PERTEMUAN KE 5

ANALISIS KROMATOGRAFI KERTAS (KK)DAN KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT)

Kromatografi merupakan suatu teknik pemisahan campuran yang didasarkan atas

pembagian beberapa bagian dari senyawa di suatu fase gerak dan fase diam. Kromatografi adalah
pemisahan suatu zat berdasarkan perbedaan kecepatan zat terlarut yang bergerak bersama-sama
dengan pelarutnya pada permukaan benda penyerap. Setiap zat kimia mempunyai kecepatan
yang berbeda pada pelarut tertentu. Hal ini disebabkan adanya perbedaan kelarutan setiap jenis
zat yang akan dipisahkan. Kromatografi dapat digunakan untuk memisahkan zat-zat penyusun
yang terdapat dalam suatu campuran. Kromatografi adalah kelompok metode penting yang
meliputi pemisahan, identifikasi dan penetapan kadar komponen-komponen dari campuran yang
komplek. Pada semua pemisahan kromatografi sampel dilarutkan dalam fase gerak, yang dapat
berupa gas atau cairan. Fase gerak kemudian bergerak melewati fase diam yang tidak
bercampur, yang berada di dalam kolom atau pada permukaan padat.

Dasar pemisahan kromatografi adalah perbedaan kecepatan migrasi komponen (senyawa-

senyawa) yang dibawa oleh fasa gerak (mobile phase) dan ditahan secara selektif oleh fasa diam
(stationary phase). Metode pemisahan ini sangat dikenal di laboratorium kimia karena dasar
pemikiran yang sederhana dan mudah difahami. Hasil pemisahan yang dikehendaki tergantung
untuk keperluannya, sehingga dapat dipilih teknik kromatografi yang sesuai, dari yang sederhana
hingga yang sangat rumit.

Keuntungan dari kromatografi yaitu merupakan metode pemisahan yang cepat dan
mudah serta menggunakan peralatan yang murah dan sederhana. (Kecuali untuk kromatografi
gas) hingga campuran yang kompleks dapat dipisahkan dengan mudah. Keuntungan lebih lanjut
ialah hanya membutuhkan campuran cuplikan yang sangat sedikit sekali, bahkan justru tak
mungkin menggunakan jumlah yang besar dalam kromatografi. Disamping itu pekerjaan dapat
diulang.

 Jenis-Jenis Kromatografi

Penggolongan kromatografi ada 3 yaitu :

 Berdasarkan prinsip/mekanisme pemisahan

Kromatografi Berdasarkan prinsip/mekanisme pemisahannya pemisahannya,
kromatografi dapat dibedakan menjadi: kromatografi adsorpsi; kromatografi partisi;
kromatografi penukar ion; kromatografi eksklusi ukuran,kromatografi afinitas
 Berdasarkan fase yang digunakan
Kromatografi berdasarkan fase yang digunakan dapat dibedakan menjadi kromatografi
Padat cair; kromatografi Padat cair; kromatografi Cair cair (k.partisi); kromatografi Gas
cair.
 Berdasarkan alat yang digunakan
 Kromatografi Berdasarkan alat yang digunakan dapat dibedakan menjadi kromatografi
kertas, kromatografi lapis tipis, Kromatografi kolom Kromatografi
penukarion,Kromatografi cair kinerja tinggi dan kromatografi gas.
 Istilah-istilah dalam kromatografi

Dalam kromatografi, dikenal beberapa istilah, antara lain:

 Analit : zat yang dipisahkan.

 Kromatogram : output visual yang diperoleh dari hasil pemisahan. Adanya puncak
karakterisitik yang berbeda menunjukkan adanya senyawa yang berbeda.
 Kromatograf : peralatan yang dapat melakukan pemisahan yang bagus, semisal
pemisahan kromatografi gas atau pemisahan kromatografi cairan .
 Eluen : pelarut yang digunakan untuk memisahkan analit.
 Fasa gerak : fasa zat yang bergerak pada arah tertentu.
 Fasa diam : fasa yang tetap pada tempatnya.
 Waktu retensi : waktu yang diperlukan analit untuk melewati sistem.
 Volume retensi : volume fasa gerak yang dibutuhkan untuk mengelusi komponen analit.
 Fase pendukung : bahan padat netral terhadap linarut, berfungsi menahan fase diam
supaya berfungsi sesuai yang dikehendaki.
 Elusi : proses awal hingga selesai digerakkan linarut oleh fase gerak menelusuri fase
diam.
 Visualisasi : proses mendeteksi hasil pemisahan baik langsung dengan mata atau melalui
tahapan perlakuan terhadap hasil pemisahan tersebut. Misalnya dengan sinar ultra
lembayung ataupun dengan dengan reagen pewarna.
 Pengertian Kromatografi Kertas

Kromatografi kertas adalah suatu metode pemisahan campuran dari substansinya menjadi
komponen- komponennya berdasarkan distribusi suatu senyawa pada dua fase, yaitu fase diam
dan fase gerak. Fasa diam dalam kromatografi berupa air yang terikat pada selulosa kertas,
sedangkan fasa geraknya berupa pelarut organik non polar (pelarut yang sesuai). Kromatografi
kertas sering dipakai untuk memisahkan zat-zat warna penyusun tinta atau bahan perwarna
lainnya. Kromatografi kertas yaitu suatu pemisahan dimana fase diam berupa zat cair yang
menggunakan zat padat untuk menyokong fase diam yaitu kertas, kemudian diletakkan dalam
bejana tertutup yang berisi uap jenuh larutan. Ini adalah merupakan jenis dari sistem partisi di
mana fase diam adalah air, disokong oleh molekul-molekul selulosa dari kertas, dan fase
bergerak biasanya merupakan campuran dari satu atau lebih pelarut-pelarut organik dan air.
Kromatografi kertas adalah metode analitik yang digunakan untuk memisahkan zat atau bahan
kimia yang berwarna terutama pigmen. Hal ini juga dapat digunakan untuk menganalisis warna
primer atau sekunder pada percobaan tinta.

