PROSEDUR TETAP

PEMBUATAN SEDIAAN
HISTOPATOLOGI

INSTALASI/LABORATORIUM
PATOLOGI ANATOMI
RSU Dr. SOEDARSO
PONTIANAK
2004
 Daftar Isi

Daftar Isi

I. Pendahuluan

II. Tujuan

III. Dasar

IV. Definisi

V. Pembuatan Sediaan Mikroskopik Teknik Sayatan

1. Bahan Padat Lunak
Metode Parafin
1. menyiapkan bahan / jaringan
2. memproses bahan / jaringan
3. penyayatan bahan / jaringan
4. pewarnaan jaringan
2. Bahan Padat Keras

VI. Pengecatan Ulang Hematoksilin

VII. Histokimia
1. Congo Red untuk Amyloid
2. Metode Grocott untuk Jamur
3. Van Gieson untuk Collagen
4. Messon Fontana untuk Melamin
5. Periodic Acid Schiff
6. Perls’- Prussian Blue untuk Ion Besi
7. Tehnik Gomori’s untuk Retikulin
8. Cat Ziel – Neelsen untuk Bakteri Tahan Asam
9. Sudan Black B untuk Lipofuchin

DAFTAR PUSTAKA

Lampiran 1 : Prosedur Pengumpulan Spesimen

Lampiran 2 : Prosedur Pemeriksaan Metode Otopsi Klinik
Lampiran 3 : Prosedur Tetap Operasional Histo Blok
I . Pendahuluan
Untuk ketepatan pemeriksaan penyakit diperlukan pemeriksaan diagnostik yang teliti,
ditunjang oleh pemeriksaan lain-lain diantaranya pemeriksaan HPA.
Pemeriksaan sediaan HPA merupakan salah satu upaya pendekatan diagnosis, bahkan seringkali
menjadi sarana diagnosis tertentu.
Meskipun pemeriksaaan dengan cara pemeriksaan sediaan histopatologi ini sepenuhnya
ada ditangan dokter ahli dalam bidang bersangkutan, namun peran tehnisi yang melaksanakan
proses pengelolaan bahan menjadi sediaaan untuk pemeriksaaan tersebut, tidak pula kalah
pentingnya.

II . Tujuan
Membuat pemeriksaan tertentu dari organ tubuh keadaaan pra ganas atau ganas,
keradangan, gangguan hormonal, kelainan bawaan dan lain-lain.

III . Dasar
Pemeriksaan histopatologi mempunyai ketepatan yang tinggi dalam menentukan
penyebab patogenesis perubahan anatomik, perubahan morfologi sel dan jaringan, dan
merupakan pemeriksaan final.

IV . Definisi
Patologi Anatomi adalah ilmu yang mempelajari tentang penyakit, meliputi :
- Etiologi
- Patogenesis
- Perubahan anatomik
- Morfologi sel, jaringan, sub seluler dan biomolekuler
- Perubahan biokimiawi yang memberi pengaruh kepada faal tubuh
- Hubungan fungsi dan gejala yang ditimbulkan

V . Pembuatan Sediaan Mikroskopik Teknik Sayatan

V.1. Bahan Padat Lunak
Metode Parafin
Metode ini dipakai di Instalasi Patologi Anatomi dengan urutan sebagai berikut :
(1). Menyiapkan bahan / jaringan
(2). Memproses bahan / jaringan
(3). Penyayatan bahan / jaringan
(4). Pewarnaan bahan / jaringan

(1). Menyiapkan bahan / jaringan

1. Tujuan
- menghindari tertukarnya bahan
- memudahkan pencarian kembali bilamana dilakukan pemeriksaan ulang
- pengawetan bahan
- seleksi bahan
2. Tempat Bahan
- ukuran tempat disesuaikan dengan ukuran bahan.
- mulut tempat diusahakan lebar dan bertutup pulir
- tidak mudah pecah / robek, jika terpaksa harus ada pengamanannya
- harus baru, terutama bahan-bahan biopsi
3. Pemberian Label
a. Dilakukan dengan cara :
Ditulis dengan form pemeriksaan patologi anatomi secara lengkap dan tulis label pada
tempat bahan.
Adapun isi form tersebut sebagai berikut :
- Identitas Bahan : jenis bahan, cara pengambilan & nama fiksasinya.
- Identitas Penderita : nama penderita ( suami/istri ), umur, suku bangsa, jenis
kelamin dan alamatnya.
- Identitas Patologik : hasil pemeriksaan klinik, diagnosa klinik, pengobatan
yang diberikan.
- Identitas Pengirim : nama terang, alamat.
 b. Yang perlu diperhatikan dalam memberikan label:
- jumlah bahan pemeriksaan harus sesuai
- khusus permintaan radikalitas, pengirim menjelaskan posisi bahan yang
diangkatnya.
- tinta dan bahan label tidak larut dalam cairan fiksasi.

4. Pengelolaan Bahan
- Bahan operasi/kuret yang banyak mengandung darah hendaknya dicuci terlebih
dahulu dengan larutan yang isotonis, misalnya garam fisiologis, agar cairan fiksasi
tidak jenuh dengan darah.
- bahan cukup besar dan massif perlu kiranya dilakukan sayatan-sayatan tanpa
merusak bentuk dan morfologinya, agar penyerapan cairan fiksasi dari tepi ke
tengah terjadi dengan sempurna.

