yang benar digunakan untuk membuat
lebih banyak DNA plasmid atau, dalam beberapa kasus, diinduksi untuk mengekspresikan gen dan membuat protein.

Ketika Anda mendengar kata "kloning," Anda mungkin berpikir tentang kloning seluruh organisme, seperti
Dolly si domba. Namun, semua itu berarti mengkloning sesuatu adalah dengan membuat salinan yang
tepat secara genetik. Di laboratorium biologi molekuler, yang paling sering dikloning adalah gen atau
bagian kecil DNA lainnya.

Gambaran kloning DNA

Kloning DNA adalah proses membuat banyak salinan identik dari sepotong DNA tertentu.
Dalam prosedur kloning DNA yang khas, gen atau fragmen DNA lain yang menarik (mungkin
gen untuk protein manusia yang penting secara medis) pertama kali dimasukkan ke dalam
sepotong DNA melingkar yang disebut plasmid. Penyisipan dilakukan menggunakan enzim yang
"memotong dan menempel" DNA, dan menghasilkan molekul DNA rekombinan, atau DNA
yang dikumpulkan dari fragmen dari berbagai sumber.

Selanjutnya, plasmid rekombinan dimasukkan ke dalam bakteri. Bakteri membawa plasmid

dipilih dan dibesarkan. Ketika mereka bereproduksi, mereka mereplikasi plasmid dan
meneruskannya ke keturunan mereka, membuat salinan DNA yang dikandungnya.
Apa gunanya membuat banyak salinan urutan DNA dalam plasmid? Dalam beberapa kasus,
kami memerlukan banyak salinan DNA untuk melakukan eksperimen atau membangun plasmid
baru. Dalam kasus lain, potongan DNA mengkodekan protein yang berguna, dan bakteri
digunakan sebagai "pabrik" untuk membuat protein. Misalnya, gen insulin manusia
diekspresikan pada bakteri E. coli untuk membuat insulin yang digunakan oleh penderita
diabetes.

Langkah cloning DNA

Kloning DNA digunakan untuk banyak tujuan. Sebagai contoh, mari kita lihat bagaimana kloning DNA dapat
digunakan untuk mensintesis protein (seperti insulin manusia) pada bakteri. Langkah-langkah dasarnya adalah:
1. Potong plasmid dan "tempel" di dalam gen. Proses ini bergantung pada enzim restriksi
(yang memotong DNA) dan DNA ligase (yang bergabung dengan DNA).
2. Masukkan plasmid ke dalam bakteri. Gunakan pilihan antibiotik untuk mengidentifikasi
bakteri yang mengambil plasmid.
3. Tumbuh banyak bakteri pembawa plasmid dan gunakan mereka sebagai "pabrik" untuk membuat
protein. Panen protein dari bakteri dan memurnikannya.
 I. Memotong dan menempel DNA

Bagaimana bisa potongan DNA dari berbagai sumber digabungkan bersama? Metode umum menggunakan dua jenis
enzim: enzim restriksi dan DNA ligase. Enzim restriksi adalah enzim pemotongan DNA yang mengenali urutan
target spesifik dan memotong DNA menjadi dua bagian di atau dekat lokasi tersebut. Banyak enzim restriksi
menghasilkan cut berakhir dengan overhang pendek, single-stranded. Jika dua molekul memiliki overhang yang
serasi, keduanya dapat berpasangan dan saling menempel. Namun, mereka tidak akan bergabung untuk membentuk
molekul DNA tak terputus sampai mereka bergabung dengan DNA ligase, yang menutup celah di tulang punggung
DNA. Tujuan kami dalam kloning adalah memasukkan gen target (misalnya, untuk insulin manusia) ke
dalam plasmid. Menggunakan enzim restriksi yang dipilih dengan cermat.

 The plasmid, yang memiliki situs pemotongan tunggal

 Fragmen gen target, yang memiliki situs pemotongan dekat setiap ujungnya

Kemudian, kami menggabungkan fragmen dengan DNA ligase, yang menghubungkan mereka untuk membuat
plasmid rekombinan yang mengandung gen.