 Prinsip Kromatografi Kertas

 Prinsip kromatografi kertas adalah adsorbsi dan kepolaran, dimana adsorbsi didasarkan pada
panjang komponen dalam campuran yang diadsorbsi pada permukaan fase diam dan
kepolaran komponen berpengaruh karena komponen akan larut dan terbawa oleh pelarut
jika memiliki kepolaran yang sama serta kecepatan migrasi pada fase diam dan fase gerak.
Sedangkan prinsip kerja kromatografi kertas adalah pelarut bergerak lambat pada kertas,
komponen-komponen bergerak pada laju yang berbeda dan campuran dipisahkan
berdasarkan pada perbedaan bercak warna.
 Tujuan Kromatografi Kertas
Tujuan kromatografi kertas adalah memisahan campuran dari substansinya menjadi
komponen-komponennya berdasarkan distribusi suatu senyawa pada dua fase, yaitu fase
diam dan fase gerak.
 Peralatan Dan Bahan Dalam Kromatografi Kertas
Adapun alat dan bahan yang digunakan dalam pelaksanaan teknik pemisahan menggunakan
metode kromatografi antara lain yaitu pipa kapiler, gunting, tabung gelas, penutup tabung
gelas, penggaris, pensil, pipet tetes dan beberapa alat yang lain yang mungkin dibutuhkan.
Sedangkan bahan yang diperlukan antara lain yaitu kertas whatman atau kertas selulosa
sebagai fase diam, pelarut sebagai fase gerak dan beberapa larutan lain yang diperlukan
sesuai dengan komponen campuran yang akan dipisahkan.

Hal–hal yang perlu diperhatikan :

 Jenis Kertas
Kertas selulosa murni / kertas ini khusus dibuat untuk kromatografi, dapat
dipergunakan kertas whatman no. 1 dan no. 3 yang terdiri dari x-selulosa 98-99% dan
B-selulosa 0,3-1,0%. Kertas selulosa yang telah dimodifikasi Dengan zat kimia,
contoh : kertas diasetilasi dengan zat kimia untuk pemisahan steroid. Kertas yang di
Impregnase, contoh : kertas di impregnasi dengan minyak untuk pemisahan amina.
Kertas yang diberi zat tambahan
 Cara kerja Kromatografi kertas
Potong kertas saring 2×12 cm. Tandai dengan menggunakan pensil dari tepi bawah (2
cm) dan tepi atas (1cm). Totolkan tinta pada garis tepi bawah. Masukkan akuades
dalam gelas ukur. Masukkan kertas saring ke dalam gelas ukur dengan posisi totolan
tinta berada dibawah (totolan tinta jangan sampai masuk ke dalam akuades). Biarkan
sampai terjadi elusi. Tandai bercak dengan menggunakan pensil. Ulangi cara kerja
nomer 1 hingga 7 dengan menggunakan pelarut isopropyl alcohol
 Jenis-Jenis Kromatografi Kertas

Berdasarkan arahnya kromatografi kertas terbagi atas dua yaitu kromatografi kertas satu
arah dan kromatografi kertas dua arah.

1. Kromatografi Kertas Satu Arah

 Dalam kromatografi kertas, fase diam adalah kertas serap yang sangat seragam. Fase gerak
adalah pelarut atau campuran pelarut yang sesuai. Sampel tinta diteteskan pada garis dasar pensil
pada selembar kromatografi kertas. Beberapa pewarna larut dalam jumlah yang minimum dalam
pelarut yang sesuai, dan itu juga di teteskan pada garis yang sama. Kertas digantungkan pada
wadah yang berisi lapisan tipis pelarut atau campuran pelarut yang sesuai didalamnya. Perlu
diperhatikan bahwa batas pelarut berada dibawah garis pada bercak diatasnya. Kadang-kadang
kertas hanya digulungkan secara bebas pada silinder dan diikatkan dengan klip kertas pada
bagian atas dan bawah. Silinder kemudian ditempatkan dengan posisi berdiri pada bawah wadah.
Alasan untuk menutup wadah adalah untuk meyakinkan bahwa astmosfer dalam gelas kimia
terjenuhkan denga uap pelarut. Penjenuhan udara dalam gelas kimia dengan uap menghentikan
penguapan pelarut sama halnya dengan pergerakan pelarut pada kertas (Khopkar, 1990).

2. Kromatografi Kertas Dua Arah

Kromatografi kertas dua arah dapat digunakan dalam menyelesaikan masalah pemisahan
substansi yang memiliki nilai Rf yang sangat serupa. Pada saat kromatogram dibuat dari bercak
tunggal dari campuran yang ditempatkan ke depan dari garis dasar. Kromatogram ditempatkan
dalam sebuah pelarut sebelum dan sesudah sampai pelarut mendekati bagian atas kertas
(Khopkar, 1990).