5. Pengawetan bahan (fiksasi)

Tujuan :
- mempertahankan struktur dan komponen sel
- mempertahankan sel dan larutan hipotonis dan hipertonis
- menambah afinitas protoplasma terhadap pewarnaan.
a) Syarat-syarat cairan fiksasi :
- Mempertahankan sel dalam jaringan tanpa bereaksi dengan cairan fiksasi tersebut.
- Tidak melarutkan unsur yang terdapat dalam jaringan
- Mempertahankan unsur-unsur tersebut pada tempat asalnya
- Memelihara susunan morfologi sel yang mendekati keadaan hidup jaringan.
- Tidak bereaksi dengan pewarnaan yang akan dipakai.
b) Cairan fiksasi yang digunakan di Instalasi PA RSU Dr. Soedarso :
1. Larutan Formalin 10 %
R/ Formaldehid 38 – 40 % 10 ml
Air suling 90 ml
2. Larutan Formalin Buffer
R/ Formaldehid 38 – 40 % 100 ml
Air suling 900 ml
Sodium hidrogen fosfat 4 g.
Disodium hidrogen fosfat 6,5 g.
Adapun sifat-sifat Formaldehid :
- Sifat-sifat fisik : bau menusuk, gas tidak berwarna
- Sifat-sifat kimia : - dapat bercampur dengan alkohol
- mudah teroksidasi menjadi asam formiat
- bersifat desinfectan dan antiseptik
- mengiritasi kulit
- mengiritasi mukosa hidung dan mata
Dalam proses fiksasi jaringan banyak faktor yang berpengaruh, antara lain : pH,
suhu, daya tembus cairan fiksasi, volume cairan fiksasi, konsentrasi, lamanya fiksasi,
dsb.
Kesempurnaan proses fiksasi dapat dinilai dengan menggunakan cara :

d = k.  t

Dimana : d adalah dalamnya cairan fiksasi menembus jaringan (mm)

k adalah konstanta cairan fiksasi
misal : k. formalin 10 % = 0,78
k. asam acetat 5 % = 1,2
t adalah waktu fiksasi ( jam )
Dari rumus tsb maka jelas bahwa ketebalan jaringan dan lamanya fiksasi sangat
menentukan kesempurnaan proses fiksasi.
 6. Pemeriksaan bahan basah secara makroskopik :
- Deskripsi bahan (berat, bentuk, konsistensi, batas ukuran, gambaran pada irisannya,
dsb)
- Jika dilakukan hal-hal tertentu ( pendidikan ) :
 bahan basah dilakukan pemotretan
 bahan basah (sisa) dimuseumkan
- Seleksi bahan basah sesuai dengan petunjuk pemotongan makroskopik yang
diutarakan oleh ‘Ackerman’.
- Seleksi potongan bahan basah dimasukkan ke dalam kaset atau kapsul yang dibuat
dari stainless steel / plastik dan berlabel.

7. Penyimpanan sisa bahan basah

- Sisa bahan basah disimpan secara berurutan dan dikelompokkan sesuai tanggal
pemotongan bahan basah.
- Berikan cairan fiksasi jika dirasa masih kurang
- Lama penyimpanan kurang lebih 7 – 14 hari, kemudian dibakar, KECUALI untuk
hal – hal tertentu.

(2) Memproses bahan / jaringan

Memproses bahan yang rutin dilakukan di Instalasi PA RSU Dr. Soedarso menggunakan
alat Auto technicon selama 21 jam.
Ada 2 macam teknik yang dilakukan :
1. Teknik rutin : ( ketebalan 3 – 5 mm )
a. Dehidrasi
Tujuan : penarikan air secara bertahap .
I. Formalin 10 % 2 jam pk. 11.00
II. Alkohol 70 % 1 jam pk. 13.00
III. Alkohol 80 % 2 jam pk. 14.00
IV. Alkohol 95 % 2 jam pk. 16.00
V. Alkohol 96 % 2 jam pk. 18.00
VI. Alkohol 96 % 1 jam pk. 20.00
VII. Alkohol 96 % 2 jam pk. 21.00
b. Penjernihan ( clearing )
Tujuan : mentransparankan serta menggantikan larutan alkohol dari jaringan.
Tabung :
VIII. Xylol 1 jam pk. 23.00
IX. Xylol 2 jam pk. 24.00
X. Xylol 2 jam pk. 02.00
c. “Impregnasi”
Tujuan : menyamakan keadaan jaringan dengan bahan pengeblokan (Embedding).
Tabung :
XI. Parafin cair (58- 2 jam pk. 04.00
o
60 C) 2 jam pk. 06.00
XII. Parafin cair (58-
60oC)
d. Pengeblokan (Embedding)
Tujuan : mempermudah penyayatan dengan mikrotom.
Dilakukan dengan cara :
- Alat cetak disusun di alas yang permukaannya halus dan rata, seperti : kaca,
vermika, dsbnya, yang telah diolesi dengan gliserin.
- Siapkan dua tempat parafin cair dengan temperatur optimum (cukup air) tetapi
tidak mengembangkan alat cetak blok (logam) yang berakibat merembesnya
parafin cair pada alat tersebut.
o Tempat I : parafin sebagai bahan embedding.
o Tempat II : parafin sebagai media penyesuaian temperatur jaringan yang
akan ditanam.
- Tuangkan parafin (tempat I) kedalam alat cetak hingga penuh pada
permukaannya.
- Letakkan /tanamkan posisi jaringan yang sesuai.
- Bila parafin pada alat pencetak sudah cukup keras, alat cetak dilepas dan lakukan
pemotongan blok dengan silet pada ukuran tertentu.
 2. Teknik Cepat ( ketebalan kurang dari 3 mm )
Umumnya biopsi dari THT.
Bahan / jaringan segar dilakukan :
- Fiksasi dengan larutan formalin 10% selama 20 menit pada suhu 60°C.
- Cuci dengan air mengalir beberapa kali.
- Dehidrasi dengan aceton sebanyak 2 kali.
 aceton selama 20 menit
 aceton selama 20 menit
- Clearing dengan xylol sebanyak 2 kali
 xylol selama 10 menit
 xylol selama 15 menit
- Impregnasi dengan parafin cair sebanyak 2 kali.
 parafin cair (58-60° C ) selama 20 menit
 parafin cair (58-60° C ) selama 60 menit

