Metode AP4 untuk deteksi PCR dengan dua tube nested dari isolat AHPND dari Vibrio

parahaemolyticus

ABSTRAK

Sebelumnya kami telah bekerja terhadap mekanisme virulensi untuk isolat unik Vibrio
parahaemolyticus yang menyebabkan penyakit nekrosis hepatopankreas akut (VPAHPND), yang
mengungkapkan bahwa itu disebabkan oleh pasangan Pir-liketoksin binoxin dan ToxB. Racun ini terletak
pada plasmid pVA, plasmid yang dibawa oleh strain AHPND yang menyebabkan V. parahaemolyticus
dengan ukuran sekitar 69 kbp.Menggunakan urutan pengkodean of ToxA. metode deteksi PCR one step
pada VPAHPND diperkenalkan pada bulan Juni 2014 tetapi memiliki batasan bahwa upaya untuk
mengadaptasikannya ke dalam protokol PCR nested tidak berhasil. Akibatnya, tingkat udang VPAHPNDin
rendah atau sampel lain tidak dapat dideteksi tanpa terlebih dahulu menyiapkan kultur pengayaan media
cairan untuk memungkinkan pertumbuhan bakteri sebelum ekstraksi DNA template .Di sini, kami
mendeskripsikan metode AP4 (singkatan dari AHPD deteksi versi 4).Metode dua tube nested PCR yang
menargetkan gen tandem ToxA dan ToxB, termasuk 12 bp yang memisahkan gen pada plasmid pVA.
Pengujian metode ini mengungkapkan bahwa menghasilkan 100% nilai prediksi positif dan negatif untuk
VPAHPND menggunakan panel 104 isolat bakteri termasuk 51 isolat VPAHPND dan 53 non-AHPND
isolat dan yang terakhir termasuk 34 isolat V.parahaemolyticus dan 19 isolat bakteri lain. ditemukan di
tambak udang, termasuk spesies Vibrio lainnya. Metode PCR nested AP4 100 kali lebih sensitive (100 fg
total DNA template) dari pada one-step AP3 (10 fg total DNA template), dan itu bisa mendeteksi
VPAHPNDin dalam percobaan udang dengan 6 jam pasca perendaman (n = 2/3), sedangkan AP3 tidak
dapat mendeteksi hingga 12 jam setelah perendaman (n = 1/3).
Dengan demikian, metode AP4 mungkin berguna dalam mendeteksi isolat VPAHPND dalam sampel di
mana bahan target terbatas.( (misalnya kuantitas jaringan kecil atau DNA yang diarsipkan) dan pengayaan
tidak dapat digunakan (yaitu, sampel atau sampel beku yang diawetkan dalam alkohol).