Pada krois matografi kertas terdapat tiga metode yang digunakan dalam proses kromatografi
kertas, yakni :

 Kromatografi kertas menurun-Pada jenis ini, pengembangan kromatogram adalah

menurun dengan membiarkan pelarut bergerak turun mengaliri kertas.
 Kromatografi kertas menanjak-Di sini, pelarut bergerak mendaki kertas kromatografi.
Baik kromatografi kertas menurun maupun menanjak digunakan untuk pemisahan
bahan kimia organik dan anorganik.
 Kromatografi kertas naik-turun-Merupakan gabungan kedua teknik di atas. Bagian
atas kromatografi menanjak dapat dilipat pada sebuah rol di bagian atas bejana, dan
aliran eluen akan menurun setelah melewati lipatan.
 Kromatografi kertas radial-Disebut juga sebagai kromatografi sirkular. Di sini,
digunakan kertas saring berbentuk lingkaran, dan sampel ditotolkan di pusat kertas.
Setelah noda mengering, kertas saring diletakkan horisontal di atas cawan petri yang
berisi pelarut, sehingga sumbu kertas tercelup ke dalam pelarut. Pelarut mengalir naik
melalui sumbu dan komponen terpisah dalam bentuk zona-zona melingkar.
 Kromatografi kertas dua dimensi-Dalam teknnik ini, digunakan kertas berbentuk
bujur sangkar. Sampel ditotolkan di salah satu sudut dan dikembangkan dengan sudut
yang tepat sesuai arah aliran yang diinginkan.

Berdasarkan arahnya kromatografi kertas terbagi atas dua yaitu kromatografi kertas satu arah dan
kromatografi kertas dua arah.
 Kromatografi lapis tipis

Kromatografi lapis tipis (KLT) adalah salah satu metode pemisahan komponen
menggunakan fasa diam berupa plat dengan lapisan bahan adsorben inert. KLT merupakan salah
satu jenis kromatografi analitik. KLT sering digunakan untuk identifikasi awal, karena banyak
keuntungan menggunakan KLT, di antaranya adalah sederhana dan murah. KLT termasuk dalam
kategori kromatografi planar, selain kromatografi kertas. Kromatografi juga merupakan analisis
cepat yang memerlukan bahan sangat sedikit, baik penyerap maupun cuplikannya. KLT dapat
digunakan untuk memisahkan senyawa – senyawa yang sifatnya hidrofobik seperti lipida – lipida
dan hidrokarbon yang sukar dikerjakan dengan kromatografi kertas. KLT juga dapat berguna
untuk mencari eluen untuk kromatografi kolom, analisis fraksi yang diperoleh dari kromatografi
kolom, identifikasi senyawa secara kromatografi, dan isolasi senyawa murni skala kecil
(Fessenden,2003).
Kromatografi Lapis Tipis (KLT) adalah suatu teknik yang sederhana yang banyak
digunakan, metode ini menggunakan empeng kaca atau lembaran plastik yang ditutupi penyerap
atau lapisan tipis dan kering. Untuk menotolkan karutan cuplikan pada kempeng kaca, pada
dasarnya menggunakan mikro pipet atau pipa kapiler. Setelah itu, bagian bawah dari lempeng
dicelup dalam larutan pengelusi di dalam wadah yang tertutup (Soebagio,2002).
Kromatografi lapis tipis merupakan cara pemisahan campuran senyawa menjadi
senyawamurni dan mengetahui kuantitasnya yang menggunakan kromatografi juga merupakan
analisis cepat yang memerlukan bahan sangat sedikit, baik menyerap maupun merupakan
cuplikan KLT dapat digunakan untuk memisahkan senyawa-senyawa yang sifatnya hidrofilik
seperti lipid-lipid dan hidrokarbon yang sukar dikerjakan dengan kromatografi kertas. KLT juga
dapat digunakan untuk mencari kromatografi kolom, identifikasi senyawa secara kromatografi
dengan sifat kelarutan senyawa yang dianalisis. Bahan lapis tipis seperti silika gel adalah
senyawa yang tidak bereaksi dengan pereaksi-pereaksi yang lebih reaktif seperti asam sulfat.(
Fessenden, 2003 )
Pertimbangan untuk pemilihan pelarut pengembang (aluen) umumnya sama
dengan pemilihan eluen untuk kromatografi kolom. Dalam kromatografi adsorpsi, pengelusi
eluen naik sejalan dengan pelarut (misalnya dari heksana ke aseton, ke alkohol, ke air). Eluen
pengembang dapat berupa pelarut tunggal dan campuran pelarut dengan susunan tertentu.
Pelarut-pelarut pengembang harus mempunyai kemurnian yang tiggi. Terdapatnya sejumlah air
atau zat pengotor lainnya dapat menghasilkan kromatogram yang tidak diharapkan.
KLT merupakan contoh dari kromatografi adsorpsi. Fase diam berupa padatan dan fase
geraknya dapat berupa cairan dan gas. Zat terlarut yang diadsorpsi oleh permukaan partikel
padat..( Soebagio,2002)
Prinsip KLT adalah adsorbsi dan partisi dimana adsorbsi adalah penyerapan pada
pemukaan, sedangkan partisi adalah penyebaran atau kemampuan suatu zat yang ada dalam
larutan untuk berpisah kedalam pelarut yang digunakan. Kecepatan gerak senyawa-senyawa ke
atas pada lempengan tergantung pada (Soebagil,2002):
Bagaimana kelarutan senyawa dalam pelarut, hal ini bergantung pada bagaimana besar
atraksi antara molekul-molekul senyawa dengan pelarut. Bagaimana senyawa melekat pada fase
diam, misalnya gel silika. Hal ini tergantung pada bagaimana besar atraksi antara senyawa
dengan gel silika. Kromatografi lapis tipis menggunakan plat tipis yang dilapisi dengan adsorben
seperti silika gel, aluminium oksida (alumina) maupun selulosa. Adsorben tersebut berperan
sebagai fasa diam Fasa gerak yang digunakan dalam KLT sering disebut dengan eluen.
Pemilihan eluen didasarkan pada polaritas senyawa dan biasanya merupakan campuran beberapa
cairan yang berbeda polaritas, sehingga didapatkan perbandingan tertentu. Eluen KLT dipilih
dengan cara trial and error. Kepolaran eluen sangat berpengaruh terhadap Rf (faktor retensi)
yang diperoleh (Gandjar,2007).
Derajat retensi pada kromatografi lempeng biasanya dinyatakan sebagai faktor resensi.
Pada fase diam, jika dilihat mekanisme pemisahan, fase diam dikelompokkan (Gritter,1991) :
Nilai Rf sangat karakterisitik untuk senyawa tertentu pada eluen tertentu. Hal tersebut
dapat digunakan untuk mengidentifikasi adanya perbedaan senyawa dalam sampel. Senyawa
yang mempunyai Rf lebih besar berarti mempunyai kepolaran yang rendah, begitu juga
sebaliknya. Hal tersebut dikarenakan fasa diam bersifat polar. Senyawa yang lebih polar akan
tertahan kuat pada fasa diam, sehingga menghasilkan nilai Rf yang rendah. Rf KLT yang bagus
berkisar antara 0,2 - 0,8. Jika Rf terlalu tinggi, yang harus dilakukan adalah mengurangi
kepolaran eluen, dan sebaliknya (Gandjar,2007).
 PERTEMUAN KE 6