II. Transformasi dan seleksi bakteri

Plasmid dan DNA lainnya dapat dimasukkan ke dalam bakteri, seperti E. coli yang tidak
berbahaya yang digunakan di laboratorium, dalam proses yang disebut transformasi. Selama
transformasi, sel bakteri yang disiapkan secara khusus diberikan kejutan (seperti suhu tinggi)
yang mendorong mereka untuk mengambil DNA asing.

Plasmid biasanya mengandung gen resistensi antibiotik, yang memungkinkan bakteri bertahan hidup dengan adanya
antibiotik spesifik. Dengan demikian, bakteri yang mengambil plasmid dapat dipilih pada piring nutrisi yang
mengandung antibiotik. Bakteri tanpa plasmid akan mati, sementara bakteri yang membawa plasmid dapat hidup
dan bereproduksi. Setiap bakteri yang hidup akan menimbulkan kelompok kecil, seperti titik, atau koloni, bakteri
identik yang semuanya membawa plasmid yang sama.

Tidak semua koloni akan mengandung plasmid yang tepat. Itu karena, selama proses ligasi,
fragmen DNA tidak selalu "disisipkan" persis seperti yang kita inginkan. Sebagai gantinya, kita
harus mengumpulkan DNA dari beberapa koloni dan melihat apakah masing-masing
mengandung plasmid yang tepat. Metode seperti restriksi enzim restriksi dan PCR biasanya
digunakan untuk memeriksa plasmid.

III. Produksi protein

Setelah kami menemukan koloni bakteri dengan plasmid yang tepat, kita dapat menumbuhkan budaya besar bakteri
yang mengandung plasmid. Kemudian, kami memberi bakteri sinyal kimia yang menginstruksikan mereka untuk
membuat protein target. Bakteri berfungsi sebagai miniatur "pabrik," mengaduk-aduk protein dalam jumlah besar.
Sebagai contoh, jika plasmid kita mengandung gen insulin manusia, bakteri akan mulai mentranskripsi gen dan
menerjemahkan mRNA untuk menghasilkan banyak molekul protein insulin manusia.
Once the protein has been produced, the bacterial cells can be split
open to release it. There are many other proteins and macromolecules
floating around in bacteria besides the target protein (e.g., insulin).
Because of this, the target protein must be purified, or separated from
the other contents of the cells by biochemical techniques. The purified
protein can be used for experiments or, in the case of insulin,
administered to patients.

Kegunaan cloning DNA

Molekul DNA yang dibangun melalui teknik kloning digunakan untuk banyak tujuan dalam
biologi molekuler. Daftar singkat contoh meliputi:
 Biofarmasi.
Kloning DNA dapat digunakan untuk membuat protein manusia dengan aplikasi
biomedis, seperti insulin yang disebutkan di atas. Contoh lain dari protein rekombinan
termasuk hormon pertumbuhan manusia, yang diberikan kepada pasien yang tidak dapat
mensintesis hormon, dan aktivator plasminogen jaringan (tPA), yang digunakan untuk
mengobati stroke dan mencegah pembekuan darah. Protein rekombinan seperti ini sering
dibuat pada bakteri.

 Terapi gen.
Pada beberapa kelainan genetik, pasien tidak memiliki bentuk fungsional dari gen
tertentu. Terapi gen mencoba untuk memberikan salinan gen normal ke sel-sel tubuh
pasien. Sebagai contoh, kloning DNA digunakan untuk membangun plasmid yang
mengandung versi normal dari gen yang tidak berfungsi dalam cystic fibrosis. Ketika
plasmid dikirim ke paru-paru pasien cystic fibrosis, fungsi paru memburuk kurang cepat
 Analisis gen.
Di laboratorium penelitian dasar, ahli biologi sering menggunakan kloning DNA untuk
membuat versi gen buatan dan rekombinan yang membantu mereka memahami
bagaimana gen normal dalam fungsi organisme.
Ini hanyalah beberapa contoh bagaimana kloning DNA digunakan dalam biologi saat ini.
Kloning DNA adalah teknik yang sangat umum yang digunakan dalam berbagai macam aplikasi
biologi molekuler.
Amplifikasi DNA in vitro