1. PENDAHULUAN
Penyakit nekrosis hepatopankreas akut (AHPND) adalah penyakit yang muncul terkadang juga
disebut sindrom kematian dini (EMS) (Flegel, 2012).Ini telah menyebabkan kerugian serius bagi para petani
udang di Cina, Vietnam, Malaysia, Thailand dan Meksiko. (FAO, 2015; Flegel,2012; Gomez-Gil et al.,
2014; Joshi et al., 2014; Nunan et al., 2014; Soto-Rodriguez et al., 2015; Tran et al., 2013).Pada awal 2013,
agen penyebab AHPND diidentifikasi sebagai isolat unik Vibrio parahaemolyticus (VPAHPND) (Tran et
al., 2013). Untuk mekanisme infeksi AHPND bahwa VPAHPND menyerang lambung udang dan
menghasilkan toksin larut yang memasuki HP yang menyebabkan karakteristik peluruhan sel besar-besaran
dari AHPND. Dalam penelitian sebelumnya, kami mengidentifikasi dan mencirikan toksin potensial (s)
dari presipitasi amonium sulfat dari VPAHPND isolat yang tumbuh dalam kultur media cairan. (Sirikharin
et al., 2014a, 2015b). Analisis fraksi aktif oleh SDS-PAGE mengungkapkan dua pita besar pada tingkat
marker sekitar 16 kDa (ToxA) dan 50 kDa (ToxB). ToxA dan ToxB hanya ada dalam sub-fraksi protein
dari kultur biakan sel bebas. dari isolat V. parahaemolyticus yang menyebabkan AHPND (VPAHPND),
tetapi tidak dari sub-fraksi protein yang serupa dari media cairan non-AHPND V. parahaemolyticus atau
bakteri lain yang tidak menyebabkan AHPND (Han et al., 2015; Sirikharin et al., 2014a, 2015b;Tran et al.,
2013). Spektrometri massa yang diikuti oleh analisis MASCOT mengungkapkan bahwa kedua protein
memiliki kesamaan dengan protein hipotetis dari V. parahaemolyticus M0605(contig 034 aksesi GenBank
no.JALL01000066.1) dan kemiripan dengan racun serangga insektisida biner yang disebut 'Photorhabdus'
terkait serangga 'protein A dan B (Pir-A dan Pir-B), masing-masing, diproduksi oleh bakteri simbiotik,
nematoda Photorhabdus luminescens (Gomez-Gil et al., 2014; Li et al., 2014;Yang et al., 2014). Dalam uji
in vivo, ditunjukkan bahwa rekombinan ToxA dan ToxB keduanya diperlukan tergantung dosis , untuk
menyebabkan patologi AHPND (Sirikharin et al., 2015b), menunjukkan kemiripan dengan Pir-A dan Pir-
B. Rangkaian urutan VPAHPND iso-lates dari Thailand (termasuk VPAHPND isolat dalam penelitian ini)
telah diterbitkan (Gomez-Gil et al., 2014; Kondo et al., 2014; Yanget al., 2014). Analisis sekuens
mengkonfirmasi keberadaan homolog spesifik untuk Pir-A dan Pir-B yang terletak di plasmid
ekstrachromosomal unik yang sebelumnya tidak direport, yang disebut pVA di semua VPAHPN.
(Sirikharin et al., 2015b). kerugian besar peternak udang karena AHPND, metode deteksi yang sensitif
sangat dibutuhkan dan ini telah dikembangkan secara progresif sejak 2013. Dua metode deteksi PCR
interim; AP1 dan AP2 (singkatan dari deteksi AHPND versi 1 dan 2, masing-masing) diumumkan pada 24
Desember 2013 (Flegeland Lo, 2013) berdasarkan purifikasi DNA plasmid sequences presentin VPAHPND
isolat tetap tidak hadir dalam non-AHPND V. parahaemolyti-cus isolat. Pengujian selanjutnya dengan 80
isolat bakteri pada waktu itu mengungkapkan bahwa metode AP2 memberikan hasil yang lebih unggul dari
AP1 dengan 97% nilai prediksi positif untuk mendeteksi VPAHPNDiso-lates (Sirikarin et al., 2014a)
Metode AP3 berikutnya (AHPNDdetection versi 3) untuk deteksi PCR berdasarkan urutan VPAHPND
ToxA diumumkan di situs web NACA pada 18 Juni2014 (Sirikharin et al., 2014a). Perkembangannya
kemudian dijelaskan secara rinci (Sirikharin et al., 2015b) dan memberikan sensitivitas 100% dan
spesifisitas 100% untuk VPAHPND menggunakan seleksi yang diperluas dari 104 isolat bakteri yang mirip
dengan yang digunakan untuk validasi metode AP1 & AP2 (Sirikharin et al., 2014a). Metode tambahan
telah dijelaskan dari Jepang (Tinwongger et al., 2014) dan Amerika Serikat (Han et al., 2015).Semua
metode ini adalah metode deteksi PCR 1 langkah yang tidak memiliki kepekaan untuk mendeteksi
VPAHPND pada tingkat rendah seperti yang mungkin ada dalam beberapa sampel lingkungan atau udang
normal atau operator potensial lainnya. Untuk sampel seperti itu, langkah pengayaan awal
direkomendasikan dalam setiap media yang cocok untuk pertumbuhan VPAHPND (Sirikharin et al., 2014a,
2015b).