PENETAPAN KADAR SUATU SAMPEL SECARA KROMATOGRAFI KERTAS (KK) DAN

KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT)

Teknik pemisahan dengan metode kromatografi kertas dan metode kromatografi lapis tipis.
pemisahan logam-logam Fe3+, Cu2+, Mn2+, dan Ni2+ atau protein / karbohidrat dalam
campuran dengan teknik kromatografi kertas dan teknik kromatografi lapis tipis.
1. Kromatografi Kertas

Tabel.1 Pemisahan Logam Hg2+, Mn2+, Pb2+ dan Campuran

No. Perlakuan Pengamatan
1. Larutan standar logam Hg2+, Mn2+, Pb2+ Warna larutan bening
dan Campuran dimasukkan dalam botol
larutan
2. Totolan Warna tidak tampak
2+
1. Hg
2. Mn2+
3. Pb2+
4. Campuran logam
Masing-masing ditotolkan pada kertas
whatman
3. Kertas whatman dimasukkan ke Terjadi elusi
dalam chamber yang berisi eluen
(fasa gerak)
4. Kertas whatman dikeluarkan lalu Sampel tampak yaitu Pb2+, Mn2+,
dikeringkan kemudian diberikan sinar Cu2+, Hg2+ dan Campuran logam
tampak UV

Tabel.2 Pemisahan Karbohidrat

No. Perlakuan Pengamatan
1. Larutan standar karbohidrat (laktosa, Warnanya bening
sukrosa, dan sampel campuran)
dimasukkan dalam gelas kimia
2. Totolan Warna tidak tampak
1. laktosa
2. sukrosa
3. madu
4. sampel campuran
Masing-masing ditotolkan pada
kertas whatman
3. Kertas saring dimasukkan ke dalam Terjadi elusi
chamber yang berisi eluen (fasa
gerak)
4. Kertas saring dikeluarkan lalu Tidak ada noda yang tampak
dikeringkan kemudian diberikan sinar
 tampak UV

2. Kromatografi Lapis Tipis

Tabel.3 Pemisahan Logam Hg2+, Mn2+, Pb2+dan Campuran

No. Perlakuan Pengamatan
1. Larutan standar logam Pb2+, Mn2+, Cu2+, Warna larutan bening
Hg2+ dan Campuran dimasukkan dalam
gelas kimia
2. Totolan Warna tidak tampak
1. Hg2+
2. Mn2+
3. Pb2+
4. Campuran
Masing-masing ditotolkan pada plat KLT
3. Plat KLT dimasukkan ke dalam Terjadi elusi
chamber yang berisi eluen (fasa
gerak)
4. PlatKLTdikeluarkan lalu dikeringkan Sampel tampak yaitu Hg2+, Mn2+, Pb2+
kemudian diberikan sinar tampak UV dan Campuran logam

Tabel .4 Pemisahan Karbohidrat

No. Perlakuan Pengamatan
1. Larutan standar karbohidrat (laktosa, Warnanya bening
sukrosa, madu dan sampel campuran)
dimasukkan dalam botol larutan
2. Totolan Warna tidak tampak
1. Laktosa
2. Sukrosa
3. Madu
4. Campuran
Masing-masing ditotolkan pada plat KLT
3. Plat KLT dimasukkan ke dalam Terjadi elusi
chamber yang berisi eluen (fasa
gerak)
4. Plat KLT dikeluarkan kemudian Sampel tampak yaitu sukrosa dan
dikeringkan lalu diberikan sinar laktosa
tampak UV

 Reaksi Lengkap

H2SO4 + Pb2+ MnSO4 + 2H+

H2SO4 + Hg2+ HgSO4 + 2H+

 Perhitungan

 Kromatografi Kertas

1) Untuk Pemisahan Ion Logam

Jarak eluen = 7,9 cm

Jarak ion logam Hg2+ = 0 cm

Jarak ion logam Mn2+ = 0 cm

Jarak ion logam Pb2+ = 0 cm

Jarak campuran = 2,2 cm

Nilai Rf masing-masing sampel = ?

