Praktikum ke-1 Hari/Tanggal: Senin/3 September 2018

Mk. Pengantar Desain Alat Uji Praktis Asisten : Anisa Nursista

dan Metode Deteksi Mutu Bahan Baku Yuly Astuti
Hasil Perairan Aulia Sekar Sari
Kinanti Permata S

DETEKSI Salmonella spp. BERBASIS MOLEKULER

Kelompok 7

Anggota:

Siti Isrupiah C34150020

Rizky Alfiansyah C34150039
Mega Bintang Almaidah C34150060
Divine Ifransca Wijaya C34150069
Nur Azizah C34150076
Aulia Andhika Radya Susila C34150079
Yuniasih C34150082
Ida Ayu Iska Rakhmawati C34150084
Ahmad Muchlis Habibi C34150093

DEPARTEMEN TEKNOLOGI HASIL PERAIRAN

FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2018
 PENDAHULUAN

Latar Belakang

Sushi adalah salah satu makanan Jepang yang terbuat dari nasi yang dimasak
dengan cuka kemudian dikombinasikan dengan bahan lain seperti ikan mentah atau
makanan laut yang lain. Ikan mentah yang terdapat dalam sushi berpotensi
terjadinya kontaminasi oleh bakteri patogen. Infeksi bakteri patogen yang masuk
ke dalam tubuh manusia melalui perantara makanan atau minuman dapat
menyebabkan foodborne disease. Foodborne disease merupakan salah satu
penyebab utama kematian manusia dan berpengaruh besar terhadap kesehatan
manusia. Bakteri patogen dapat hidup pada suhu tubuh manusia dan juga pada
pangan (Sari et al. 2016). Jenis bakteri patogen yang dapat bertindak sebagai agen
penyebab foodborne disease adalah Salmonella spp.
Salmonella spp. adalah organisme sel tunggal (prokariota) yang termasuk
dalam kelompok bakteri golongan Gammaproteobacteria, dan termasuk dalam
famili Enterobacteriaceae. Anggota genus Salmonella merupakan bakteri gram
negatif, anaerob fakultatif, berbentuk batang lurus dan tidak memiliki kemampuan
untuk membentuk spora. Salmonella spp. seringkali bertindak sebagai penyebab
utama infeksi pada penyakit foodborne disease. Salmonella spp. dapat
menyebabkan berbagai penyakit seperti penyakit diare, salmonellosis,
gastroenteritis, demam tifus, bacteremia (sepsis), serta penyakit infeksi lokal
lainnya. Bakteri Salmonella spp. merupakan mikroorganisme enterik yang
berkaitan dengan saluran pencernaan. Keberadaan bakteri patogen pada makanan
atau minuman tidak dikehendaki dan harus segera dihilangkan dan diperlukan suatu
deteksi bakteri patogen pada makanan tersebut. Salmonella spp. dapat dideteksi
dengan berbagai cara, salah satunya dengan menggunakan teknik Polymerase
Chain Reaction (PCR) (Amalia 2013).
Metode PCR memiliki beberapa keunggulan diantaranya dapat
memperbanyak DNA pada bagian yang spesifik sesuai yang diharapkan, memiliki
sensitivitas tinggi, dapat digunakan untuk melakukan pengujian hingga manipulasi
DNA, dan mampu memberikan hasil dalam waktu singkat. PCR juga memiliki
beberapa kelemahan diantaranya DNA sel bakteri yang mati ikut terdeteksi. PCR
bekerja dengan cara memperbanyak potongan DNA spesifik dari suatu organisme
serta mempunyai kemampuan untuk bekerja pada sampel yang kompleks dengan
cepat dan memberikan hasil dengan tingkat akurasi tinggi menyebabkan PCR
memiliki potensi besar untuk diaplikasikan sebagai metode deteksi bakteri patogen
penyebab penyakit seperti Salmonella spp. (Prayoga dan Wardani 2015). Oleh
karena itu, dibutuhkan penelitian mengenai deteksi Salmonella spp. berbasis
molekuler agar dapat mendeteksi keberadaan bakteri Salmonella spp. pada produk
perikanan dalam pengembangan metode deteksi cepat.

Tujuan

Praktikum ini bertujuan untuk mendeteksi keberadaan bakteri Salmonella

spp. pada produk perikanan dalam pengembangan metode deteksi cepat.
 METODOLOGI

Waktu dan Tempat

Praktikum Deteksi Salmonella spp. berbasis molekuler dilakukan pada

tanggal 3 September 2018. Waktu pelaksanaan praktikum adalah pukul 13.00-16.00
WIB. Praktikum dilaksanakan di Teaching Laboratory, Departemen Teknologi
Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor.