Dalam beberapa situasi, langkah pengayaan mungkin tidak dapat dilakukan. Sebagai contoh,
sampel sering diserahkan diawetkan oleh freezingor dalam etil alkohol atau sebagai ekstrak DNA segar
atau diarsipkan di mana jumlah sampel terbatas. untuk sampel seperti itu, deteksi PCR yang lebih sensitif
akan lebih sesuai, tetapi tes untuk mengadaptasi AP1 ke metode AP3 untuk PCR nested tidak berhasil
karena terjadinya amplikon non spesifik (tidak dipublikasikan). Untuk mengatasi masalah ini, kami
mengembangkan protocol nested PCR yang disebut metode AP4 yang 100 kali lebih sensitif untuk deteksi
VPAHPND daripada metode AP3, tanpa kehilangan sensitivitas epidemiologis atau spesifisitas.itu Sangat
cocok untuk analisis langsung dari ekstrak DNA dari sampel segar, beku atau alkohol yang diawetkan dari
jaringan udang, dari indukan atau udang udang juvenile, dari seluruh post larvae atau pembawa lain yang
dicurigai dan dari sumber lingkungan seperti kolam sedimen. Ini adalah metode nested PCR dengan dua
tube yang dapat mendeteksi VPAHPND pada setinggi 100 fg DNA yang diekstrak dari budidaya murni.
Karena kebutuhan yang mendesak untuk metode pendeteksian yang lebih sensitif, pengumuman awal untuk
metode AP4 dibuat di situs web NACA pada Februari 2015 (Sritunyalucksana et al., 2014) tetapi
komunikasi ini menjelaskan detail metodologi yang digunakan untuk mengembangkan dan memvalidasi
metode.

Gbr. 1. Diagram dari sekuens target untuk primer AP4. Diagram skematik yang mewakili urutan target
untuk primer AP4 pada plasmid VA1 di wilayah dari urutan asam nukleat total dari gen AHPND ToxA dan
ToxB ditambah 12 spacer asam nukleat yang menghubungkan mereka bersama (total panjang fragmen
target 1665 bp). Primer dalam (nested) AP4-F2 dan AP4-R2 (teks ingrey outline) menargetkan porsi 230
bp dari urutan yang mencakup 209 bp dari urutan gen ToxA ditambah urutan spacer 12 bp (teks dalam garis
abu-abu, miring dan bergaris), ditambah 9 bp dari urutan gen ToxB yang berhasil.

2. Bahan dan metode

2.1 Metode nested PCR AP4 untuk mendeteksi VPAHPND
Gen-gen toksin VPAHPND terletak sangat berdekatan (dipisahkan oleh 12 bp) pada plasmid (pVA)
sekitar 69 kbp yang dibawa oleh isolat V. parahaemolyticus yang menyebabkan AHPND (VPAHPND)
(Yang et al., 2014). Urutan target AP4 terdiri dari fragmen DNA chimeric yang terdiri dari bagian utama
dari keseluruhan wilayah ToxA dan ToxB (1665 bp) pada plasmid 69 kbp pVA dari isolat VPAHPND
(Gambar 1). Primer untuk reaksi PCR tahap pertama adalah AP4-F1 dan AP4-R1 (Gbr. 1, teks bergaris
bawah tebal) yang menargetkan bagian a1269 bp dari wilayah tersebut dan termasuk gen ToxA penuh,
menghasilkan 12 bp linker, ditambah sebagian besar Geneticquence ToxB yang berhasil (921/1317 bp =
70%).Primer AP4-F1 sama dengan AP3-F primer dari metode AP3. Untuk reaksi PCR langkah kedua,
sebagian dari solusi akhir dari reaksi PCR langkah pertama digunakan sebagai templat dengan primer
(nested) AP4-F2 danAP4-R2 (Gambar 1, teks dalam garis abu-abu). Targetnya adalah 230 bp bagian dari
urutan yang mencakup 209 bp dari urutan gen ToxA plus urutan spacer 12 bp (Gbr. 1,) ditambah 9 bp dari
urutan gen ToxB yang berhasil. Pada konsentrasi DNA target tinggi, tambahan, band untuk amplikon dapat
terjadi sebagai produk primer residual AP4-F1 yang bekerja dengan AP4-R2 (357 bp) atau AP4-F2 dengan
AP4-R1 (1142 bp) dalam langkah bertingkat. Rincian kondisi PCR pasir primer diberikan dalam Tabel 1–
3. Produk PCR dikondisikan oleh 1,5% elektroforesis gel agarosa, etidium bromidestaining dan
didokumentasikan pada transilluminator UV..