Penyelesaian :

a)

b)

c)

d) Nilai Rf campuran :

2) Untuk Pemisahan Karbohidrat

Jarak eluen = 7,9 cm

Jarak laktosa = 0 cm

Jarak sukrosa = 0 cm

Jarak madu = 0 cm

Jarak campuran = 3,1 cm

 Nilai Rf masing-masing sampel = ?

Penyelesaian :

a)

b)

c)

d) Nilai Rf campuran :

 Kromatografi Lapis Tipis

1) Untuk Pemisahan Ion Logam

Jarak eluen = 6,0 cm

Jarak Hg2+ = 3,8 cm

Jarak Mn2+ = 2,8 cm

Jarak Pb2+ = 0 cm

Jarak campuran = 2,8 cm

Nilai Rf masing-masing sampel = ?

Penyelesaian :

a)

b)

c)

d)

2) Untuk Pemisahan Karbohidrat

Jarak eluen = 6,0 cm

Jarak gerak laktosa = 0 cm

Jarak gerak sukrosa = 4,9 cm

Jarak gerak madu = 0 cm

Jarak gerak campuran = 4,0 cm

Nilai Rf masing-masing sampel = ?

Penyelesaian :
 PERTEMUAN KE 7
ANALISIS KLT DENSITOMETRI

 Pengertian KLT-Densitometri
Densitometri merupakan metode analisis instrumental yang didasarkan pada interaksi radiasi
elektromagnetik dengan analit yang merupakan bercak pada Kromatografi Lapis Tipis (KLT).
Densitometri dimaksudkan untuk analisis kuantitatif analit dengan kadar kecil, yang sebelumnya
dilakukan pemisahan dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) (Rohman, 2009).
Densitometri adalah metode analisis instrumental yang berdasarkan interaksi radiasi
elektromagnetik dengan analit yang merupakan noda pada KLT. Interaksi radiasi
elektromagnetik dengan noda KLT yang ditentukan adalah absorpsi, transmisi, pantulan
(refleksi) pendar fluor atau pemadaman pendar fluor dari radiasi semula. Densitometri lebih
dititik beratkan untuk analisis kuantitatif analit-analit dengan kadar yang sangat kecil yang perlu
dilakukan pemisahan terlebih dahulu dengan KLT. Densitometri merupakan metode penetapan
kadar suatu senyawa pada lempeng kromatografi, menggunakan instrumen TLC scanner,
pengukuran dilakukan dengan cara mengukur serapan analit (cahaya yang diukur dapat berupa
cahaya yang dipantulkan atau yang diteruskan), pemadaman fluoresensi untuk lapisan yang
mengandung bahan berfluorsensi analit atau hasil eaksi analit.
Densitometri adalah alat pelacak kuantitatif yang sangat terkenal. Alat ini dilengkapi
dengan spektrofotometer yang panjang gelombangnya dapat diatur dari 200-700 nm. Alat
tersebut dinamakan TLC Scanner. Teknik penggunaannya didasarkan pada pengukuran sinar
yang diteruskan, diserap dan dipantulkan atau yang dipendarkan. Sinar yang dipantulkan
mengalami hambatan oleh pendukung lempeng dan keseragaman fase diamnya. Sinar yang
dipantulkan dengan arah yang sudah pasti menuju bercak, maka arah pantulannya sehingga dapat
dipantau jumlah sinar yang diserap. Sinar ini sangat sensitif, maka untuk setiap senyawa dapat
dicari dengan serapan maksimalnya. Susunan optik densitometer ini tidak banyak berbeda
dengan spektrofotometer tetapi pada densitometer digunakan alat khusus yaitu reflection
photomultiflier, sebagai pengganti photomultiflier pada spektrofotometer yang dapat
memperbesar tenaga beda potensial listrik sehingga mampu menggerakkan integrator.
 S. LEVI dan R. Reisfeld telah mengangkat metode densitometri ke tingkat analisis
kualitatif ultrmikro. Prinsipnya analisis kuantitatif dengan metode densitometri hampir sama
dengan spektrofotometri.
 Instrumen
Komponen penting dari densitometer antara lain:
1. Sumber radiasi (Source), pengatur panjang gelombang (λ selector), beam spliter, thin layer
plate (end view), detector phototube (transmitance position) Sumber radiasi ada 3 macam
tergantung rentang panjang gelombang dan prinsip penentuan. Pada umumnya densitometri
memberikan rentang gelombang penentuan 200-630 nm. Lampu Deuterium (D2) dipakai
untuk pengukuran pada daerah cahaya tampak. Untuk penetapan pendar fluor dan
pemadaman pendar fluor dipakai lampu busur Hg bertekanan tinggi. Sama seperti pada
spektorfotometri, pada densitometri juga dilakukan penentuan transmisi atau adsorpsi dan
refleksi pada panjang gelombang maksimal. Pada penetapan pendar fluor dan pemadaman
pedar fluor juga harus dilakukan pada panjang gelombang dimana terjadi emisi atau
intensitas realitif pendar fluor yang optimal.
2. Monokromator dengan fungsi yang sama seperti pada spektrofotometri UV-Vis yang
diperlukan pada densitometer. Biasanya dipakai monokromator kisi difraksi 1200 garis/mm.
3. Detektor PMT Photo Multiplier Tube = Tabung Penggandaan Foto) merupakan detektor
umum yang dipakai pada densitometer.
INSTRUMENT KLT (TLC Scanner 3 CAMAG)
a. Detektor
Detektor pada alat TLC Scanner 3 CAMAG menggunakan photomultipliers.Komponen
didalam phot omultipier (PMT) sendiri adalah photomultiplier tube (tabung vakum
photomultiplier), photocathode (katoda metalik yang terbuat dari bahan logam multi alkali),
struktur dynode (berbentuk lempengan cekung) dan anoda (memilki spectral sensitivity 185-850
nm).
Prinsip kerja dari PMT adalah permukaan logam katoda disinari dengan seberkas cahaya
dan sejumlah elektron terpancar dari permukaannya, yang biasa disebut dengan efek fotoelektrik
dengan kondisi hampa udara.
Elektron yang terpancar dan terlepas karena adanya sekumpulan energi yang timbul dan
dikuatkan oleh susunan komponen dynode (linier -focused type) secara berurutan dan keluar
mengenai anoda.Elektron tersebut terikat dalam logam dengan energi W (eV), yang dikenal
sebagai fungsi kerja (work function), logam yang berbeda memilki fungsi kerja yang berbeda
pula. Dan logam katoda yang digunakan sebagai permukaan fotosensitif, dibawah panjang
gelombang pancung (cutoff wavelength) λc, sembarang sumber cahaya, selemah apapun, akan
menyebabkan terjadinya pemancaran fotoelektron. Cahaya yang masuk difokuskan dengan
melewati focusing electrode dan elektron mengenai dynode pertama kemudian dipantulkan dan
dipancarkan ke dynode kedua sampai ke dynode yang terakhir (proses pengalian) sehingga
terjadi muatan elektron yang lebih besar dan timbul tegangan.
b. Monokromator
Monokromator adalah alat yang paling umum dipakai untuk menghasilkan berkas radiasi
dengan satu panjang gelombang.Monokromator untuk radiasi ultra violet, sinar tampak dan infra
merah adalah serupa, yaitu mempunyai celah (slit), lensa, cermin dan prisma atau grating.
Terdapat 2 macam monokromator yaitu monokromator prisma Bunsen dan monokromator
grating Czerney-Turney
Fungsi prisma adalah untuk memisahkan sinar polikromatis dari sumber cahaya menjadi
sinar monokromatis. Bila seberkas cahaya dilewatkan melalui sebuah prisma, maka cahaya
tersebut akandiuraikan menjadi beberapa warna (terdapat berbagai warna merah, jingga, hijau,
biru, dan lain-lain).