Amplifikasi adalah pembesaran, perluasan, atau pengembangan. Dalam dunia biomolekuler

amplifikasi ini berarti sebuah proses untuk meningkatkan jumlah salinan DNA. Bila secara in
vitro ( diluar sel) maka menggunakan teknik polymerase chain reaction (PCR). Teknik ini
pertama kali dikembangkan oleh Karry Mullis pada tahun 1985

PCR adalah metode yang dapat mengamplifikasi logaritma sekuen pendek DNA menjadi DNA
heliks ganda yang panjang. Proses PCR meliputi 3 tahapan yaitu denaturasi, anneling, dan
sintesis DNA. Komponen yang terlibat di proses PCR sama dengan proses replikasi, yaitu DNA
polimerase, nukleotida, dan primer okazaki. Prinsip kerja PCR yaitu menggunakan dan fragmen
DNA yang pendek disebut primer. Primer berfungsi untuk mensintesis secara langsung sekuens
DNA target spesifik dari DNA template. Reaksi sintesis tersebut berlangsung terus berulang
sehingga membentuk suatu siklus. Produk dari siklus sintesis sebelumnya dapat berfungsi
sebagai template atau cetakan bagi siklus selanjutnya. Hasilnya ialah amplifikasi eksponensial
dari sekuens DNA target. Siklus yang berulang tersebut dapat berlangsung karena penggunaan
Taq polymerase. Taq polymerase ialah sebuah enzim polymerase bersifat termostabil yang
diisolasi dari bakteri termofilik yaitu Thermus aquaticus.

PRINSIP-PRINSIP UMUM PCR

Komponen- komponen yang diperlukan pada proses PCR adalah templat DNA; sepasang primer, yaitu
suatu oligonukleotida pendek yang mempunyai urutan nukleotida yang komplementer dengan urutan
nukleotida DNA templat; dNTPs (Deoxynucleotide triphosphates); buffer PCR; magnesium klorida
(MgCl2 ) dan enzim polimerase DNA. Proses PCR melibatkan beberapa tahap yaitu: (1) pra-denaturasi
DNA templat; (2) denaturasi DNA templat; (3) penempelan primer pada templat (annealing); (4)
pemanjangan primer (extension) dan (5) pemantapan (postextension). Tahap (2) sampai dengan (4)
merupakan tahapan berulang (siklus), di mana pada setiap siklus terjadi duplikasi jumlah DNA. Tahapan
proses PCR dapat dilihat pada gambar 1. PCR adalah suatu teknik yang melibatkan beberapa tahap yang
berulang (siklus) dan pada setiap siklus terjadi duplikasi jumlah target DNA untai ganda. Untai ganda
DNA templat (unamplified DNA) dipisahkan dengan denaturasi termal dan kemudian didinginkan hingga
mencapai suatu suhu tertentu untuk memberi waktu pada primer menempel (anneal primers) pada
daerah tertentu dari target DNA. Polimerase DNA digunakan untuk memperpanjang primer (extend
primers) dengan adanya dNTPs (dATP, dCTP, dGTP dan dTTP) dan buffer yang sesuai. Umumnya keadaan
ini dilakukan antara 20 – 40 siklus. Target DNA yang diinginkan (short ”target” product) akan meningkat
secara eksponensial setelah siklus keempat dan DNA non-target (long product) akan meningkat secara
linier seperti tampak pada bagan (Newton and Graham, 1994)

DNA (Deoxyribose Nucleic Acid) merupakan suatu makromolekul beruntai gandadan berbentuk
heliks dengan basa yang menonjol ke bagian dalam molekul tersebut. Basanitrogen DNA terdiri
atas adenin, timin, sitosin dan guanin. Adenin selalu berikatan dengantimin dan sitosin dengan
guanian, urutan nukleotida kedua untai bersifat komplementer.Untaian yang satu merupakan cetakan
pembentuk untaian yang lain (Mathews dan vanHolde, 1997).

