PETUNJUK PRAKTIKUM

FARMAKOGNOSI FITOKIMIA

PENYUSUN

Dr.rer.nat. Yosi Bayu Murti, M.Si, Apt.

Dr. Erna Prawita Setyowati, M.Si, Apt.
Prof. Dr. Sudarsono, Apt.
Prof. Dr. Subagus Wahyuono, Apt.

LABORATORIUM FARMAKOGNOSI FITOKIMIA

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS GADJAH MADA

2019
TATA TERTIB PRAKTIKUM

1. Peserta Praktikum dianjurkan untuk mempersiapkan segala sesuatu untuk keperluan Praktikum
yang tidak disediakan oleh Laboratorium, misalnya: pakaian kerja (Jas Praktikum), lap kering dan
bersih dan lain-Iain

2. Peminjaman dan pemasangan alat praktikum dilakukan setelah menjalani pretes pada
dosen/asisten yang ada.

3. Setelah selesai praktikum, semua peralatan praktikum harus dikembalikan dalam keadan bersih
dan kering kepada petugas laboratorium

4. Bila berhalangan hadir, diwajibkan memberitahukan secara tertulis (surat keterangan dokter atau
orang tua/wali kepada dosen/asisten yang bertugas pada hari yang bersangkutan.

5. Laporan Praktikum diserahkan kepada asisten/dosen satu minggu kemudian, sebelum test materi
berikutnya.

6. Alat Praktikum yang rusak/hilang/pecah selama masih dalam pinjaman wajib diusahakan gantinya
sesuai dengan spesifikasi alat tersebut secepat mungkin. Semua peralatan yang tidak dipinjam
pergolongan Praktikum, dan disediakan laboratorium untuk Pemakaian bersama menjadi
tanggung jawab seluruh anggota golongan yang Praktikum pada hari yang bersangkutan.

7. Selama Praktikum berlangsung, tidak diperkenankan meninggalkan ruangan Praktikum. Bila perlu
meninggalkan ruangan praktikum, harus dilakukan pelimpahan tugas dan tanggung jawab seizin
dosen/asisten yang bertugas.

8. Semua mahasiswa Peserta Praktikum diwajibkan untuk mengikuti seluruh acara Praktikum yaitu
pretest, praktikum, posttest, pembuatan laporan, presentasi dan responsi.

9. Segala sesuatu yang belum tercantum dalam tata tertib ini akan diberitahukan kemudian.

i
PETUNJUK PRAKTIKUM

1. Sebelum praktikum:
a. Bacalah Petunjuk praktikum ini dengan seksama!
b. Jawablah soal pekerjaan rumah.
c. Persiapkan pensil warna untuk menggambar skema kromatogram
d. Pretest
2. Selama praktikum:
a. Bekerja sama dengan anggota kelompok dengan baik.
b. Membuat laporan sementara hasil praktikum yang ditanda tangani oleh asisten tiap
akhir hari praktikum di buku ini.
3. Setelah praktikum: Buatlah laporan akhir per kelompok/per mata praktikum dengan format
seperti contoh di lampiran 2. Laporan dalam bentuk pdf. Format nama file: kls#_gol#_kel#_p#.pdf
untuk laporan sementara dan kls#_gol#_kel#_sampel.pdf untuk laporan akhir) dikirim peremail
dengan subyek sesuai nama file laporan ke alamat p.farmakognosi.fitokimia@gmail.com
selambat-lambatnya satu minggu setelah diskusi praktikum. Keterlambatan akan dikenakan
pengurangan nilai 5 poin.

Perhatian!