Bahan dan Alat

Bahan yang digunakan dalam praktikum adalah sushi sebagai sampel

utama. Bahan lain yang digunakan adalah media LB, agarose, dan buffer TBE.
Alat yang digunakan dalam praktikum adalah kit isolasi, kit PCR, tabung reaksi,
gelas ukur, microtube, PCR, elektroforesis, timbangan, UV transiluminator,
vortex, spin down, dan mini sentrifuse.

Prosedur Kerja

Praktikum dilakukan dengan preparasi sampel sushi sebanyak 2 gram untuk

perolehan bakteri. Sampel dilakukan pra-pengayaan bakteri. Setelah tahap pra-
pengayaan dilakukan tahap selanjutnya yaitu pemanenan bakteri hingga diperoleh
biomasa bakteri. Tahap selanjutnya dilakukan isolasi DNA terhadap biomasa
bakteri yang didapatkan dan diperoleh isolat yang diuji dengan elektroforesis. Isolat
dilakukan amplifikasi DNA dan diperoleh produk PCR untuk diuji dengan
elektroforesis. Diagram alir praktikum dapat dilihat pada gambar 1.
Sampel 2 gr

Pra- Pengayaan bakteri

Pemanenan bakteri

Biomassa

Isolasi DNA

Isolat Elektroforesis
sss
 Amplifikasi

Produk PCR Elektroforesis

Gambar 1 Diagram alir analisis Sammonella spp.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Kakteri bakteri Salmonella dalam produk hasil perikanan menurut

penelitian Aulia et al. (2015) merupakan indikasi kurang baiknya sistem sanitasi
pada proses produksi dan kontaminasi dari lingkungan asal bahan baku. Bakteri
Salmonella dapat mengakibatkan salmonellosis. Bakteri Salmonella termasuk
genus bakteri enterobakteria dan merupakan bakteri gram negatif. Dampak
penyakit yang dapat ditimbulkan oleh bakteri ini yaitu penyakit diare, tipus,
paratipus, dan penyakit foodborne. Karakteristik lainnya dari bakteri Salmonella
berdasarkan penelitian Ikawikanti et al. (2013) yaitu merupakan bakteri yang tidak
berspora, berbentuk batang, anaerob fakultatif, katalase positif, dan oksidase
negatif. Habitat yang cocok bagi bakteri ini yaitu pada suhu tubuh manusia, dan
utamanya berada pada saluran pencernaan hewan dan manusia. Jenis makanan yang
menjadi perantara bakteri ini yaitu makanan ber protein tinggi, misalnya telur dan
ikan.
Deoxyribonucleic Acid (DNA) menurut Zulfahmi (2013) merupakan
sumber informasi genetik yang potensial dan akurat. DNA dapat ditemukan dalam
hampir semua sel organisme baik pada jaringan hidup maupun mati. Karakteristik
DNA yaitu memiliki ikatan dobel heliks, dapat ditemukan di inti sel atau
mitokondria, dan memiliki basa nitrogen purin (A dan G) dan pirimidin (T dan C).
Ikatan dobel heliks pada DNA tersusun dari basa nitrogen, gula pentosa, dan fosfat.
DNA merupakan pembawa informasi genetik yang terdapat pada semua makhluk
hidup. DNA dapat diketahui dengan suatu proses ekstraksi isolasi DNA. DNA
melakukan replikasi dengan tahapan berupa tahap inisiasi, elongasi, dan terminasi.
Isolasi DNA merupakan salah satu teknik dasar dalam mempelajari teknik
biologi molekular. Hairuddin (2013) menambahkan isolasi DNA adalah suatu
teknik atau proses untuk mendapatkan DNA murni. Tujuan isolasi DNA adalah
mendapatkan DNA murni dengan cara membuang dan memisahkan DNA dari
komponen sel lainnya seperti protein, karbohidrat, lemak, dan sebagainya.
Murtiyaningsih (2017) menyatakan bahwa prinsip isolasi DNA diantaranya adalah
pemecahan (lisis), ekstraksi, dan pemurnian. Pemecahan atau lisis sel bertujuan
untuk mengeluarkan isi sel. Lisis sel dapat dilakukan secara fisik, yakni dengan
freeze thawing, homogenisasi dengan bead mill, ultrasinikasi, dan penggerusan
dalam nitrogen cair. Lisis sel juga dapat dilakukan secara enzimatik dengan
menggunakan proteinase K, losizim, akromopeptidase, dan pronase E. Ekstraksi
DNA bertujuan memisahkan DNA dari komponen sel lainnya. Ekstraksi dapat
dilakukan dengan menggunakan reagen yang mengandung deterjen seperti SDS
atau sarkosil, larutan yang mengandung NaCl, dan buffer Tris atau buffer fosfat
dengan pH 7 atau 8. Pemurnian dengan presipitasi bertujuan mengisolasi DNA dari
larutan yang digunakan selama ekstraksi. Hasil yang diperoleh dari pemurnian
DNA yakni benang-benang DNA yang berwarna putih. Hasil isolasi DNA pada
sampel sushi dapat dilihat pada Gambar 2.