Beda lintasan (modus refleksi) :

AB+CD = a(sin (θm) + sin (θi)) (2.1)
Sehingga kondisi untuk puncak maksimum menjadi:
a(sin (θm ) + sin (θi)) = m λ (2.2)
c. Absorbansi
Penyerapan hanya terjadi jika energi foton yang datang cocok dengan energy yang
diperlukan untuk memindahkan satu elektron terluarnya dari tingkat dasar ke tingkat tereksitasi
(atau dari pita valensi ke pita konduksi di dalam zat padat). Dengan spektroskopi dari cahaya
transmisi bisa diketahui tingkat/pita energi dari suatu atom/molekul/zat padat.
Berkas radiasi elektromagnet bila dilewatkan pada sampel kimia maka sebagian akan
terabsorpsi. Energi elektromagnet yang ditransfer ke molekul sampel akan menaikan tingkat
 energi (tingkat tereksitasi). Molekul akan dieksitasi sesuai dengan panjang gelombang yang
diserapnya.
Rumus yang digunakan untuk menghitung besarnya energi yang diserap:
E = h x ν = h x C /λ = h x C / v (1.3)
Dimana, E = energi yang diserap
h = tetapan Planck = 6,626 x 10-34
v = frekuensi
C = kecepatan cahaya = 2,998 x 108 m/det
λ = panjang gelombang
ν = bilangan gelombang
Absorbansi dengan simbol A dari suatu larutan merupakan logaritma dari 1/T atau logaritma
Io/It.
A = log (1/T) = log (Io/It) = - log (T) (1.4)
dimana, A = Absorbansi / serapan
Io = Intensitas sinar yang datang
It = Intensitas sinar yang diteruskan
T = Transmitance / transmitansi
d. Transmitansi
Apabila suatu berkas sinar radiasi dengan intensitas Io dilewatkan melalui suatu larutan
dalam wadah transparan maka sebagian radiasi akan diserap sehingga intensitas radiasi yang
diteruskan It menjadi lebih kecil dari Io. Transmitansi dengan simbol T dari larutan merupakan
fraksi dari radiasi yang diteruskan atau ditansmisikan oleh larutan, yaitu :
T = It/Io (2.5)
Transmitansi biasanya dinyatakan dalam persen (%).
TLC Scanner 3 CAMAG
Alat TLC Scanner 3 CAMAG, terdiri atas bagian -bagian elektronik, yaitu :
1. A compartment for plate positioning (with motor driver).
2. Optical system.
3. Three light source ( Deuterium lamp, Tungsten – halogen lamp, Mercury vapor lamp).
· Scanner setup.
Terdapat 2 macam cara sistem kerja / sistem pengukuran TLC Scanner 3 CAMAG, a ntara lain :
1. Absorbance Mode.
2. Fluorescence Mode.
 Absorbance Mode
Setelah sampel pada plat TLC mengalami pemisahan, selanjutnya plat TLC dimasukkan
kedalam alat TLC Scanner untuk dilakukan pengukuran. Dan ditentukan range panjang
gelombang, lalu di start/ dimulai. Prinsip kerja dengan cara absorbance, yaitu energy cahaya
dari sumber lampu yang telah dipilih masuk ke monokromator (M) kemudian cahaya yang keluar
dari monokromator akan mengenai mirror dan dipantulkan menurun mengenai dan melalui Beam
Splitter dan langsung mengenai permukaan putih pada plat TLC yang kemudian akan
dipantulkan ke detektor pengukuran. Sebagian cahaya yang mengenai Beam Splitter dipantulkan
ke reference detektor. Reference detektor berfungsi untuk mengatur sensitivity / kepekaan
cahaya secara otomatis pada detektor pengukuran sehingga mendapatkan pancaran cahaya
lampu yang tepat pada panjang gelombang tertentu. Kedua detektor memakai photomultiplers
yang mana lebih sensitive dengan range panjang gelombang yang besar.
Energi cahaya yang dipantulkan dideteksi oleh photomulplier, yang mana photon
memukul/mengenai katoda photomultiplier dan dikuatkan oleh dynodes. Kemudian
kromatogram (sampel pada plat) discan dan timbul perbedaan tegangan yang dihasilkan pada
detektor yang mana diplot sebagai fungsi posisi pengukuran untuk hasil dari sebuah absorption