Dilarang menggandakan atau menyadur sebagian atau seluruh isi buku ini
tanpa ijin dari Penulis

ii
DAFTAR ISI
I. PENDAHULUAN ....................................................................................................................................1
A. Alur Praktikum .....................................................................................................................................1
1. Studi pustaka ................................................................................................................. 2
2. Tes Dosen ..................................................................................................................... 2
3. Praktikum I. Makroskopi dan Mikroskopi ........................................................................ 3
4. Praktikum II. Skrining Fitokimia ..................................................................................... 3
5. Praktikum III. Analisis Kualitatif secara KLT .................................................................. 3
6. Praktikum IV Pemisahan Senyawa Bahan Alam .............................................................. 3
7. Praktikum V. Analisis Kuantitatif Senyawa Bahan Alam .................................................. 4
8. Praktikum VI. Diskusi Hasil ........................................................................................... 4
9. Laporan Praktikum ........................................................................................................ 4
II. MIKROSKOPI TUMBUHAN DAN SIMPLISIA BAHAN OBAT ALAM ..........................................5
A. IDENTIFIKASI GOLONGAN SENYAWA.......................................................................................5
1. Makroskopi ................................................................................................................... 5
2. Mikroskopi – Mikrokimiawi ........................................................................................... 5
a) Antrakinon ................................................................................................................ 5
b) Flavonoid .................................................................................................................. 5
c) Saponin ..................................................................................................................... 6
d) Fenolik ...................................................................................................................... 6
e) Alkaloid .................................................................................................................... 7
f) Terpenoid .................................................................................................................. 7
III. SKRINING FITOKIMIA SIMPLISIA DAN EKSTRAK .......................................................................8
A. Jalur Mevalonat ....................................................................................................................................8
a) Uji terpenoid (Salkowski test) ..................................................................................... 8
b) Uji steroid ................................................................................................................. 8
B. Jalur Poliketida .....................................................................................................................................8
a) Uji kuinon (naftokuinon dan antrakuinon) .................................................................... 8
C. Jalur Sikimat (dan kombinasi dengan poliketida)................................................................................9
a) Uji kumarin ............................................................................................................... 9
b) Uji Flavonoid (Shinoda test) ....................................................................................... 9
c) Uji Senyawa Fenolik dan Tanin................................................................................... 9
D. Alkaloid ................................................................................................................................................9
IV. KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS KUALITATIF ............................................................................10

iii
 A. Senyawa Bahan Alam dari Jalur Asetat-Malonat ..............................................................................11
1. Kromatografi Lapis Tipis ............................................................................................. 11
a) Aloin ....................................................................................................................... 11
b) Emodin.................................................................................................................... 11
B. Senyawa Bahan Alam dari Jalur Asetat-Mevalonat ..........................................................................12
1. Kromatografi Lapis Tipis ............................................................................................. 12
a) Thymol dan Mentol .................................................................................................. 12
b) Sineol ...................................................................................................................... 12
c) Geraniol dan sitronellal ............................................................................................. 13
d) Steroid..................................................................................................................... 13
C. Senyawa Bahan Alam dari Jalur Sikimat...........................................................................................14
1. Kromatografi Lapis Tipis ............................................................................................. 14
a) Fenilpropanoid ......................................................................................................... 14
b) Jalur kombinasi fenilpropan dengan poliketida ........................................................... 15
D. Senyawa Bahan Alam dari Alkaloid ..................................................................................................16
1. Kromatografi Lapis Tipis ............................................................................................. 16
a) Pemerlksaan Alkaloid dengan Kromatografi Lapis Tipis ............................................. 16
V. PEMISAHAN BAHAN ALAM.............................................................................................................20
A. Kromatografi Cair Vakum .................................................................................................................20
1. Alat dan Bahan ............................................................................................................ 20
a) Bahan ...................................................................................................................... 20
b) Alat ......................................................................................................................... 20
2. Cara kerja .................................................................................................................... 20
B. Kromatografi Lapis Tipis Preparatif ..................................................................................................21
VI. ANALISIS KUANTITATIF BAHAN ALAM..................................................................................22
A. Spektrofotometri Ultraviolet Visibel .................................................................................................22
1. Flavonoid Total ........................................................................................................... 22
2. Penetapan Kadar Total Fenolik dan Tannin .................................................................... 22
a) Penyiapan cuplikan .................................................................................................. 22
b) Penetapan kadar Fenolik Metode Folin-Ciocalteu ....................................................... 22
c) Penetapan kadar residual fenolik ............................................................................... 23
3. Total Alkaloid ............................................................................................................. 23
a) Penyiapan larutan brom kresol hijau .......................................................................... 23
b) Penyiapan larutan buffer fosfat .................................................................................. 23
c) Penyiapan cuplikan .................................................................................................. 23

