STUDI PADA KRIOPRESERVASI SEMEN KUDA

JANTAN DENGAN ALFA LIPOIC ACID (A STUDY ON

THE CRYOPRESERVATION OF STALLION SEMEN
WITH
ALPHA LIPOIC ACID)

Makalah Bedah Jurnal

MATA KULIAH TEKNIK REPRODUKSI HEWAN

Disusun oleh :
Heru Setiawan 24020112410002

MAGISTER BIOLOGI
FAKULTAS SAINS DAN MATEMATIKA
UNIVERSITAS DIPONEGORO
2014
I. Latar Belakang
Tujuan dari studi ini adalah untuk menguji apakah penambahan
antioksodan Alpha Lipoic Acid (ALA) mampu meningkatkan keefektivan
beberapa parameter-parameter fertilitas pada kriopreservasi (preservasi beku)
semen kuda jantan. Inseminasi buatan dianggap sebagai salah satu cara modern
untuk meningkatkan hasil persilangan terutama perbaikan secara genetis dan
peningkatan produksi potensial kuda. Dalam proses inseminasi buatan,
kriopreservasi (preservasi beku) semen telah banyak digunakan. Keuntungan
krioperservasi adalah untuk menurunkan resiko penularan penyakit yang
ditularkan baik melalui perkawinan alami (hubungan kelamin) ataupun tidak,
seperti penyakit anemia kuda, flu kuda, strangle (infeksi saluran pernafasan atas
oleh bakteri).
Selama proses kriopreservasi adanya osmotis dan perubahan suhu
menstimulasi adanya ROS (reactive oxygen species). ROS dalam jumlah sedikit
diperlukan dalam fungsi normal sperma, tetapi ketika terjadi ketiakseimbangan
antara produksi ROS dan netralisasi, maka akan terjadi kelebihan ROS yang
memicu adanya stres oksidatif. Stres oksidatif menyebabkan ketidakstabilan
membran dan keutuhan DNA dalam nukleus sel sperma. Perubahan ini akan
mengurangi kualitas fertilitas sperma pasca pencairan pada kriopreservasi.
cairan semen pada mamalia mengandung suatu antioksidan sebagai suatu
pertahanan yang terdiri dari antioksidan enzimatik dan non enzimatik. Prosedur
dalam proses penyimpanannya, cairan semen diencerkan dengan menambahkan
medium untuk memperbanyak dosis dalam sekali ejakulasi. Proses pengenceran
tersebut akan menurunkan konsentrasi antioksidan alami dalam cairan semen. Hal
ini memicu produksi ROS yang melebihi batas fisiologisnya.
Segala komponen seluler termasuk lemak, protein, asam nukleat, dan
glukosa merupakan target potensial ROS. Jumlah ROS harus dibatasi pada batas
minimum untuk memaksimalkan fungsi normal sel sperma tersebut. Kelebihan
ROS dapat dinetralisasi dengan penambahan antioksidan yang cocok dalam
medium pengencer sperma seperti vitamin E dan cysteine untuk meningkatkan
umur simpan dan kualitas semen baik kualitas beku maupun pasca pencairan pada
beberapa spesies.
 Pada saat ini belum terdapat data mengenai efek Alpha Lipoic Acid (ALA)
pada sperma kuda. ALA telah terbukti sebagai antioksidan potensial dan mampu
menguraikan beberapa radikal bebbas seperti hidroksil radikal, asam hipokloic
(hypochlorous acid), peroxynitrite, dan superoksida. ALA juga potensial
menghasilkan antioksidan lainnya seperti vitamin C, dan vitamin E. Meskipun
terdapat hasil-hasil menjanjikan terhadap penggunaan ALA tetapi penggunaan
ALA sebagai medium pengencer dalam kriopreservasi semen belum umum dan
sampai saat ini belum terdapat literatur pendukung yang mengevaluasi efek
potensial ALA pada sperma beku ataupun pasca pencairan sperma beku (post
thawed) tersebut.
Hasil penelitian sebelumnya menyatakan bahwa penambahan ALA pada
konsentrasi 0,02 mmol/ml mampu meningkatkan motilitas sperma rusa, dosis
tersebut juga merupakan dosis optimal untuk mengurangi kerusakan DNA
(Ibrahim et al., 2008). Hasil penelitian lain menyatakan bahwa ALA mampu
menghambat toksisitas thinner pada testis tikus strain sparague, ALA mampu
memperbaiki saluran sperma pada dan meningkatkan motilitas dan viabilitas
sperma pada tikus yang diinduksi thinner (Yeni et al., 2012)