2.2 Isolat bakteri

Untuk memvalidasi metode AP4,kami menggunakan ekstrak DNA dari satu set 104 isolat bakteri,
termasuk 34 non-AHPND VP dan 51 VPAHPND isolat (total 85, dikonfirmasi oleh bioassay), ditambah
19 isolat bakteri lain yang biasa ditemukan di tambak udang. Isolat ini sebelumnya digunakan untuk validasi
metode AP3 (Sirikharinet al., 2015b). Untuk uji tantangan udang, VPAHPND mengisolasi 5HP dan CN
(Joshi et al., 2014), non-AHPND VP mengisolasi ISO40 dan S2-4 (Sirikharin et al., 2015b), dan isolat
Shewanella digunakan. Semua isolat bakteri disimpan sebagai stok dalam gliserol 15% pada -80◦C dan
dihidupkan kembali sesuai kebutuhan dengan transfer ke media cair kedelai tryptic (TSB, Difco) yang
mengandung 1,5% NaCl atau dengan lapisan pada media padat secara bersamaan dengan penambahan 1,5%
agar ke TSB (TSA) diikuti oleh incu-bation di 30◦C. Untuk tes tantangan, bakteri ditumbuhkan di TSB
sampai OD600nm mencapai 0,6 (setara dengan sekitar 108 unit pembentuk koloni (cfu) / ml.
2.3 Preparasi DNA template
Jaringan perut udang atau pelet bakteri dari kultur media cair dihomogenisasi dalam buffer lisis (50
mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mMEDTA, 1% SDS, 10 mM NaCl) mengandung 5 µg / ml proteinase K. DNA
genom diisolasi dan dimurnikan oleh fenol-kloroformmethod (Sambrook dan Russell, 2001) dan
konsentrasi yang ditentukan menggunakan Kit Qubit®dsDNA BR Assay dan Qubit®flu-orometer
(Invitrogen). Semua template DNA disesuaikan dengan konsentrasi 50 ng / l dengan TE buffer (pH 8,0)
untuk analisis PCR lebih lanjut.
2.4 Perbandingan metode AP3 dan AP4
Metode AP3 dan AP4 dibandingkan untuk deteksi VPAHPND menggunakan 104 isolat yang sama
yang sebelumnya digunakan untuk validasi metode AP3 (Sirikharin et al., 2015b) (lihat di atas). Uji
reaktivitas silang tambahan dilakukan dengan menggunakan metode AP4 dengan contoh udang yang
ditantang dengan berbagai bakteri termasuk non-AHPND isolat VP (ISO40 dan S2-4), isolat Shewanella
yang berasal dari tambak udang, dengan VPAHPND isolat 5HP dan CN (posi). -kontrol aktif) dan udang
sehat (kontrol negatif). Total DNA (100 ng) template yang diekstraksi dari isolat atau udang-udang ini
dianalisis dengan nested PCR diikuti oleh geloserophoresis agarose 1,5% dengan pewarnaan ethidium
bromide dan visualisasi oleh transilluminator UV.
2.5 Sensitivitas deteksi komparatif dari metode AP3 dan AP4
sepuluh kali lipat pengenceran serial 50 µl dari total DNA yang diekstrak dari udang yang terinfeksi
dengan VPAHPND digunakan sebagai template (2 µl) untuk nested PCR AP4 dan untuk AP3 PCR langkah
tunggal. Produk PCR menjadi sasaran elektroforesis gel agarosa 1,5% untuk perbandingan sensitivitas.
2.6 Tes sensitivitas PCR Time-course
Untuk sensitivitas waktu, tes PCR udang putih Pasifik (Litopenaeus vannamei) digunakan. Udang
memiliki bobot rata-rata 2-4 g dan dipertahankan pada suhu kamar (30-32◦C) dalam tangki plastik aerasi
yang mengandung 80-100 L air laut buatan dengan salinitas 20 ppt. Udang diberi makan 2 kali sehari
dengan 10% berat badan menggunakan pelet pakan udang komersial. Setiap kelompok eksperimen
mengandung 20 udang.
Isolat VPAHPND yang digunakan dalam tes ini adalah 5HP yang berasal dari wabah penyakit
AHPND (Joshi et al., 2014). Media cair budidaya di OD600 = 0,6 ditambahkan ke tangki udang untuk
mencapai konsentrasi akhir 105cfu / ml, sementara volume TSB yang sama ditambahkan ke tangki udang
kontrol negatif. Sebelum penambahan bakteri, 3 udang dikeluarkan dari masing-masing tangki untuk
deteksi VPAHPND menggunakan metode AP4. Setelah itu, 3 udang lagi dibuat untuk pengujian setiap 6
jam hingga 48 jam, asalkan udang masih ada. Jaringan perut udang ini di ambil secara aseptik untuk
ekstraksi DNA dan pengujian PCR.
Gambar. 2. Contoh gel agarose dari ampul AP3 dan AP4 PCR yang diperoleh untuk VPAHPND.Jalur
bertanda M menunjukkan penanda ukuran molekuler. Dalam Lanes 1 dari gel untuk metode APAP ada pita
amplikon 333 bp yang menunjukkan adanya gen AHPND ToxA dalam DNA cetakan. Dalam Lane 1 gel
untuk metode AP4, ada satu pita amplikon 230 bp dari langkah PCR 2 (bertingkat) yang menunjukkan
tingkat rendah VPAHPNDtarget dalam DNA template. Dalam Lane 2 dari gel untuk metode AP4 ada 4
band amplikon 1269, 1142, 357 dan 230 bp yang menunjukkan tingkat tinggi dari target VPAHPND dalam
DNA template.