(3). Penyayatan Bahan / Jaringan

- Blok yang sudah keras ditempelkan pada alat pemegang blok (holder block) dengan
bantuan lempengan besi tipis yang telah dipanaskan.
- Dinginkan pada suhu kamar sampai melekat erat.Hal ini dapat dipercepat dengan cara
memasukkan ke dalam air / potongan es, selanjutnya dilakukan “triming”.
- Persiapkan mikrotom putar antara a.l. : ketajaman pisau dan sudut kemiringannya.
- Persiapkan ‘water bath’a.1. : kebersihan dan temperatur air (dibawah titik leleh parafin)
- Persiapkan gelas obyek a.1. : perekatnya (egg with glycerine), jangan terlalu tebal dan
ingat label penderita harus diurut.
- Blok yang sudah menempel pada “holder block”, pasangan pada mikrotom dan atur
ketebalan sayatan sesuai dengan kebutuhan.
- Lakukan penyayatan blok sehingga mendapatkan sayatan yang baik dalam bentuk pita
memanjang.
- Angkat sayatan yang diperoleh dan dimasukkan pada ‘water bath’ agar sayatan
mengembang dengan baik.
- Seleksi sayatan yang terbaik dan angkat dengan gelas obyek sesuai dengan label
penderitanya.
- Keringkan dalam suhu kamar dan masukkan dalam oven pada suhu optimum (58-60° C)
kurang lebih selama 30 menit.

(4). Perwarnaan Jaringan

Dalam pelaksanannya, ada 2 metode pewarnaan yang rutin dipakai :
1. Pewarnaan Progresif
2. Pewarnaan Regresif
Kedua metode pewarnaan ini rutin dipakai di Instalasi / Laboratorium Patologi Anatomi
RSU Dr. Soedarso Pontianak.

A. Reagen Pewarnaan.
1. Mayer’s Hematoksilin
Cat utama merupakan Alum Hematoksilin yang proses pemasakkannya secara kimia
dengan memakai oksidator Potassium iodat.
R/ - Kristal hematoksilin 1 gr
- Air suling 1000 ml
- Potassium Alum 50 gr
- Asam sitrat 1 gr
- Chloral hidrat 50 gr
- Sodium iodat 0,2 gr
Cara pembuatannya :
- Kristal hematoksilin, potassium alum dam sodium iodat dilarutkan dalam air
suling.
- Panaskan dan aduk hingga semua campuran tersebut larut.
- Simpan pada suhu kamar semalam.
- Tambahkan chloral hidrat dan asam sitrat pada campuran tersebut.
- Dinginkan dan saringlah bahan cat tersebut sebelum dipakai simpan dalam botol
yang gelap pada suhu kamar.
2. Harris’s Hematoksilin
Cat utama merupakan Alum Hematoksilin yang proses pemasakkannya secara kimia
dengan menggunakan oksidator Merquri oksida.
R/ - Kristal hematoksilin 2,5 gr
- Alkohol absolut 25 ml
- Potassium alum 50 gr
- Air suling 500 ml
- Merquri oksida 1,25 gr
- Asam asetat glasial

Cara Pembuatannya :
- Larutkan kristal hematoksilin dalam alkohol absolut
- Larutkan potassium alum dalam air suling pada tempat yang lain dengan
pemanasan.
- Campurkan kedua larutan tersebut dan segera dipanaskan.
- Tambahkan sedikit demi sedikit merquri oksida secara berlahan-lahan sambil
dikocok.
- Dinginkan dengan memasukkan labu tersebut kedalam air dingin / potongan-
potongan es.
- Larutan ini adalah “Stock Solution” Harris’s Hematoksilin.

“Working Solution” Harris’s Hematoksilin :

R/ Stock Solution 200 ml
Asam glasial asetat 2-4 tetes.
- Saringlah bahan cat tersebut sebelum dipakai dan disimpan dalam botol
gelap.
Catatan :
“Working Solution” dibuat sesuai dengan kebutuhan, jangan terlalu banyak.

3. Eosin 1% ( cat pembanding)

R/ - Kristal eosin Y 1 gr
- Air suling 20 ml
- Alkohol 96 % 80 ml
- Asam asetat glasial

Cara membuatnya :
- Larutkan kristal eosin Y dengan air suling.
- Tambahkan alkohol 96 % sebanyak 80 ml.
- Larutan ini adalah stock solution eosin 1 %.

“Working Solution”
R/ Stock solution eosin 1% 20 ml.
Alkohol 80% 60 ml.
- Setiap 100 ml working solution, tambahkan 0,5 ml glasial asetat.