Suatu molekul DNA berukuran sangat panjang dan umumnya terdiri atas ratusan ataubahkan
ribuan gen. Ketika sel bereproduksi sendiri dengan cara membelah, DNA-nya akandisalin dan
diteruskan dari satu generasi sel ke generasi sel berikutnya. Informasi yangterkode dalam
struktur DNA merupakan program dari aktivitas sel tersebut (Gibbons, 1993

DNA mempunyai struktur yang disebut struktur heliks ganda. Ciri-ciri penting daristruktur heliks
ganda (Nur dan Adijuwanda, 1989):
1. DNA terdiri dari 2 rantai polinukleotida yang melingkar menurut satu sumbuheliks
2. Kedua helix bersifat putar kanan dan arahnya berlawanan menurut ujung-ujung 3’dan
5’nya.
 3. Basa purinnya.
DNA dan RNA termasuk kedalam anggota makromolekul yang disebut asam nukleat.Asam nukleat adalah
polinukleotida yaitu gabungan lebih dari satu nukleotida. Nukleotidaterdiri atas satu siklik yang
tersusun atas 5 ikatan karbon gula, 1 phospat dan 1 basa nitrogen.Gula pada DNA berupa
deoxyribosa sedangkan gula pada RNA adalan ribosa. Ribosamemiliki gugus hydroksil
(OH) pada karbon ke-2 sedangkan deoxyribosa tidak ada. sehinggadeoxyribosa bersifat lebih
stabil. Phospat terikat pada karbon ke-5 dari gula DNA maupunRNA. Basa nitrogen pada DNA
diantaranya adalah adenine(A), guanine(G), cytosine(C), thymine (T) dan uracil (U). Nuklotida
terbentuk saat phospat menempel (berikatan) dengankarbon ke-5 dari gula dan basa Nitrogen
menempel pada karbon ke-1 glukosa. Molekul DNAtersusun atas dua rantai nukleotida dan
membetuk double helik. Ikatan gula-phospat berada dibagian luar heliks dan basa berada
diantara dua rantai gula-basa.

Untuk melihat visualisasi DNA dapat digunakan metode yang dinamakan

elektroforesis DNA. Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk
memisahkan sampel DNA berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan
struktur fisik molekulnya. Gel yang biasa digunakan antara lain agarosa.
Dengan gel agarosa dapat dilakukan pemisahan sampel DNA dengan ukuran
dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (pb). Molekul DNA bermuatan
negatif sehingga didalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel
menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran molekulnya, makin rendah
laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan
dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen molekul
DNA standard (marker) yang telah diketahui ukurannya. Visualisasi DNA
selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar ultraviolet setelah terlebih
dahulu gel direndam didalam larutan etidium bromid.
Elektroforesi gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi molekular.
Prinsip dasar teknik ini adalah bahwa DNA,RNA atau protein dapat
dipisahkan oleh medan listrik. Dalam hal ini, molekul molekul tersebut
dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya oleh gaya gerak listrik didalam
matriks gel. Laju perpindahan tersebut bergantung pada ukuran molekul
bersangkutan. Elektroforesis gel biasanya dilakukan tersebut bergantung pada
molekul bersangkutan. Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk tujuan
analisis, namun dapat pula digunakan sebagai teknik preparative untuk
memurnikan molekul sebelum digunakan dalam metode-metode lain seperti
spectrometer massa, PCR, cloning, sekuensing DNA, atau immune-blotting
yang merupakan metode metode karakterisasi lebih lanjut. Gel yang
digunakan biasanya merupakan metode-metode karakterisasi lebih lanjut. Gel
yang digunakan biasanya merupakan polimer bertautan silang (crosslinked)
yang porositasnya dapat diatur sesuai dengan kebutuhan.