scan. Jika backgr ound plat discan, intensitas cahaya yang penuh dipantulkan kembali dan
menghasilkan sinyal 100% karena disana tidak ada zat yang menyerap cahaya. Bila daerah
kromatogram discan kemudian akan menyerap bagian penyinaran cahaya dan memancarkan
intensitas cahaya rendah daripada background plat kemudian akan menghasilkan sinyal pada
detektor.
Sistem scanning bekerja berdasarkan pergerakan plat TLC pada compartment secara
otomatis dan mempunyai posisi yang dapat diatur terhadap sumbu x dan y. Plat TLC / objek
pengukuran yang berada pada compartment digerakkan oleh motor stepper yang terletak
dibawah sorotan lampu.
Absorbance adalah perbedaan diantara cahaya yang terjadi dan cahaya yang terserap
diukur sebagai fungsi karakteristik zat. Dengan kata lain, absorbance adalah perbedaan diantara
pantulan cahaya yang diukur dari tempat yang kosong pada plat TLC dan pantulan cahaya dari
zat pada plat TLC yang sama.
  Flourescence Mode
Prinsip kerja dengan cara fluorescence sama dengan cara absorbance, yaitu pada saat
melakukan scan pada suatu zat pada plat TLC, background plat tidak ada sinyal karena adanya
panjang gelombang yang tidak diperlukan akan dihalangi oleh filter.
Jika daerah fluorescent (sampel pada plat) mengalami scanning maka akan memancarkan
cahaya yang akan masuk dan melewati filter kemudian menghasilkan sinyal pada detektor.
Pengukuran fluorescent ini hanya untuk menganalisa zat yang tidak tampak.
Hasil sinyal output dari detektor dihubungkan dengan perangkat elektronik seperti
amplifier dan A/D Converter. Setelah sinyal output dari detektor masuk ke A/D Converter, lalu
sinyal output (analog) ini akan diubah menjadi sinyal digital, yang mana akan dihubungkan
langsung ke PC melalui connection serial interface RS232. Dengan didukungnya software
WinCATS maka dapat mengetahui nilai konsentrasi zat dan dapat menampilkan gambar Peak
(puncak kromatogram), yang mana gambar peak ini berbentuk mirip dengan kurva Gaussian,
yang menunjukkan karakteristik tersendiri dari zat yang diukur.
 Aplikasi KLT-Densitometri
1) Analisis Kualitatif
Analisis kualitatif dengan KLT-Densitometri pada prinsipnya mengacu kepada nilai Rf
(Retardation factor) atau Faktor retardasi yaitu : membandingkan Rf analit dengan Rf baku
pembanding atau membandingkan bercak kromatogram sample dengan kromatogram "Reference
Standart" yang dikenal dengan : Factro Retensi Relatif (Rx)
Untuk penentuan kualitatif dengan Rs harus dilakukan bersamaan dengan sample pada pelat
yang sama.
2) Analisis Kuantitatif
Analisis kuantitatif hampir sama dengan spektrofotometri, penentuan kadar analit
dikorelasikan dengan area bercak pada pelat KLT.
Cara penetapan kadar dapat dilakukan dengan :
1. Membandingkan area bercak analit dengan area bercak baku pembanding yang diketahui
konsentrasinya.
Cx = Ax / Ap x Cp
Cx = konsentrasi analit
Ax = area analit
Ap = area baku pembanding
Cp = konsentrasi baku pembanding

2. Kurva kalibrasi :
Kurva kalibrasi dibuat dengan cara memplot area bercak terhadap konsentrasi dari satu
seri larutan baku pembanding. Kurva yang tebentuk harus linear, kemudian dengan persamaan
garis regresi dapat ditentukan kadar analit.
Penentuan kadar analit yang dikorelasikan dengan area noda plat KLT akan lebih
terjamin kesahihannya dibanding metode KCKT atau KGC, sebab area noda kromatogram
diukur pada posisi diam atau “zig-zag” menyeluruh. Korelasi kadar analit pada noda
kromatogram yang dirajah terhadap area tidak menunjukkan garis lurus, akan tetapi merupakan
garis lengkung mendekati parabola (mulja,1985).
 PERTEMUAN KE 8