4. Alkohol Asam 1 %
R/ - Alkohol 70 % 99 ml
- Hcl pekat 1 ml

5. Ammonia Air
R/ - Air suling 1000 ml
- Ammonia 28 % 2-3 ml

6. Egg With Glycerine

R/ - Putih telur 1 bagian
- Gliserin 1 bagian
B. Teknik Perwarnaan

1. Pewarnaan Progresif

- Deparafinisasi :
- Xilol 5 menit
- Xilol 5 menit
- Xilol 5 menit

- Hidrasi :
- Alkohol 96 % 2 menit
- Alkohol 96 % 2 menit
- Alkohol 80 % 2 menit
- Masukkan ke air selama 10 menit
- Cat Utama :
= Mayer’s hematoksilin selama 15 menit / dengan
= Harris’s Hematoksilin selama 10 menit.
- Cuci dengan air mengalir selama 20 menit.
- Lihat dengan mikroskop: inti sel biru terang, sitoplasma tidak berwarna (jernih).
- Cat pembanding :
- Eosin 1 % selama 0,5-1 menit.
- Dehidrasi :
- Alkohol 80 % 2 menit
- Alkohol 96 % 2 menit
- Alkohol 96 % 2 menit

- Penjernihan ( Clearing ) :
- Xilol 5 menit
- Xilol 5 menit
- Xilol 5 menit
- “Mounting” : - dengan entelan (medium minyak)

2. Perwarnaan Regresif.

- Deparafinisasi
- Hidrasi
- Air
- Cat utama biasanya Harris’s Hematoksilin
- Air
- Alkohol asam 3 - 5 celup
- Ammonia air 5-10 celup
- Lihat pada mikroskop : inti biru terang, sedangkan sitoplasma jernih.
- Cat pembanding : dengan eosin 1 %
- Dehidrasi
- Penjerihan / Clearing
- ‘Mounting’

3. Hasil Perwarnaan

- Inti : biru terang dan tampak butir-butir kromatin

- Sitoplasma : merah
V.2 Bahan Padat Keras

1. Fiksasi
Seperti halnya pada bahan padat lunak.
2. Dekalsifikasi
Proses dekalsifikasi adalah suatu proses penarikan kalsium secara perlahan-perlahan
pada bahan padat keras.
a) Larutan dekalsifikasi
1. Asam formiat 10% dalam formalin
R/ Asam formiat pekat 10 ml
Larutan formalin 10% 90 ml
2. Asam nitrat 3-5% dalam formalin
R/ Asam nitrat pekat 3 ml
Larutan formalin 10% 97 ml
b) Teknik dekalsifikasi
Larutan dekalsifikasi yang digunakan di Instalasi PA RSU Dr. Soedarso Pontianak
adalah asam formiat 10 % dan asam nitrat 3 % dalam formalin.
Khusus tulang yang mengandung jaringan lunak, larutan yang digunakan adalah asam
formiat 10 %.
Cara kerja :
- Masukkan bahan padat keras dengan ukuran tidak terlalu besar kedalam larutan
dekalsifikasi sebanyak 30 s/d 60 kali volume bahan tersebut, dan amati
perubahannya, jika ada gelembung udara berarti proses dekalsifikasi berjalan
baik.
- Larutan dekalsifikasi setiap hari harus diganti, agar larutan dekalsifikasi
afinitasnya tetap baik.
- Jika gelembung udara sudah tidak nampak, kemungkinan bahan padat keras
(tulang) sudah lunak, akan tetapi untuk menyakinkannya ambil jarum dan
tusukkan pada beberapa tempat.
- Cuci dengan air mengalir.
- Bahan siap diproses lebih lanjut.
3. Pemrosesan Bahan
Seperti halnya bahan padat lunak.
4. Penyayatan Bahan
Seperti halnya bahan padat lunak.
5. Pewarnaan Jaringan
Seperti halnya bahan padat lunak

VI. Pengecatan Ulang Hematoksilin Eosin

Tujuan : untuk menyempurnakan hasil pengecatan HE (Hematoksilin Eosin)

Untuk melakukan penyempurnaan hasil pengecatan HE (Hematoksilin Eosin), harus

diperhatikan media tempat terjadinya kesalahan dan media tempat diketahuinya kesalahan.

Cara kerja :
- Tentukan media tempat terjadinya kesalahan dan media tempat diketahuinya kesalahan.
- Lakukan penyesuaian media, biasanya media perantara adalah larutan alkohol.
- Jika media tempat terjadinya kesalahan adalah air dan media tempat diketahui kesalahan
adalah minyak maka media perantara adalah alkohol dari konsentrasi tinggi ke
konsentrasi rendah, yaitu alkohol 50 % dan sebaliknya.
- Lakukan penyempurnaan kesalahan dan ikuti prosedur pewarnaan selanjutnya.
VII. Pengecatan Histokimia

1. Congo Red Untuk Amyloid

Prinsip pengecatan
Congo Red adalah molekuler linier yang keliniernya mengikuti ketetapan hidrogen pada
grup aso dan amin pada jarak yang sejajar dengan karbohidrat dengan akar amyloid. Untuk
menghilangkan latar belakang cat akibat dari ikatan ion kimia dengan komponen jaringan lain,
maka ditambahkan alkohol alkaline / basa sehingga Congo Red dapat berikatan dengan amyloid
yang ditampakkan oleh warna hijau.

Larutan
- Harris’s / Mayer’s Hematoksilin
- 0,5 % Congo Red
- 0,2 % Potassium Hidroksida (KOH) dalam alkohol 80 %

Cara Pengecatan
- Deparafinisasi
- Hidrasi
- Air
- Inti cat dengan Harris’s / Mayer’s Hematoksilin
- Di cuci dengan air
- Cat dengan Congo Red selama 5 menit
- Berikan KOH 0,2 % dalam alkohol 80 % selama beberapa detik
- Dehidrasi dengan alkohol absolut sebanyak 3 kali
- Jernihkan dengan xilol sebanyak 2 kali
- Mounting dengan entelan.