Untuk memisahkan protein atau asam nukleat berukuran kecil (DNA,RNA,

atau oligonukleotida), gel yang digunakan biasanya merupakan gel
poliakrilamida, dibuat dengan konsentrasi berbeda beda antara akrikamida dan
zat yang memungkinkan pertautan silang (cross-linker), menghasilkan
jaringan poliakrilamida dengan ukuran rongga berbeda-beda. Untuk
memisahkan asam nukleat yang lebih besar (lebih besar dari beberapa ratus
basa, gel yang digunakan adalah biasanya merupakan metode-metode
karakterisasi lebih lanjut.

Untuk memisahkan protein atau asam nukleat berukuran kecil (DNA, RNA,
atau oligonukleotida), gel yang digunakan biasanya merupakan gel
poliakrilamida, dibuat dengan konsentrasi berbeda-beda antara akrilamida dan
zat yang memungkinkan pertautan silang (cross-linker), menghasilkan
jaringan poliakrilamida dengan ukuran rongga berbda-beda. Untuk
memisahkan asam nukleat yang lebih besar (lebih besar dari beberapa ratus
basa), gel yang digunakan adalah agarosa (dari ekstrak rumput laut) yang
sudah dimurnikan.

Dalam proses elektroforesis, sampel molekul ditempatkan kedalam sumur

(well) pada gel yang ditempatkan didalam larutan penyangga, dan listrik
dilalirkan kepadanya. Molekul molekul sampel tersebut akan bergerak di
dalam matriks gel kearah salah satu kutub listrik yang sesuai dengan
muatannya. Dalam hal asam nukleat, arah pergerakan adalah menuju
elektroda positif, disebabkan oleh muatan negative alami pada rangka gula-
fosfat yang dimilikinya. Untuk menjaga agar laju perpindahan asam nukleat
benar-benar hanya berdasarkan ukuran yaitu panjangnya, zat seperti natrium
hidroksida atau formamida digunakan untuk menjaga agar asam nukleat
berbentuk lurus. Sementara itu, protein didenaturasi dengan deterjen,(
misalnya natrium dodesil sulfat, SDS) untuk membuat protein tersebut
berbentuk lurus dan bermuatan negatif.

Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses pewarnaan (staining)

agar molekul sampel yang telah terpisah dapat dilihat. Etidium bromide,
perak, atau pewarna “biru Coomassie” (Coomassie blue) dapat digunakan
untuk keperluan ini. Jika molekuk sampel berpendar dalam sinar ultraviolet
(misalnya setelah “diwarnai” dengan etidium bromida), gel difoto di bawah
sinar ultraviolet. Jika molekul sampel mengandung atom
radioaktif,autoradiogram gel tersebut dibuat.

Pita-pita (band) pada lajur-lajur (lane) yang berbeda pada gel akan tampak
setelah proses pewarnaan; satu lajur merupakam arah pergerakan sampel dari
“sumur” gel. Pita-pita yang berjarak sama dari sumur gel pada akhir
elektroforesis mengandung molekul-molekul yang bergerak di dalam gel
selama elektroforesis dengan kecepatan yang sama, yang biasanya berarti
bahwa molekul-molekul tersebut berukuran sama.”Marka” atau penanda
(marker) yang nerupakan campuran molekul dengan ukuran yang berbeda-
beda dapat digunakan untuk menentukan campuran molekul dalam pita
sampel dengan meng-elektroforesis marka tersebut pada lajur di gel yang
parallel dengan sampel. Pita-pita pada jalur marka tersebut dapat
dibandingkan dengan pita sampel untuk menentukan ukurannya. Jarak pia dari
sumur gel berbanding terbalik terhadap logaritma ukuran molekul.

DNA dapat ditentukan ukurannya dengan melakukan migrasi didalam gel

agarose atau gel poliakrilamid. Migrasi DNA didalam gel ini biasa disebut
dengan elektroferesis. Untuk dapat divisualisasikan, maka DNA yang ada di
gel harus diwarnai dengan ethidium bromide kemudian dilihat diatas UV.