PENETAPAN KADAR SUATU SAMPEL SECARA KLT-DENSITOMETRI (STUDI KASUS)

PENETAPAN KADAR TARTRAZINE DALAM SAMPEL MINUMAN NUTRISARI DENGAN

METODE KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT) DENSITOMETRI

 Bahan

a. Aquades
b. Fase gerak etanol : n-butanol : air (8:3:1)
c. Kertas saring
d. Metanol
e. Sampel ( 1 bungkus Nutrisari 14 g)
f. Silika gel GF254
g. Standard tartrazine

 Cara Kerja

a. Pembuatan eluen / fase gerak

b. Preparasi sampel

c. Pembuatan Larutan Seri Kadar

d. Optimasi Panjang Gelombang Maksimal

e. Penetapan Kadar Sampel

 Perhitungan Pengenceran Seri Kadar

Standard tartrazine = = 1000 ppm

a. Seri Kadar 200 ppm

V1 × M1 = V2 × M2

x × 1000 ppm = 10 ml × 200 ppm

x = 2 ml

b. Seri Kadar 400 ppm

V1 × M1 = V2 × M2

x × 1000 ppm = 10 ml × 400 ppm

 x = 4 ml

c. Seri Kadar 600 ppm

V1 × M1 = V2 × M2

x × 1000 ppm = 10 ml × 600 ppm

x = 6 ml

d. Seri Kadar 800 ppm

V1 × M1 = V2 × M2

x × 1000 ppm = 10 ml × 800 ppm

x = 8 ml

e. Seri Kadar 1000 ppm

V1 × M1 = V2 × M2

x × 1000 ppm = 10 ml × 1000 ppm

x = 10 ml

Data Hasil

Kadar ( ppm ) Rf AUC Yi ( Y- Yi ) ( Y – Yi ) 2

200 1.53 9444.4 6967.94 2476.46 6132854.132

400 1.56 5061.2 8985.34 -3924.14 15398874.74

600 1.53 13067.1 11002.74 2064.36 4261582.21

800 1.51 10757.6 13020.14 -2262.54 5119087.252

1000 1.53 16683.1 15037.54 1645.56 2707867.714

Sampel 1 1.51 12720.6 Ʃ = 33620266.05

Sampel 2 1.51 12699.0

Sampel 3 1.51 17005.1

Y = bx + a

a = 4950.54

b = 10.087
r = 0.74

Perhitungan Yi

Yi ( 200 ppm ) = 10.087 (200) + 4950.54

= 2017.4 + 4950.54

= 6967.94

Yi (400 ppm) = 10.087 (400) + 4950.54

= 4034.8 + 4950.54

= 8985.34

Yi (600 ppm) = 10.087 (600) + 4950.54

= 6052.2 + 4950.54

= 11002.74

Yi (800 ppm) = 10.087 (800) + 4950.54

= 8069.6 + 4950.54

= 13020.14

Yi (1000 ppm) = 10.087 (1000) + 4950.54

= 10087 + 4950.54

= 15037.54

Data Hasil Sampel

Kadar (ppm) Rf AUC Xi ( ppm ) (X rata-rata - Xi) (X rata-rata - Xi)2

Sampel 1 1.51 12720.6 770.304 140.871 19844.638

Sampel 2 1.51 12699.0 768.163 143.012 20452.432

Sampel 3 1.51 17005.1 1195.058 -283.883 80589.557

Ʃ = 40295.54

Perhitungan Xi

Sampel 1
Y = 10.087 (X1) + 4950.54

12720.6 = 10.087 (x1) + 4950.54

12720.6 – 4950.54 = 10.087 x1

7770.06 = 10.087x1

X1 = 770.304 ppm

Sampel 2

Y = 10.087 (X2) + 4950.54

12699.0 = 10.087x2 + 4950.54

12699.0 – 4950.54 = 10.087x2

7748.46 = 10.087x2

X2 = 768.163 ppm

Sampel 3

Y = 10.087 (X2) + 4950.54

17005.1 – 4950.54 = 10.087 x3

12054.56 = 10.087 x3

X3 = 1195.058 ppm

X rata – rata = 770.304 + 768.163 + 1195.058 = 911.175 ppm

= 911.175 mg / 1000 ml

% kadar = 911.175 mg / 1000 ml x 100 % = 0.456 %

2000 mg / 10 ml

Kadar tartrazine dalam bungkus minuman

0.456 % x 14000 mg = 63.84 mg/14 gram

100 %

Validasi Metode

Sy / x = akar Ʃ ( y – yi )2 / n – 2
 = akar 33620266.05 / 5 – 2

= akar 11206755.35

= 3347.645

SD = akar Ʃ (X rata-rata - Xi)2 / n – 1

= akar 120886.627 / 3 – 1

= akar 60443.3135

= 245.852

LOD = 3.3 ( Sy / x ) : b

= 3.3 (3347.645) : 10.087

= 1095.1967

LOQ = 10 ( Sy / x ) : b

= 10 (3347.65) : 10.087

= 3318.78

RSD = SD / X rata-rata x 100 %

= 245.852 / 911.175 x 100 %

= 26.98 %