Hasil Pengamatan
Amyloid …………merah (lihat dengan sinar)
…………Hijau “berefringence” (lihat dengan sinar polaroid)
Inti ………….biru
Jaringan elastis……..merah muda
2. Metode Grocott Untuk Jamur

Prinsip Pengecatan
Metode Grocott secara selektif menggambarkan penghitaman jamur oleh endapan logam
perak. Jaringan yang telah berlabel dengan chromic acid merupakan jaringan yang telah
teroksidasi sehingga polisakarida dari jamur termasuk dalam grup aldehide. Zat asam selalu
digunakan untuk oksidasi beberapa aldehide, terutama dalam kolagen dan dasar membran, untuk
mengganti substansi dalam jumlah yang besar dari polisakarida seperti glikogen, mucin dan
dinding sel jamur dimana mudah bereaksi dengan reagen perak.
Asam chromic dihilangkan dengan pencucian sodium metabisolfat. Larutan alkaline
perak nitrat dihasilkan oleh grup aldehide untuk produksi endapan logam perak.
“Methenamine” digunakan dalam larutan perak nitrat untuk membuktikan adanya
alkaline, sedangkan “borax” dipakai sebagai bahan buffer.
Perlakukan terakhir dengan memberikan sodium thiosulfat yang digunakan sebagai fiksasi dari
reaksi silver dan menghilangkan efek samping yang bukan merupakan reaksi silver.

Larutan
1. Stok larutan methenamine perak nitrat
- 5 % perak nitrat/silver nitrate 5 ml
- 3 % methenamine (hexamine) 100 ml
2. Methenamine silver nitrate siap pakai
- 5 % sodium tetraborate (borax) 2 ml
- Aquades 25 ml
- Stok methenamine silver nitrate 25 ml
* Catatan : Campurkan sodium tetraborate dengan aquades kemudian tambahkan
stok methenamine silver nitrate.
3. 5 % Chromic Acid
4. 2 % Sodium metabilsulfat
5. Stok larutan light green
- Light green S.F. yellowish, C.I.42095 0,2 gr
- Aquadest 100 ml
- Glacial acetic acid 0,2 ml
6. Larutan light green siap pakai
- Larutan stok light green 10 ml
- Aquadest 100 ml

Cara Pengecatan :
- Deparafinisasi
- Hidrasi
- Air
- Dioksidasi dalam 1 % periodic acid selama 10 menit
- Cuci dengan air mengalir
- Dioksidasi dalam 5 % chromic acid selama 45 menit
- Cuci dengan air mengalir selama 2 menit
- Direndam dalam sodium metabisulfat selama 1 menit
- Cuci dengan air mengalir selama 1 menit
- Bersihkan 3 kali dalam aquades selama 1 menit setiap pembersihan
- Masukkan slide pada larutan methenamine silver nitrat yang siap pakai dalam oven
dengan suhu 58°C selama 45 menit (jangan memakai tempat yang terbuat dari logam).
Sayatan tampak coklat kekuningan.
- Cuci dengan aquades sebanyak 3 kali
- Slide difiksasi dengan 5 % sodium thiosulfat selama 3 menit
- Cuci dengan air mengalir selama 5 menit
- Cat dengan larutan light green yang siap pakai selama 30 detik
- Dehidrasi dengan alkohol
- Clearing dengan xilol
- Mounting dengan entelan.
Hasil Pengecatan
Jamur……………………hitam
Mucin……………………abu-abu
Background……………..hijau
3. Van Gieson Untuk Kolagen

Prinsip Pengecatan
Pengecatan van Gieson adalah cat khusus yang memberikan warna merah pada kologen
dengan latar belakang kuning.
Metode ini memakai pengecatan hematoksilin secara langsung, dimana “Ferric-chloride”
sebagai mordan tergabung kedalam larutan cat. Hal ini memungkinkan inti dipertahankan tetap
berwarna biru hitam dengan hematoksilin melalui asam kuat dari acid fuchsin. Acid fuchsin
terdiri dari 2 cat yaitu molekul ‘anionic’ kecil dari cat picric acid dan molekul ‘anionic’ besar
dari cat acid fuchsin.
Cytoplasma tertentu tidak dapat ditembus oleh kolagen tertentu. Oleh karena itu, ketika
acid fuchsin dimasukan kedalam jaringan, molekul anionic kecil segera menembus jaringan dan
mudah terikat pada jaringan,sebaliknya molekul anionic yang besar hanya mudah menembus
kolagen. Ketika jaringan didehidrasi oleh alkohol, “picric acid” dikeluarkan dari kolagen
sehingga “acid fuchsin”dapat memberikan warna merah.

Larutan :
1. Larutan Van Gieson
* Dari buku owen
- 1 % Acid fuchsin 10 ml
- Jenuhkan dengan picric acid 90 ml
- Tambahkan aquades 100 ml
- Didihkan larutan ini selama 3 menit supaya matang
* Dari buku bancroft
- 1% acid fuchsin 50 ml
- Jenuhkan dengan picric acid 90 ml
- Tambahkan aquades 50 ml
- Didihkan larutan ini selama 3 menit supaya matang.
2. Mayer’s / Harris’s Hematoksilin

Cara Pengecatan:
- Deparafinisasi
- Hidrasi
- Air
- Cat dengan Mayer’s / Harris’s Hematoksilin selama 10-15 menit
- Cuci dengan air mengalir selama 5-10 menit
- Cat dengan van Gieson selama 1-3 menit
- Cat van Gieson hisap dengan kain kasa (di-blot)
- Dehidrasi dengan alkohol
- Clearing dengan xilol
- Mounting dengan entelan

Hasil Pengecatan :
- Collagen/jaringan ikat..…………………merah
- Inti………………………………………hitam-coklat gelap
- Jaringan lain /otot…..……………….…..kuning
4. Masson Fontana Untuk Melanin

Prinsip Pengecatan
Cat Masson Fontana ini menunjukkan bentuk melanin dan tanda-tanda adanya melanin,
berdasar pada argentafin yang ada dalam melanin dengan larutan ammonia silver nitrate, yaitu
melanin dapat menurunkan hasil larutan ammonia silver nitrate kelogam perak tanpa
menggunakan suatu bahan dari luar. Sayatan-sayatan diberi dengan larutan sodium thiosulfat
untuk menentukkan logam perak dan untuk menghilangkan bahan yang bukan hasil reaksi perak.
Reaksi yang tidak spesifik untuk melanin seperti substansi lain yaitu “granula argentafin”,
“chromaffin” dan beberapa lipofuchsin juga ditunjukkan dengan memakai metode ini.