DNA meupakan molekul bermuatan negative, sehingga bila diletakkan di

medan listrik, DNA akan bergerak(migrasi) dari kutub negative ke kutub
positif. Pergerakan kecepatannya tergantung dari :

a. Ukuran molekul DNA

b. Kerapatan media gel yang dilalui DNA
c. Arus listrik yang diberikan

Sebelum dilakuakan elektroforesis, suspense DNA harus dicampur dengan

penyangga muatan pewarna loading buffer (dye), yang berfungsi untuk :
 1. Menambah densitas, sehingga DNA berada dibagian bawah dari sumur
2. Pewarna untuk memudahkan meletakkan contoh DNA kedalam sumur.
3. Dapat bergerak kearah anoda dengan laju yang dapat dipekirakan

Blotting assay

Blot adalah suatu teknik memindahkan bagian protein yang telah dipisahkan, RNA atau
DNA dari gel ke lembaran tipis atau matriks membran agar bagian protein tersebut
mengalami imobilisasi.

Keuntungan teknik blot adalah ;

a. Akses yang lebih besar kepada molekul yang telah terikat ke permukaan lembaran
dibandingkan kepada molekul yang masih berada di dalam gel atau matriks.
b. Lebih sedikit reagen yang dibutuhkan.
c. Waktu untuk melakukan staining dna destaining, inkubasi, mencuci, dll dapat lebih singkat.
d. Pola yang terbentuk dapat dikeringkan dan disimpan berbulan-bulan sebelum dianalisis.
e. Dapat dibuat banyak replika pola tersebut untuk memungkinkan banyak metode analisis yang
dipakai

Matriks Yang Di Gunakan Dalam Metode Blot

Matriks yang biasa dipakai dapat berupa nitroselulosa (NC). Namun NC juga memiliki
kekurangan, yaitu beberapa komponen yang memiliki afinitas lemah dapat hilang selama
pemrosesan. Matriks lain yang dapat digunakan untuk menutupi kekurangannya yaitu kertas
diazobenzyloxymethyl (DBM). Ada pula kertas lain, yaitu iazophenylthioeter (DPT).
Macam Macam Metode Blotting

1. Southern Blot
Southern blot pertama kali dikemukakan oleh Southern (1975). Adalah metode untuk
menyelidiki keberadaan sekuens DNA tertentu dalam sampel DNA. DNA sampel sebelum dan
sesudah enzim restriksi dipisahkan dengan elektroforesis gel dan kemudian ditransfer ke
membrane dengan blotting melalui aksi kapiler.Teknik ini mentransfer DNA ke kertas NC
dengan menggunakan prosedur aliran pelarut. Caranya yaitu dengan menempatkan gel
elektroforesis ke kertas matriks yang direndam buffer dan berada di atas sesuatu seperti spons
yang telah dibasahi dengan buffer. Membran tersebut diletakkan di atas gel dan ditumpuk pula
beberapa kertas peresap di atasnya. Buffer kemudian akan mengalir pelan-pelan ke membran,
demikian pula dengan gel yang membawa molekul ke kertas membran, sementara gelnya diserap
oleh kertas peresap. Fragmen DNA yang spesifik dideteksi dengan menggunakan pelacak.
Pelacak biasanya merupakan DNA yang dimurnikan dan bisa ditandai dengan aktifitas spesifik
radionukletida. Lokasi sinyal yang terlihat setelah autradiografi membuat kita dapat menentukan
ukuran dari fragmen DNA tersebut.

Analysis of DNA by southern Blot technique

2. Northern Blot
Northern Blot merupakan tekniknya sama dengan Southern Blot, namun menggunakan kertas
DBM dan biasanya mendeteksi RNA.
3. Eastern Blot
Eastern Blot merupakan teknik yang ditemukan oleh Reinhard dan Malamud (1982), adalah
proses transfer bidirectional dengan menggunakan aliran pelarut protein dari gel ke NC
berdasarkan titik isoelektrik.

4. Western Blot
Teknik ini pertama kali dibuat oleh W. Neal Burnette dan dinamai western blot sebagai olok-
olokan terhadap tekini southern blot yang pertama kali ditemukan.