Gambar 2 Hasil isolasi DNA sampel

Hasil yang didapatkan dari isolasi DNA kelompok 7 yaitu sampel dengan
kode S7 memiliki pita hasil DNA tipis dengan menggunakan primer spesifik.
Isolasi DNA menurut Mirawati et al. (2014) adalah serangkaian proses untuk
memisahkan DNA dari komponen-komponen lainnya. Hasil isolasi tersebut
merupakan tahapan penting untuk langkah berikutnya dan harus dilakukan dengan
baik dan bebas kontaminasi. Ketebalan pita DNA dikarenakan adanya proses
amplifikasi DNA sehingga jumlah DNA akan berlipat-lipat dari jumlah templat
yang ditambahkan. Pita ini kemudian akan tervisualisasi dengan jelas karena
adanya penambahan etidhium bromide pada gel elektroforesis. EtBR akan
berinterkalasi diantara basa-basa nitrogen dari nukleotida sehingga akan membuat
basa merenggang dan basa-basa nukleotida akan memberi serapan pada sinar UV.
Proses ini akan membuat DNA tampak berpendar dan tervisualisasi pada gel
elektroforesis.
Metode isolasi DNA secara konvensional menurut Syahputra et al. (2016)
adalah metode ini memiliki tahapan yang panjang sehingga memerlukan alat dan
bahan kimia atau buffer yang lebih banyak. Berbeda halnya dengan kit komersial
atau FTA-card dan modifikasinya yang dikembangkan dengan tujuan lebih praktis,
yakni melalui penggunaan kolom spin yang mengandung membran silika dan kertas
membran dengan hasil yang memadai. Kelebihan lain kit komersial adalah dapat
melakukan metode pemisahan berdasarkan target DNA atau RNA.
PCR (Polymerase Chain Reaction) menurut Budiarto (2015) merupakan
teknologi yang mampu melipat gandakan secuplik fragmen DNA yang terdapat
dalam komplek makromolekul genom dari berbagai sumber seperti hewan,
tumbuhan, bakteri dan virus menjadi 2n kali lipatnya secara enzimatis. Teknologi
ini juga dikenal dengan tingkat sensitifitasnya yang tinggi karena hanya
membutuhkan secuplik sampel DNA saja untuk mendapatkan jutaan kopi DNA
baru. Prinsip umum PCR (Polymerase Chain Reaction) pertama yaitu
mendenaturasi dua untas DNA yang dipisahkan secara fisik dengan suhu tinggi.
Kedua yaitu annealing dengan suhu diturunkan untuk memfasilitasi penempelan
DNA polymerase secara spesifik pada untas tunggal DNA yang sudah
berkomplementasi dengan primer spesifiknya. Ketiga yaitu polimerasi dimana utas
tunggal DNA dibaca oleh DNA polymerase dengan menambahkan basa-basa DNA
komplemennya maka fragmen DNA dapat diperbanyak secara eksponensial.
Hasil PCR yang dianalisis dengan elektroforesis dan disinari dengan lampu
UV. Hasil elektroforesis berbentuk jalur-jalur dengan fragmen yang
menggambarkan urutan nukleotida DNA spesies tertentu. Kontrol positif dengan
templat DNA Salmonella ditunjukkan oleh jalur K+, sedangkan kontrol negatif
yang tidak mengandung templat DNA bakteri apapun ditunjukkan oleh jalur K-.
Jalur S1, S3, S5, S8 dan S10 menggunakan primer inva, sedangkan jalur S2, S4,
S6, S7 dan S9 menggunakan primer spesifik. Jalur S1, S3, S5, S7 dan S9 dilakukan
prapengayaan (enrichment) bakteri, sedangkan jalur S2, S4, S6, S8 dan S10 tidak
dilakukan prapengayaan. Marker pada elektroforesis ditunjukkan dengan jalur M.
Fragmen sampel yang terbentuk dari elektroforesis hasil PCR dapat dilihat pada
Gambar 3.