3. Hasil dan Diskusi

3.1.1 Deteksi VPAHPND yang berhasil menggunakan metode nested PCR AP4
Metode PCR
Diagram gen organisasi ToxA dan ToxB ditunjukkan pada Gambar. 1 dengan urutan primer dan
lokasi yang ditujukan. Gel sampel agarose yang menunjukkan produk PCR dari metode AP4 (1269 bp
untuk primer luar pada PCR langkah pertama dan 230 bp untuk langkah PCR nested kedua)
ditunjukkan dan dibandingkan dengan produk PCR dari metode AP3 pada Gambar. 2. Perhatikan bahwa
spesimen dengan infeksi VPAHPND parah menunjukkan dua tambahan produk PCR dari 1142 dan 357 bp
yang dihasilkan dari reaksi silang antara primer nested dan primer PCR langkah pertama yang tersisa
ditambah template DNA yang disertakan. dengan produk PCR 1 langkah dalam solusi template yang
digunakan untuk yang kedua, nested
3.2 Validasi metode pendeteksian AP4
Metode Menggunakan 104 isolat bakteri bioassay yang sama yang sebelumnya digunakan untuk
memvalidasi metode AP3 (Sirikharin et al., 2015b) Metode AP4 digunakan bersama-sama dengan metode
AP3 lagi dan keduanya memprediksi nilai prediksi positif dan negatif 100% untuk mendeteksi VPAHPND
(Tabel 4) Contoh gel elektroforesis agarose diperlihatkan untuk satu set tambahan 3 isolat non-AHPND
(V.parahaemolyti-cus S2-4 plus ISO40, ditambah satu isolat Shewanella) untuk perbandingan dengan
VPAHPNDisolates 5HP dan CN (Gambar 3). Angka ini juga termasuk contoh DNA diekstraksi dari udang
pada 36 jam setelah injeksi dengan 5HP dibandingkan dengan ekstrak udang yang disuntik dengan buffer
Demikian pula, DNA dari udang yang ditantang awal setelah tantangan laboratorium dengan VPAHPND
memberikan hasil negatif dengan metode AP3 tetapi positif.hasil dengan metode AP4 (lihat Bagian 3.3 di
bawah). Semua hasil menunjukkan bahwa metode AP4 spesifik untuk VPAHPND dan tidak menghasilkan
amplikon non-spesifik dengan bakteri non-AHPND atau dengan templat DNA dari host VPAHPND
potensial yang diuji hasil dengan metode AP4 (lihat Bagian 3.3 di bawah). Semua hasil menunjukkan bahwa
metode AP4 spesifik untuk VPAHPND dan tidak menghasilkan amplikon non-spesifik dengan bakteri non-
AHPND atau dengan templat DNA dari host VPAHPND potensial yang diuji

AP4 Gambar. 3. Contoh gel agarosa dari tes spesifisitas untuk metode PCR AP4. Contoh gel agarosa
menunjukkan hasil tes AP4 positif untuk VPAHPND isolat 5HP dan CN dibandingkan dengan hasil tes
negatif untuk non-AHPND V. parahaemolyticusisat ISO40 dan S2-4 dan untuk non-Vibrio mengisolasi
Shewanella. Juga ditunjukkan hasil tes arenegatif untuk udang yang tidak terinfeksi dan hasil positif untuk
templat DNA dari sampel udang duplikat yang diambil pada 36 jam setelah tantangan rendam dengan 5HP.
Jalur bertanda M menunjukkan penanda ukuran molekuler dan + ve dan –c menunjukkan kontrol positif
dan negatif.
Gambar. 4. Perbandingan sensitivitas deteksi untuk metode AP3 dan AP4. (A) Agarose gel produk PCR
yang diperoleh menggunakan metode AP3 dengan 10 kali lipat template DNA bersisi serial dari VPAHPND
isolat 5HP dan menunjukkan batas deteksi dari 10 pg total DNA. (B) Agarose gel produk PCR
menggunakan metode AP4 dengan templat yang sama seperti pada (A) dan menunjukkan batas deteksi 100
fg total DNA.