Western blot merupakan teknik untuk mendeteksi protein spesifik pada sampel jaringan yang
homogenat ataupun dari suatu ekstraksi berdasarkan kemampuan protein tersebut berikatan
dengan antibodi. Teknik ini menggunakan gel elektroforesis untuk memisahkan protein
berdasarkan panjang polipeptida atau berdasarkan struktur 3D-nya. Protein tersebut kemudian
ditransfer ke sebuah membran, biasanya nitroselulosa atau PVDF, dimana mereka kemudian
akan dilacak dengan menggunakan antibodi yang spesifik kepada protein target.

Western blot dapat mendeteksi suatu protein dalam kombinasinya dengan sangat banyak protein
lain, dapat memberikan informasi mengenai ukuran dan ekspresi protein tersebut.

Western blot adalah proses pemindahan protein dari gel hasil elektroforesis ke membran.
Membran ini dapat diperlakukan lebih fleksibel daripada gel sehingga protein yang terblot pada
membran dapat dideteksi dengan cara visual maupun fluoresensi. Deteksi ekspresi protein pada
organisme dilakukan dengan prinsip imunologi menggunakan antibodi primer dan antibodi
sekunder. Setelah pemberian antibodi sekunder, deteksi dilakukan secara visual dengan
pemberian kromogen atau secara fluoresensi. Pada deteksi secara fluoresensi, reaksi antara
antibodi primer dengan antibodi sekunder akan memberikan hasil fluoresens yang selanjutnya
akan membakar film X-ray, deteksi ini dilakukan di kamar gelap.

Langkah-langkah dalam Western Blot :

1) Menyiapkan sampel yang akan diteliti, apakah itu limfosit T atau fibroblas ataupun sel darah
tepi. Sampel harus dijaga tetap dingin.

2) Menyiapkan buffer agar pH dapat berada pada jangkauan yang stabil.

3) Menyiapkan antibodi yang akan digunakan sebagai pelacak

Monoklonal antibodi maupun poliklonal antibodi dapat digunakan

a. Antibodi monoklonal adalah yang lebih baik digunakan, karena :

• Sinyal yang lebih baik
• Spesifisitas yang lebih tinggi
• Hasil yang lebih jernih pada proses pembuatan film western blot

b. Antibodi Poliklonal
- Mengenali lebih banyak epitop

4) Melisis Sel
Kita perlu melisis sel untuk mengeluarkan protein yang diinginkan dari sel. Untuk melisis sel
dapat digunakan detergen SDS dan RIPA. Bila yang diinginkan adalah sebuah protein yang
terfosforilasi, maka perlu ditambahkan inhibitor fosfatase agar gugus fosfat pada protein tersebut
tidak dibuang. Cara melisis : sentrifuge dan ambil pellet yang terbentuk. Jaga agar tetap dingin
dengan menggunakan kotak es. Tambahkan buffer lisis, lalu kumpulkan dalam tabung
eppendorf, jaga agar tetap dingin.

5) Gel Elektroforesis
Gel yang biasa dipakai misalnya SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate- polyacrylamide gel
electrophoresis) untuk memisahkan protein berdasarkan ukurannya dengan adanya arus listrik.
Akrilamid 10% juga ditambahkan. Kerja SDS-PAGE ini adalah dengan mendenaturasi
polipeptida setelah terlebih dahulu polipeptida tersebut dibuang struktur sekunder dan tersiernya.
Sampel terlebih dahulu dimasukkan ke dalam sumur gel. Satu jalur biasanya untuk satumarker.
Protein sampel akan memiliki muatan yang sama dengan SDS yang negatif sehingga bergerak
menuju elektroda positif melalui jaring-jaring akrilamid. Protein yang lebih kecil akan bergerak
lebih cepat melewati jaring-jaring akrilamid. Perbedaan kecepatan pergerakan ini akan terlihat
pada pita-pita yang tergambar pada tiap jalur.