Gambar 3 Fragmen sampel hasil elektroforesis

Fragmen-fragmen yang terbentuk pada Gambar 3 menunjukkan ada atau
tidaknya DNA Salmonella pada sampel yang digunakan. Jalur K+ menunjukkan
fragmen DNA Salmonella dan menggambarkan urutan nukleotida yang dimiliki
oleh Salmonella (Nurhasanah 2014). Salah satu dari dua jalur K+ menunjukkan
fragmen yang mirip dengan jalur K-. Jalur K- yang menunjukkan kontrol negatif
seharusnya tidak membentuk fragmen apapun, sehingga ada kemungkinan telah
terjadi kesalahan dalam pengambilan data. Tidak ada satu sampel yang memiliki
fragmen yang mendekati dengan fragmen pada jalur K+ yang menunjukkan urutan
nukleotida yang terdapat pada DNA Salmonella, sehingga tidak terdeteksi adanya
Salmonella pada sampel S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7, S8, S9 dan S10.

PENUTUP

Kesimpulan

Sushi merupakan salah satu produk perikanan yang memiliki potensi

terjadinya kontaminasi bakteri patogen seperti Salmonella spp. Bakteri Salmonella
spp. tersebut dapat dideteksi secara kualitatif dengan metode PCR. Hasil pengujian
yang dilakukan menujukkan tidak ditemukannya bakteri Salmonella spp. pada
seluruh sampel produk perikanan berupa sushi.

Saran

Praktikum selanjutnya dapat dilakukan dengan menggunakan sampel

produk perikanan lain yang lebih beragam. Penambahan perlakuan juga dapat
dilakukan seperti perlakuan tempat penyimpanan untuk mengetahui penyimpanan
yang efektif. Metode yang digunakan dapat menggunakan metode lain seperti
metode kuantitatif untuk mengetahui jumlah bakteri patogen yang terdapat pada
sampel produk perikanan.

DAFTAR PUSTAKA

Budiarto BR. 2015. Polymerase Chain Reaction (PCR): Perkembangan dan

perannya dalam diagnostik kesehatan. BioTrends. 6(2): 29-38.
Nurhasanah. 2014. Studi keanekaragaman nukleotida gen CarA beberapa spesies
Salmonella dengan teknologi PCR. Jurnal Sains dan Teknologi. 10(2):124-
128.
Hairuddin R. 2013. Isolasi DNA dan amplifikasi, (PCR) genom DNA kopi (Coffea
sp.) melalui proses elektroforesis gel poliakrilamid. Jurnal Dinamika. 4(1):
43-48.
Murtiyaningsih H. 2017. Isolasi DNA genom dan identifikasi kekerabatan genetik
nanas menggunakan RAPD (Random Amplified Polimorfic DNA). Jurnal
Agritrop. 15(1): 83-93.
Aulia R, Handayani T, Yennie Y. 2015. Isolasi, identifikasi, dan enumerasi bakteri
Salmonella spp. pada hasil perikanan serta resistensinya terhadap antibiotik.
Jurnal BIOMA. 2(1): 15-33.
Ikawikanti A, Padaga MC, Oktavianie DA. 2013. Isolasi dan karakterisasi
Salmonella spp. pada lingkungan peternakan ayam brioler di kota Malang.
Student Journal Veteriner School Universitas Brawijaya. 1(2): 1-11.
Zulfahmi. 2013. Penanda DNA untuk analisi genetik tanaman. Jurnal
Agroteknologi. 3(2): 41-52.
Mirawati, Wirajana, Yowani. 2014. Perbandingan Kualitas DNA dengan
Menggunakan Dua Metode Boom Modifikasi pada Isolat Mycobacterium
tuberculosis. Jurnal Farmasi Udayana. 2(4): 1-7.
Syahputra A, Mutaqin KH, Damayanti TA. 2016. Komparasi Metode Isolasi DNA
Patogen Antraknosa dan Bulai untuk Deteksi PCR. Jurnal Fitopatologi
Indonesia. 12(4): 124-132.
Amalia U. 2013. Optimasi Polymerase Chain Reaction (PCR) untuk deteksi
Salmonella spp. pada udang segar. [tesis]. Bogor(ID): Institut Pertanian
Bogor.
Prayoga W, Wardani AK. 2015. Polymerase chain reaction untuk deteksi
Salmonella sp. Jurnal Pangan dan Agroindustri. 3(2): 483-488.
Sari DE, Primiani CN, Pujiati. 2016. Uji aktivitas antibakteri tepung ikan gabus
(Channa striata) terhadap bakteri patogen pangan. Life science. 5(1): 25-30.
 LAMPIRAN

Lampiran 1 Dokumentasi Praktikum

Sampel sushi Pemasukan ke dalam sentrifuse

Buffer Proses elektroforesis

Lampiran 2 Pembagian Tugas

Siti Isrupiah Metodologi

Mega Bintang Almaidah Pembahasan 4
Divine Ifransca Wijaya Pembahasan 6
Nur Azizah Pendahuluan
Aulia Andhika Radya Susila Pembahasan 5
Yuniasih Pembahasan 1, 2
Ida Ayu Iska Rakhmawati Pembahasan 3
Ahmad Muchlis Habibi Editor