II. Bahan dan Metode

Dalam penelitian ini digunakan dua kuda jantan Inggris (Welsh) dewasa
(berusia 9 tahun). Kedua kuda tersebut telah melakukan pemeriksaan secara klinis
memiliki saluran reproduksi normal dan memiliki kualitas sperma memenuhi
syarat sebagai donor dalam inseminasi buatan. Cairan semen dikumpulkan dengan
bantuan alat vagina buatan. Segera setelah pengumpulan, cairan semen
dipindahkan ke dalam waterbath pada suhu 37°C, kemudian dievaluasi
kualitasnya meliputi kualitas fisik (warna dan volume) dan evaluasi mikroskopik
(persentase motilitas dan morfologi). Ejakulat yang memiliki motilitas antara 50-
60% akan digunakan dalam penelitian tersebut. Cairan semen dipindahkan dalam
medium egg yolk citrate pada suhu 37°C selama 10 menit segera setelah
pengumpulan. Komposisi egg yolk citrate terdiri dari tris 24.20gr, citric acid
(asam sitrat) 13.40gr, fruktosa 10gr, glycerol 70ml, Egg Yolk 200 ml air suling
sampai dengan 1000 ml. ALA ditambahkan dalam konsentrasi berbeda yaitu 0.0
mmol/ml; 1.0 mmol/ml; 0.5 mmol/ml; 0.1mmol/ml; 0.05mmol/ml; 0.025mmol/ml
dan 0.125 mmol/ml. Konsentrasi tersebut diperoleh dengan melarutkan ALA
dalam tabung sentrifuse (0.0; 0.0206; 0.0103; 0.0021; 0.0011; 0.0006 dan 0.0003
gram) dengan etanol sebanyak 20μL pada masing-masing ukuran. Tabung-tabung
tersebut disimpan dalam waterbath pada suhu 37°C, hal ini dilakukan untuk
menguapkan etanol sehingga lapisan kristal ALA tersisa pada dasar tabung,
kecuali pada kontrol.
Cairan semen ditambahkan pada masing-masing tabung sebanyak 3 ml,
kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 2100 rpm selama 15 menit. Setelah
sentrifugasi supernatan dikeluarkan dan tambahkan kembali 3 ml medium kuning
telur (egg yolk) kedalam masing-masing tabung. Proses pendingingan cairan
semen dari suhu 37°C – 4°C dilakukan dengan memindahkan dari waterbath
kedalam lemari pendingin selama 2 jam. Cairan semen dimasukkan kedalam
straw 5 ml dan disegel pada ujungnya, proses ini dilakukan sebelum mencapai
suhu 4°C. Setelah mencapai suhu 4°C, cairan sperma dibiarkan tersimpan selama
4 jam untuk mencapai kondisi seimbang. Analisis setiap parameter dilakukan
menggunakan 2 – 4 straw semen beku yang dicairkan selama 30 detik untuk
mencapai suhu 37°C.
Parameter penelitian meliputi:
A. Konsentrasi Semen
Diukur sebelum pembekuan dengan mencampur 10μl cairan semen dengan
formal citrate dalam Eppendorf. Perbandingan keenceran semen dan formal
citrate dipertahankan pada perbandingan 1:10. Campuran semen dan sitral
diteteskan pada hemositometer yang sebelumnya telah dibersihkan dengan
etanol, kemudian ditutup dengan gelas penutup dan diamati di bawah
mikroskop untuk menentukan konsentrasi sperma.
B. Motilitas Sperma Sebelum Dan Sesudah Pengenceran
Motilitas sperma sebelum diencerkan ditentukan dengan mengamati
sperma pada slide yang belum dihangatkan kemudian diamati di bawah
mikroskop dengan perbesaran 40x. Pengamatan sperma pasca pengenceran
dilakukan dengan mencairkan straw dari tiap perlakuan dalam water bath pada
suhu 37°C selama 30 detik. Setiap tetes semen (10μl) diamati dibawah
 mikroskop dengan perbesaran 40x untuk menentukan motilitas sperma.
Pengamatan dilakukan dengan mengamati minimal 3 bidang pandang untuk
menentukan persentase motilitas, ketiganya dijadikan sebagai satu data
pengamatan.
C. Vitalitas Sperma
Untuk mengetahui rasio sperma hidup diamati dengan mencampur 20μl
semen dengan 20μl pewarna. Kemudian 10μl diteteskan pada gelas benda dan
dilakukan pengapusan, pengamatan dilakukan dengan mikroskop pada
perbesaran 100x dan menggunakan minyak emersi. Apabila kepala sperma
tidak terwarna maka sperma tersebut adalah sperma hidup, demikian
sebaliknya.
D. Integritas Akrosom
Diamati dengan jalan memfiksasi 500μl dari setiap sampel dalam 50μl
formal sitrat yang mengandung 2,9% (berat/volume) tri-sodium citrate
dihydrate. 200 sel sperma dihitung dan diamati bentuk akrosomnya dibawah
mikroskop dengan perbesaran 100x. Bentuk ketidaknormalan akrosom antara
lain terjadi pengkerutan atau pembengkakan akrosom.
E. Integritas membran plasma
Pengamatan dilakukan dengan metode Hypo Osmotic Swelling Test
(HOST). Pengujian metode HOST dilakukan dengan mencampur 500μl reagen
HOST dengan 50μl sampel semen, kemudian diinkubasi dalam inkubator
selama 45 menit. Setelah inkubasi dilakukan pengamatan dengan cara
meneteskan sampel pada gelas benda dan mengamati di bawah mikroskop pada
perbesaran 400x. Sebanyak 200 spermatozoa dihitung, dan spermatozoa
dengan terdapat pembengkakan pada bagian ekor menunjukkan sitoplasma
yang lengkap. Rerata data dihitung sebagai data tunggal.