Larutan Silver nitrat :

- 10 % silver nitrat 10 ml, tambahkan Amonia pekat tetes demi tetes sampai terbentuk
presipitat yang hampir larut atau hilang. Bentuk - bentuk tersebut (titik-titik
Ovalessen) akan terbentuk jelas atau terang pada titik akhir reaksi.
- Jika terlalu banyak penambahan Amonia maka dapat ditambahkan 10 % silver nitrat
tetes demi tetes sampai berisi titik-titik Ovalessen.
- Kemudian tambahkan 20 ml aquadest dan saring.
- Simpan dalam botol gelap ( tahan selama 4 minggu ).

Cara Pengecatan :

- Deparafinisasi, hidrasi, air.

- Cat sediaan dengan larutan silver pada temperatur kamar semalam.
(untuk mempercepat reaksi maka larutan silver dipanaskan sampai suhu 37 0C, di
cat selama 45 menit ).
- Cuci dengan air.
- Cat pembanding dengan 1 % Neutral Red selama 3 menit.
- Cuci dengan air.
- Dehidrasi, clearing, mounting.

Hasil Pengecatan

- Melanin……… ……………… hitam

- Argentafin……………………… hitam
- Chromafin……………………… hitam
- Lipofuchsin………………..…… hitam
- Inti ………………………………merah
5. Periodic Acid Schiff ( PAS )

Prinsip Pengecatan
Karbohidrat mengandung 1,2 glycon atau equivalen dari amino/sederajat dengan
alkylomino yang teroksidasi oleh periodic acid, periodic acid selanjutnya tidak mengoksidasi
dialdehide-dialdehide yang baru saja terbentuk.
Reagen Schiff’s (fuchsin-sulphurous acid dan tak berwarna) bereaksi dengan dialdehid-dialdehid yang
membentuk chromophore dari cat triarylmethane (struktur cincin quinoid) yang berwarna merah magenta.
C H 2
O H C H 2
O H
O - O
H H O H H O
+ HIO4 -
O O H H O H H H
C C
H O H
O O
C H 2O H
+
O -
H H O
H H F(SO2H)2
O - H
C C Schiff’s Reagent
F
Larutan
A. ½ -1 % Periodic Acid (HIO4.2H2O)
B. Reagen Schiff’s
1. Aquades yang telah dipanaskan, didinginkan sampai suhu 70°C.
2. Tambahkan 4 gram dari basic fuchsin.
3. Dinginkan sampai suhu 50°C dan saring.
Pertahankan suhu tersebut dengan memasukkan kedalam oven.
4. Tambahkan 8 ml Hcl dan 8 gram potassium metabisulfit dan campur.
5. Simpan dalam botol selama 24 jam diruang gelap.
6. Tambahkan 4 gram charcoal (arang) dan campurkan.
7. Tunggu 5 menit, kemudian saring dan simpan dalam botol gelap.
Catatan : Charcoal untuk menghilangkan kelebihan sulfur dalam larutan dengan
kontaminasi cat yang berwarna kuning yang tidak specifik. Larutan menjadi tidak
berwarna. Bila berwarna kuning lemah/merah muda sebaiknya dibuang. Simpan
cairan ini dalam almari es.
Tes untuk larutan Schiff’s :
Taruh 10 ml dari 37-40 % formaldehyde dalam petridish (tempat yang terbuat dari kaca)
kemudian teteskan larutan Schiff’s beberapa tetes. Jika larutan tersebut terbentuk warna
merah magenta secara cepat, maka berarti larutan tersebut baik.
C. Mayer’s Hematoksilin (lihat lampiran depan).
Pengecatan :
- Deparafinisasi
- Hidrasi
- Air
- Berikan larutan Periodic Acid selama 5-10 menit
- Cuci dengan air
- Berikan larutan Schiff’s selama 15 menit
- Rendam dalam air selama 10 menit
- Cat dengan Mayer Hematoksilin selama 10 menit
- Dehidrasi dengan alkohol
- Clearing dengan xilol
- Mounting dengan entelan
Hasil Pengecatan : * Positif bila berwarna merah magenta

PAS-positif pada komponen-komponen jaringan

I Polisakarida : glycogen, selulose
II Mucopolisakarida : MPS dari ‘gastric mucin’ polisakarida dari
kapsul bakteri.
III Muco dan glikoprotein : Air liur, FSH, LH ‘seromucoid’, TSH,
Blood group A, substances Thyroglobulin
IV ‘Glyolipids’ : Gangliosides-insital, cerebroside-phrenosin,
kerasin, phosphatides
V Unsaturated lipids and phospholipids : Sphingomyelin,lipofuchsin,cardiolipid,ceroid
6. Perls’ Prussian Blue Untuk Ion Besi
Prinsip Pengecatan
Endapan baru yang dihasilkan tergantung pada reaksi dari ferri ferrocyanide. Apabila ion
ferri dalam jaringan bereksi dengan ion ferrocyanide dalam suasana asam, maka asam berfungsi
membebaskan ion ferri dari senyawa-senyawa yang tidak reatif terhadap protein.
Ion besi yang bersenyawa dalam jaringan mempunyai ikatan yang lebih kuat dari pada
ion besi yang bersenyawa dalam hemoglobin dan tidak dapat dibebaskan dengan suasana asam
tetapi harus menggunakan reaksi hidrogen perioksida.