iv
 d) Penyiapan kurva baku ............................................................................................... 23
4. Penetapan Terpenoid Total ........................................................................................... 24
B. Kromatografi Lapis Tipis Densitometri .............................................................................................24
C. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi .....................................................................................................24

v
 I. PENDAHULUAN
Praktikum Farmakognosi-Fitokimia bertujuan memberikan kepada mahasiswa pengetahuan
dan ketrampilan kerja laboratorium yang meliputi: (1) makroskopi dan mikroskopi, (2) skrining
fitokimia dengan pereaksi warna dan pengendapan, (3) analisis kromatografi kualitatif, (4) pemisahan
senyawa bahan alam, dan (5) analisis kuantitatif senyawa bahan alam. Untuk mencapai tujuan
tersebut mahasiswa diharuskan mengikuti alur praktikum di bawah ini.

A. Alur Praktikum
ALUR PRAKTIKUM FARMAKOGNOSI FITOKIMIA

SAMPEL TUMBUHAN

STUDI PUSTAKA
SUSUN RANCANGAN PRAKTIKUM
TIDAK LOLOS

PRETES DOSEN

LOLOS

PRAKTIKUM I
MIKROSKOPI, MAKROSKOPI DAN MIKROKIMIAWI

Mhs mampu menent

PRAKTIKUMII Mhs mampu menent
EKSTRAKSI DAN SKRININGFITOKIMIA

PRAKTIKUM III
ANALISIS KUALITATIF TUMBUHAN OBAT Mhs menggunakan m
KARAKTERISASI KOMPOSISI KIMIAWI SECARA KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS BERDASARKAN STUDI PUSTAKA DAN HASIL PRAKTIKUM II

PRAKTIKUM IV
PEMISAHAN SENYAWA MARKER TUMBUHAN OBAT

PRAKTIKUM V
ANALISIS KUANTITATIF MARKER DALAM EKSTRAK TUMBUHAN OBAT

PRAKTIKUM IV
DISKUSI

LAPORAN PRAKTIKUM
BERBENTUK MONOGRAFI TUMBUHAN OBAT

Praktikum mengikuti alur proses sebagaimana terpapar di gambar 1. Satu kelompok

mahasiswa akan menerima tugas untuk mempelajari satu jenis tumbuhan obat yang ditentukan secara
terpisah (lihat pengumuman di Laboratorium). Selanjutnya praktikan melakukan serangkaian kegiatan
praktikum yang diawali dengan studi pustaka hingga diakhiri dengan responsi.

1
 1. Studi pustaka
Praktikan melakukan studi pustaka yang bertujuan untuk mendapatkan informasi terkait
tumbuhan obat yang ditugaskan. Pencarian dapat dilakukan ke sumber pustaka di perpustakaan
ataupun online seperti science direct atau google schoolar. Informasi yang dapat digunakan jika
berasal dari buku teks, farmakope atau jurnal ilmiah. Informasi yang dicari meliputi:

1. Mikroskopi tumbuhan obat. Bagian tumbuhan yang menjadi penghasil metabolit sekunder
2. Senyawa bahan alam yang terkandung: nama, struktur, golongan senyawa, sifat fisika kimia,
3. Sistem kromatografi lapis tipis kualitatif (fase diam, fase gerak, deteksi).
4. Metode pemisahan marker atau senyawa utama
5. Metode analisis kuantitatif marker
Praktikan yang sudah melakukan studi pustaka kemudian menyusun skema kerja praktikum
dari Praktikum I-V. Buatlah skema kerja yang bisa menunjukkan alur proses yang sistematis (INPUT –
PROCESS- OUTPUT). Lihatlah contoh yang ada dibawah ini

Bahan/simplisia ......