Gambar. 5. Perbandingan metode AP3 dan AP4 pada udang yang ditantang VPAHPND. (A) Agarose gel
amplik PCR yang diperoleh dengan menggunakan metode AP3 dan menunjukkan bahwa kebanyakan
sampel memberikan hasil tes negatif sampai 36 jam pasca tantangan. (B) Agarose gelsof amplikon PCR
diperoleh dengan menggunakan metode AP4 dengan template yang sama seperti pada Band yang
menunjukkan bahwa 2/3 sampel memberikan hasil tes positif sedini 6 dan 12 jam pasca tantangan sementara
semua 3 sampel positif dari 24 jam ke depan.
3.3 Metode AP4 100 kali lebih sensitif daripada metode AP3

Ketika DNA diekstraksi dari VPAHPND secara serial diencerkan untuk mendeteksi batas deteksi
AP3 dan AP4 metode, ditemukan bahwa AP4 dapat mendeteksi VPAHPND pada konsentrasi 100 kali lebih
rendah daripada yang dideteksi oleh AP3 (Gambar. 4) (yaitu, 100 fg untuk AP4 dibandingkan dengan 10
pg untuk AP3). Ini menunjukkan bahwa metode AP4 akan cocok sebagai pilihan alternatif untuk deteksi
langsung VPAHPND dalam materi di mana budaya pengayaan sebelum analisis tidak mungkin (misalnya,
sampel diawetkan dalam etanol, sampel jaringan beku, DNA diarsipkan, dll.)

3.4. Metode AP4 mendeteksi VPAHPND awal setelah infeksi udang

Perbandingan kemampuan metode AP3 dan AP4 untuk mendeteksi VPAHPND pada tahap awal
infeksi menggunakan analisis waktu untuk udang yang ditantang laboratorium (Gambar 5) mengungkapkan
bahwa metode AP4 dapat mendeteksi VPAHPND dalam 2 dari 3 udang yang dikumpulkan pada 6
jam.tantangan sementara metode AP3 memberikan hasil negatif untuk 3 udang yang sama (yaitu, template
DNA yang sama).Dengan 12 jam pasca tantangan, metode AP4 memberikan hasil tes positif untuk 2/3 dari
udang yang dikumpulkan sementara AP3 memberikan hasil positif hanya untuk 1 dari mereka. Dengan 24
jam pasca tantangan, metode AP4 memberikan hasil positif untuk semua 3 udang sementara metode AP3
masih memberikan hasil positif hanya untuk 1. Tidak sampai 36 jam hasil positif untuk semua 3 udang
dengan kedua metode. Hasil ini menunjukkan bahwa metode PCR nested AP4 akan lebih memungkinkan
daripada metode AP3 untuk mendeteksi VPAHPND secara langsung pada tahap awal infeksi atau infeksi
ringan (yaitu, tanpa langkah budidaya pengayaan ).

Singkatnya, kami telah berhasil mengembangkan metode nested PCR AP4 yang memiliki
sensitivitas dan spesifisitas tinggi untuk mendeteksi VPAHPND pada tingkat yang lebih rendah daripada
yang mungkin menggunakan metode yang telah dipublikasikan sebelumnya dan tanpa reaksi silang dengan
bakteri-DNA non-AHPND atau DNA potensial inang.Metode baru ini cocok sebagai pilihan alternatif
untuk deteksi langsung dalam materi di mana pengkayaan budidaya sebelum analisis tidak mungkin
(misalnya, sampel diawetkan dalam etanol, sampel jaringan beku, DNA yang diarsipkan, dll.).

Ucapan Terima Kasih

Kami ingin mengucapkan terima kasih kepada Pusat Nasional untuk Rekayasa Genetik dan Bioteknologi
(BIOTEC), Thailand untuk mendukung penelitian ini. Karya ini didukung oleh Royal Golden JubileePh.D.
program (RGJ-Ph.D untuk R. Sirikharin), ResearchFund Thailand