Larutan :
1. 2 % Hydrochloric Acid (HCl)
2. 2 % Potassium ferrocyanida ( K4Fe (CN)6 3.H2O)
Pengecatan :
1. Deparafinisasi, hidrasi, air
2. Saring 60 ml dari 2 % HCl kedalam beaker glass 100 ml, kemudian saring juga 60 ml
dari 2% Potassium Ferrocyanida kedalam beaker glass 100 ml yang lainnya. Masing-
masing larutan tersebut diambil 30 ml dan masukkan kedalam beaker glass yang lain
kemudian campurkan. Demikian juga dengan sisanya.
3. Sediaan di cat dengan campuran pertama selama 15 menit, kemudian diganti
dengan campuran kedua selama 15 menit.
4. Cuci dengan air
5. Cat, dengan Eosin sebagai cat pembanding
6. Dehidrasi
7. Clearing
8. Mounting

Hasil Pengecatan :

Besi (Garam ferri)………………………..biru gelap

Background jaringan …………………….kemerah-merahan/pink
7. Teknik Gomori’s Untuk Retikulin

Prinsip Pengecatan
Teknik peliputan/impregnasi perak adalah cat yang selektif terhadap sabut-sabut retikulin
oleh reaksi reduksi ‘ammoniacal silver’.
Sabut-sabut retikulin yang tidak diperlakukan seperti di atas mempunyai
afinitas/kemampuan kecil untuk penimbunan perak/silver. Sabut-sabut itu harus dioksidasi dan
disensitisasi. Grup hydroxyl dari ‘hexose sugars’ dari glycoprotein yang membentuk sabut-sabut
reticulin dioksidasi oleh potassium permanganate terhadap grup aldehide. Potassium
permanganate dihilangkan dengan potassium metabilsulfat.
‘Iron alum’ kemudian digunakan sebagai ‘sensitiser. Hal tersebut membentuk ikatan
antara logam organik dengan sabut-sabut retikulin, kemudian diganti oleh ion silver.
Ketika ammonia silver ditambahkan, aldehide mengurangi ion diamine silver pada ion
logam dan hal ini mengakibatkan berkurangnya logam silver oleh larutan formadehyde. Silver
yang tidak bereaksi dihilangkan dengan sodium thisosulfat yang membentuk sekumpulan silver
yang dapat dilarutkan dengan ion silver yang tidak bereaksi.
Untuk mengecat background maka dipakai gold chlorida.

OH MnO4 CHO + 2 (Ag(NH3)2) + 3 H2O

Retikulin retikulin
Oxidasi
OH CHO + 2 (Ag(NH3)2) + 3 H2O

COOH _
retikulin + 4 Ag + 8 NH + 4 OH

COOH

Ag + 2 NA2S2O3 Na+ + Na3Ag(S2O3)2

Larutan :
1. 1 % larutan potassium permanganate
2. 2 % larytan potassium metabisulfat
3. 3 % larutan ferri ammonia/iron alum
4. Silver nitrate/larutan silver.

Cara Pembuatan :
- 10 % larutan potassium hidroksida…………………………..10 ml
- 10 % larutan silver nitrate……………………………………40 ml
- Campurkan kedua larutan tersebut maka akan terbentuk presipitasi (endapan
kecoklatan), kemudian buang supernatannya sehingga hanya tinggal endapannya
saja.
- Cuci endapan tersebut beberapa kali (lebih kurang 5 kali)
- Tambahkan ammonia tetes demi tetes sampai hanya tinggal sedikit sekali
presipitatnya (warna abu-abu/sedikit bintik-bintik kecil hitam)
- Encerkan dengan aquades sebanyak 100 ml
- Saring dan simpan dalam botol gelap.

5. 4 % larutan formalin
6. 0,2 % gold chlorida
7. 2 % larutan thiosulfat
8. Larutan Eosin / van Gieson
Teknik Gomori’s Untuk Retikulin (2)

Pengecatan :
1. Deparafinisasi
2. Hidrasi
3. Air
4. 1 % larutan potassium permanganate selama 2 menit
5. Dicuci dengan aquades
6. 2 % larutan ferri ammonia selama 2 menit
7. Cuci dengan aquades
8. Silver nitrate selama 1 menit
9. Cuci dengan aquades
10. 10 % Larutan formalin selama 3 menit
11. Cuci dengan aqudes
12. Gold chlorida selama 2 menit
13. Cuci dengan aquades
14. 2 % larutan potassium metabisulfat selama 1 menit
15. Cuci dengan aquades
16. 5 % larutan sodium thiodsulfat selama 1 menit
17. Cuci dengan aquades
18. Larutan eosin / 1 % neutral red fuchsin selama 30-45 detik
19. Dehidrasi
20. Clearing
21. Mounting

Hasil Pengecatan :
Sabut-sabut retikulin……………………..hitam
Inti………………………………………..abu-abu
Jaringan yang lain………………………..tergantung pada cat pembanding
Background………………………………kuning
8. Cat Ziel-Neelsen Untuk Bakteri Tahan Asam

Prinsip Pengecatan:
Bakteri tahan asam ditunjukkan oleh perwarnaan jaringan dengan carbol fuchsin dan
kemudian dibedakan dalam acid alkohol. Bakteri tahan asam akan menyimpan cat sedangkan
bakteri yang lain tidak.
Larutan carbol fuchsin adalah suatu cat phenylmethane dan dilarutkan dalam fenol dan
alkohol, fenol dan alkohol ini untuk memperjelas pengecatan. Fenol ini bekerja dengan mengikat
cat yang ada didalam bakteri tahan asam.