6) Transfer Gel
Agar protein tersebut dapat diakses oleh antibodi, maka protein tersebut harus dipindahkan dari
gel ke sebuah kertas membran, biasanya nitroselulosa atau PVDF. Membran ini diletakkan di
atas gel, dan tumpukan kertas penyerap diletakkan di atasnya. Larutan buffer kemudian akan
merambat ke atas melalui reaksi kapiler dengan membawa protein-proteinnya.

Cara lain untuk mentransfer protein adalah dengan menggunakan teknik elektroblotting. Teknik
ini menggunakan arus listrik untuk menarik protein dari gel ke membran.

Selain itu, diperlukan pula sebuah prosedur untuk mencegah terjadinya interaksi antara molekul-
molekul yang tidak diinginkan agar hasil yang diperlukan lebih jernih (to reduce ‘noise’).
Caranya adalah dengan menempatkan membran pada BSA (Bovine serum albumin) atau non-fat
dry milk dengan sedikit detergen tween 20 sehingga serum tersebut akan menempel pada pada
daerah yang tidak ditempeli protein sampel. Hal ini bertujuan untuk membuat antibodi hanya
akan dapat menempel pada binding site protein target. Setelah itu, barulah membran dengan
protein sampel tersebut diinkubasi dnegan antibodi.

7) Deteksi
Deteksi dilakukan dengan antibodi yang telah dimodifikasi bersama dengan sebuah enzim yang
disebut reporter enzyme. Proses deteksi biasanya berlangsung dalam dua tahap, yaitu :

a. Antibodi Primer
Antibodi yang digunakan di sini adalah antibodi yang pertama kali dihasilkan sistem imun ketika
terpajan protein target. Antibodi terlarut kemudian diinkubasi bersama kertas membran paling
sedikit selama 30 menit.

b. Antibodi Sekunder
Setelah diinkubasi bersama antibodi primer, kertas mebran dibilas terlebih dahulu barulah
diinkubasi dengan antibodi sekunder. Antobodi sekunder adalah antobodi yang spesifik untuk
suatu spesies pada antibodi primer. Misalnya, anti-tikus hanya akan berikatan pada antibodi
primer yang berasal dari tikus. Antibodi sekunder biasanya berikatan dengan enzim reporter
seperti alkaline fosfatase atau horseradish peroxidase. Antibodi sekunder ini kemudian akan
menguatkan sinyal yang dihasilkan oleh antibodi primer.

Sekarang, proses deteksi dapat dilakukan dengan satu langkah saja, yaitu dengan menggunakan
antibodi yang dapat mengenali protein yang diinginkan sekaligus memiliki label yang mudah
dideteksi

8) Analisis
a. Colorimetric detection
Metode ini digunakan bila substrat dapat bereaksi dengan reporter enzyme sehingga dapat
mewarnai membran nitorselulosa

b. Chemiluminescent
Metode ini digunakan bila substrat merupakan molekul yang bila bereaksi dengan antibodi
sekunder atu dengan reporter enzyme akan teriluminasi. Hasilnya kemudian diukur dengan
densitometri untuk mengetahui jumlah protein yang terwarnai. Teknik terbarunya yang paking
canggih disebut Enhanced Cheiluminescent (ECL). Teknik inilah yang paling banyak digunakan
sekarang.

c. Radioactive detection
Metode ini menggunakan X-ray yang bila mengenai label akan menciptakan region gelap.
Namun metode ini sangat maha dan beresiko tinggi terhadap kesehatan.

d. Fluorescent detection
Pelacak yang mmepunyai label yang dapat mengalami fluorosensi lalu kemudian dideteksi oleh
fotosensor seperti kamera CCD yang menangkap image digital dari western blot. Hasil kemudian
dapat dianalisi secara kuantitaif maupun kualitatif

Metode ini juga merupakan salah satu metode yang paling sering digunakan karena sangat
sensitif.

Daftar Pustaka
Andrews AT. Electrophoresis Theory, Techniques, Biochemical and Clinical Application. Clarendon
press : Oxford ; 1986.