Ekstraksi dengan pelarut .....

Ekstrak........

Pemisahan dengan metode ......

Fraksi ...... Fraksi .......

Pemisahan dengan metode ......

Fraksi ....... Fraksi .......

2. Tes Dosen
Praktikan menghubungi dosen yang telah ditentukan (lihat pengumuman di Laboratorium)
untuk menentukan waktu untuk tes, jika lolos praktikan diijinkan untuk melakukan praktikum sesuai
jadual. Jika tidak lolos, praktikan diwajibkan melakukan studi pustaka kembali untuk
menyempurnakan rancangan praktikumnya dan kembali melakukan tes dosen. Tes dilakukan sekali
untuk menguji sekaligus rancangan praktikum I – V.

2
 3. Praktikum I. Makroskopi dan Mikroskopi
Praktikan menunjukkan bukti telah disetujui oleh dosen penguji. Praktikan melakukan
pengamatan baik makroskopis maupun mikroskopis terhadap bagian tumbuhan atau simplisia yang
telah disediakan. Lakukan dokumentasi dengan gambar sketch menggunakan pensil berwarna (bawa
sendiri) dan fotografis. Selanjutnya juga dilakukan analisis mikrokimiawi sesuai studi pustaka yang
dilakukan. Buat dokumentasi untuk setiap step kegiatan. Buat laporan sementara (unduh template
dari elisa) dan diperiksa oleh asisten. Praktikan yang tidak bisa menunjukkan bukti dokumentasi
dianggap tidak melakukan praktikumnya dan mendapat pengurangan nilai.

4. Praktikum II. Skrining Fitokimia

Praktikan menunjukkan rancangan praktikum skrining fitokimia yang telah disetujui oleh
dosen penguji. Praktikan melakukan uji tabung untuk menentukan golongan kimiawi yang terkandung
dalam ekstrak tumbuhan obat. Lakukan dokumentasi fotografis untuk ditampilkan dalam laporan.
Bandingkan dengan hasil studi pustaka. Buat laporan sementara dan diperiksa oleh asisten..

5. Praktikum III. Analisis Kualitatif secara KLT

Praktikan menunjukkan rancangan praktikum analisis kualitatif yang telah disetujui oleh
dosen penguji. Berdasarkan hasil studi pustaka dan hasil skrining fitokimia tentukan sistem KLT yang
akan digunakan dan laporkan ke Laboran untuk disediakan. Sistem KLT dapat berasal dari pustaka atau
sistem yang tersedia di buku petunjuk ini. Setiap kelompok mendapatkan jatah 5 potong pelat KLT
untuk analisis ini. Gunakan kelima pelat KLT untuk mengidentifikasi senyawa bahan alam yang
mungkin terkandung dalam ekstrak. Lakukan deteksi yang sesuai Lakukan dokumentasi fotografis.
Buat tabel analisis seperti di bawah ini untuk masing-masing pelat kromatogram. Buat laporan
sementara dan diperiksa oleh asisten.