III. Hasil
Semen segar telah diperiksa motilitas dan konsentrasinya. Motilitas semen
segar kuda pertama dan kuda kedua masing-masing 60% dan 50%. Vitalitas
semen segar dari kuda 1 dan 2 telah adalah 81,5% dan 80%. Konsentrasi
Semen ditentukan menggunakan haemocytometer. Konsentrasi semen untuk
kuda pertama dan kuda kedua masing-masing adalah 12 juta/ml dan 11,50
juta/ml. Setelah kriopreservasi semen dianalisis dengan berbagai parameter
berbeda. Ditemukan bahwa motilitas semen berkurang dengan peningkatan
konsentrasi ALA. Hasil rinci dari penelitian adalah dijelaskan pada Tabel 1.
Konsentrasi yang berbeda dari ALA dan efeknya terhadap motilitas
ditampilkan dalam grafik gambar 1. Hasil penelitian menunjukkan bahwa,
terjadi penurunan motilitas sperma setelah krioperservasi dengan penambahan
ALA. Viabilitas sperma juga mengalami penurunan terhadap konsentrasi ALA,
hal tersebut menunjukkan ketidakefektivan penambahan ALA terhadap
viabilitas sperma (gambar 2).
Tabel 1. Keefektifan ALA terhadap berbagai parameter fertilitas

Gambar 3, 4, dan 5 menunjukkan integritas membran plasma, integritas

akrosom dan morfologi sperma kuda pada kriopreservasi dengan penambahan
ALA. Pada grafik gambar 3 menunjukkan pengaruh konsentrasi ALA berbeda
terhadap membran plasma, konsentrasi ALA terendah menunjukkan hasil rata-
rata tertinggi. Grafik gambar 4, menunjukkan persentase akrosomal ridge
 antara 98,75 – 10%, hal ini berarti bahwa ALA tidak memberikan efek buruk
terhadap akrosom sel sperma kuda. Gambar grafik 5 menunjukkan hasil
ketiadaan sperma abnormalitas yang rendah dengan pemberian ALA yaitu 20,2
– 25,5%. Abnormalitas sperma diamati berdasarkan adanya sel sperma dengan
bagian leher yang tebal, bagian kepala yang lebar dan adanya leher ganda.

Gambar 1. Motilitas semen. Gambar 2. Vitalitas semen.

Gambar 3. Integritas membran plasma. Gambar 4. Rerata % apikal ridge normal.

 Gambar 5. Morfologi sel sperma kuda.