Larutan :
1. Carbol Fuchsin
- Basic fuchsin………………………………..10 gram
- Phenol liquid berbentuk kristal maka masukkan kedalam (jika phenol berbentuk
kristal maka masukkan kedalam beaker glass kemudian bemankan ke dalam air
panas.
- Alkohol absolut……………………………..100 ml
- Aquades………………………………..……900 ml
Cara Pembuatannya :
Basic fuchsin dilarutkan kedalam alkohol, kemudian ditambahkan phenol dan air.
2. Acid Alkohol
- HCL ………………………………………… 20 ml
- Alkohol absolut……………………………. 700 ml
- Aquades…………………………………. …300 ml
3. Methylene Blue
- 1 % larutan methylene blue………..………….1 ml
- Aquades ………………………………..… ..100 ml
Pengecatan :
- Deparafinisasi
- Hidrasi
- Air
- Slide dicat dengan carbol fuchsin yang telah disaring dan diinkubasi dalam oven
pada suhu 60°C selama 1 jam.
- Dinginkan pada suhu kamar
- Cuci dengan air
- Cat dengan 2 % HCl dalam 70 % alkohol selama 20 detik
- Cuci dengan air setelah 5 detik kemudian dituangi lagi dengan acid alkohol dan
dilakukan 4 kali supaya penghilangan warnanya tampak jelas.
- Cuci dengan air
- Bandingkan dengan methylene blue yang telah disaring selama 30-60 detik.
- Lihat di mikroskop dan lakukan pengecatan dengan methylene blue lagi, jika
perlu.
- Keringkan dengan cara di-blot dengan kertas saring
- Clearing dengan xilol
- Mounting dengan entelan.

Hasil Pengecatan :

Bakteri tahan asam…………………………………merah

Background…………………………………………biru pucat
9. Sudan Black B Untuk Lipofuchsin

Prinsip Pengecatan :
Cat Sudan Black B akan berikatan dengan lemak dan sisa-sisa cat yang tidak terikat akan
dihilangkan dengan alkohol sehingga back-ground akan berwarna abu-abu pucat.

Larutan :
Jenuhkan Sudan Black dalam alkohol 70 %

Pengecatan :
- Tuangi slide dengan alkohol 70 %
- Cat dengan larutan sudan black B yang telah disaring
- Sisa-sisa cat dihilangkan dengan alkohol 70 % sampai back-groundnya berwarna
abu-abu pucat.
- Cuci dengan air
- Mounting dengan glycerin

Hasil Pengecatan:
- Lipofuchsin ……………………………………hitam
- RBC’S ..…………………………………..hitam
- Background …………………………..abu-abu pucat

Catatan :

Cara pemotongan jaringan seperti pada teknik potong beku / Vries Coupe kemudian
potongan jaringan tersebut dicat.
 DAFTAR PUSTAKA

1. BANCROFT, J.D. & Stevens, A., Theory and Practice of Histological Techniques,
Churchill/Livingstone, London, 1982, pp. 162-163, 254-256.

2. CULLING, C.F.A., Hnadbook of Histopathological Techniques, 2nd. ed., Butterworths,

London-1963, pp. 241-242.

3. KIERNAN, J.A., Histological and Histochemical Methods: Theory & Practice, Pergamon
Press, Sydney-1981, pp. 93-94, 97-102.

4. LUNA, L.G., Mannual of Histochemical Staining Methods of The Armed Forces Institute of
Pathology, 3rd. ed. McGraw-Hill Book Company, Sydney-1968, pp. 33, 104-105, 184.

5. MC MANUS, J.F.A., Histological Demonstration of Mucin after Periodic Acid, London-

1946, pp. 202.

6. PERLS, M., Histochemistry, 2nd., J & A Churchill Ltd., 1960, pp. 231-236, 284-286,
683, 931.

7. PERLS, M., Virchow – Arch Pathology Anatomi, 1867, Volume 39, pp. 42.

8. SHEEHAN, H.T & Hrapchak, B.B., Theory and Practice of Histotechnology, 2nd. ed., C.V.
Mosby Co., St. Louis-1980, pp. 139-140, 143-147, 161-162, 168-170.
 PROSEDUR TETAP
PATOLOGI ANATOMI

SPESIMEN

PADAT CAIR

KERAS LUNAK

DEKALSIFIKASI TEKNIK

- ASAM FORMIAT 10 - ASP TEKNIK HAPUSAN

% IRASI
(5 X 24 JAM)
- ASAM NITRAT 3 – 5
CAIR
% - IMP
RINT

METODE PARAFIN DX.CEPAT

(3 X 24 JAM) (15 - 30
MENIT) KERING BASAH
FNA PAP. TES
(15 - 30 (1 –2 JAM)
MENIT)

FIKSASI

CAT CAT
PROSES OTOTEKNIKON - DIFF.QUI - PAP
CK - HE
- HE
PENYAYATAN
MIKROTOM POTONG BEKU

CAT. HE

CAT KHUSUS
(2 – 3 JAM)

- HISTOKIMIA
- IMUNOHISTOKI
MIA
DIAGNOSA
PATOLOGI ANATOMI