IV. Pembahasan
Fertilitas merupakan suatu variabel yang menggambarkan kecepatan
terjadinya buntingan pada kuda betina. Manajemen pengembangbiakan, sejarah
dan usia juga mempengaruhi kecepatan kebuntingan pada kuda betina.
Fertilitas dan viabilitas spermatozoa telah diuji dengan menggunakan berbagai
penelitian. Beberapa kuda jantan mungkin memiliki fertilitas rendah, karena
memiliki beberapa parameter kecacatan spermatozoa, kecacatan tersebut dapat
ditangani dan dihilangkan melalui penanganan laboratorium. Timbulnya
kebuntingan juma merupakan sarana terbaik untuk menilai fertilitas kuda
jantan. Sel spermatozoa sangat rentan terhadap stress oksidatif sehingga
menimbulkan kerusakan, karena adanya sejumlah besar poly-unsaturated fatty
acid pada membran plasma. Hal menarik adalah adanya kandungan antioksidan
pada cairan semen mamalia yang bertindak sebagai suatu mekanisme
pertahanan. Mekanisme pertahanan antioksidan tersebut terdiri dari enzim-
enzim antioksidan seperti super oksida dismutase, glutathione
peroxidase/glutathione reductase (GPx/GRD) dan katalase serta antioksidan-
antioksidan non enzimatik seperti askorbat, urate, piruvat, glutathione, taurin,
hipotaurin.
Penelitian ini dilaksanankan untuk mengetahui efek alpha lipoic acid pada
krioperservasi semen. Evaluasi dari keefektivan ALA sebagai suatu
 antioksidan untuk menjaga motilitas sperma, vitalitas, morfologi, integritas
akrosom dan membran plasma menjadi bagian dari penelitian ini, hasil dari
penelitian tersebut sebagai berikut ini:
Motililas semen pada kuda 1 dan kuda 2 masing-masing dalah 60% dan
50%. Motilitas tersebut mengalami penurunan setelah dilakukan penambahan
ALA pada dosis berbeda ke dalam ekstender, hasil sebagaimana ditunjukkan
pada tabel 1.
Hal sama dijumpai pada integritas membran plasma, integritas akrosom,
vitalitas spermatozoa juga tidak mengalami peningkatan signifikan
dibandingkan dengan kontrol. Hasil penelilitian yang kurang memuaskan
tersebut menunjukkan ketidak efektivan ALA sebagai antioksidan untuk
meningkatkan kualiras pasca pencairan (post thawed) semen kuda jantan.

V. Kesimpulan
Hasil hasil yang diperoleh dari penelitian tersebut dapat disimpulkan
bahwa motilitas dan viabilitas semen kuda jantan mengalami penurunan setelah
proses kriopreservasi dengan penambahan ALA, hal ini disebabkan
abnormalitas morfologi sperma, terutama adanya pembesaran kepala (akrosom)
sel sperma yang menjadi alasan telah terjadi kerusakan DNA. Hal yang harus
diperhatikan adalah kerusakan DNA berdampak pada fertilitas, kececepatan
terjadinya kebuntingan dan perkembangan embryo hewan. Alasan kedua
adalah adanya kemungkinan peningkatan keasaman yang dihasilkan dari ALA
dapat menyebabkan imobilisasi spermatozoa, lebih lanjut LA (lipoic acid)
dapat direduksi menjadi dihyrolipoic acid (DHLA) yang lebih potensial untuk
menghasilkan cadangan antioksidan yang tereduksi.
Oleh karene multifungsional alamiah tersebut, maka memungkinkan
keuntungan LA dapat terekspresi lebih konkret pada penelitian lebih lanjut,
atau pada penyusunan media yang lebih komplek sebagaimana yang digunakan
pada IVF.
penambahan DHLA secara langsung dapat menjadi salah satu pilihan
dalam penelitian lebih lanjut, sebab cara tersebut tidak akan menggantungkan
kemampuan sperma dalam mengubah LA menjadi DHLA, namun harus
 menyertakan kation-kation logam (Fe, Cu, dll) dalam formulasi media supaya
diperoleh efek yang sinergis, penambahan beberapa antioksidan sebagai
suplemen dalam medium seperti glutathione tereduksi dapat juga dilakukan.

Daftar Pustaka
Jurnal Rujukan
Hussain, J., A. Salam and A. Gohar. 2011. A Study on the Cryopreservation of
Stallion Semen With Alpha Lipoic Acid. International Research Journal of
Parmacheuticals 1 (1): 21-26.

Jurnal pendukung
Ibrahim, S. F., K. Osman, S. Das, A. M. Othman, N. A. Majid and M. P. A.
Rahman. 2008. Basic Research: A Study Of The Antioxidant Effect Of Alpha
Lipoic Acid On Sperm Quality. Clinic 63 (4): 545-550.

Yeni, D., A. F. Fidan, I. H. Ciğerc, M. Konuk, F. Avdatek and M. Gündoğan.

Effect of α-lipoic acid on sperm quality, reproductive tract measures in
thinner exposed rats. Andrologia Vol 44: 74-80.