Rf Sebelum semprot reagen warna Setelah semprot reagen warna interpretasi

Vis UV254 UV365 Vis UV254 UV365

0
...
1,0

6. Praktikum IV. Pemisahan Senyawa Bahan Alam

Praktikan menunjukkan rancangan pemisahan senyawa bahan alam yang telah disetujui oleh
dosen penguji. Praktikan melakukan tahapan pemisahan yang meliputi: 1. pemisahan secara
kromatografi cair vakum, 2. Penentuan fraksi yang dilanjutkan secara KLT, 3. KLT preparatif 4.
Pengambilan isolat. Isolat yang dihasilkan akan digunakan untuk analisis kuantitatif di praktikum V.
Sistem

3
 7. Praktikum V. Analisis Kuantitatif Senyawa Bahan Alam
Analisis kuantitatif yang dilakukan meliputi dua metode, yaitu analisis kadar total (golongan)
dan analisis kadar marker menggunakan isolat hasil praktikum IV. Praktikan menunjukkan rancangan
analisis kadar senyawa bahan alam yang telah disetujui oleh dosen penguji. Lakukan analisis kadar
total yang sesuai dengan golongan senyawa dari marker yang ditemukan dalam ekstrak. Selanjutnya
lakukan analisis kuantitatif marker dengan KLT kuantitatif atau HPLC sesuai dengan hasil tes dosen.

8. Praktikum VI. Diskusi Hasil

Praktikan memaparkan dari hasil studi pustaka hingga hasil-hasil praktikum secara jelas dan
tidak bertele-tele. Maksimum perkelompok hanya menggunakan 22 slide termasuk judul dan
kesimpulan.

9. Laporan Praktikum
Template laporan disediakan di Elisa untuk diunduh dan digunakan dalam pembuatan laporan.
Laporan merupakan kompilasi dari hasil studi pustaka, hasil-hasil praktikum dan hasil diskusi
praktikum, beserta lampiran dokumentasi praktikum. Laporan berbentuk softfile berformat .docx
dikirimkan maksimal 1 minggu setelah diskusi praktikum. Jangan menunda-nunda pembuatan laporan.
Laporan mulai dibuat sejak selesai praktikum pertama selesai!

4
 II. MIKROSKOPI TUMBUHAN DAN SIMPLISIA BAHAN
OBAT ALAM

A. IDENTIFIKASI GOLONGAN SENYAWA

1. Makroskopi
Ambilah contoh simplisia, tuliskan namanya beserta tanaman asal dan suku (familia),
kemudian deskripsikan ujudnya secara umum. Sebutkan ciri khas (bila ada), serta gambarlah simplisia
tersebut.

2. Mikroskopi – Mikrokimiawi
Buatlah irisan melintang preparat dan lakukan uji kandungan kimiawinya. Sampel yang berupa
simplisia kering direndam terlebih dahulu dalam air untuk melunakkan jaringan sebelum diiris.

a) Antrakinon
(1) Pereaksi KOH
Terhadap irisan melintang preparat yang telah dibuat: letakkan di atas gelas obyek, tutup
dengan gelas penutup, amati di bawah mikroskop dengan perbesaran 10 x 10, selanjutnya tambahkan
1-2 tetes pereaksi KOH melalui celah antar gelas penutup dan gelas obyek, amati perubahan warna
yang terjadi. Dokumentasikan sebelum dan sesudah diberi pereaksi.

(2) Pereaksi NaOH

Terhadap irisan melintang preparat yang telah dibuat: letakkan di atas gelas obyek, tutup
dengan gelas penutup, amati di bawah mikroskop dengan perbesaran 10 x 10, selanjutnya tambahkan
1-2 tetes pereaksi NaOH melalui celah antar gelas penutup dan gelas obyek, dan amati perubahan
warna yang terjadi. Dokumentasikan sebelum dan sesudah diberi pereaksi.

b) Flavonoid
(1) Pereaksi NaOH
Terhadap irisan melintang preparat yang telah dibuat: letakkan di atas gelas obyek, tutup
dengan gelas penutup, amati di bawah mikroskop dengan perbesaran 10 x 10, selanjutnya tambahkan
1-2 tetes pereaksi NaOH melalui celah antar gelas penutup dan gelas obyek, dan amati perubahan
warna yang terjadi. Dokumentasikan sebelum dan sesudah diberi pereaksi.

(2) Pereaksi AlCl3

Terhadap irisan melintang preparat yang telah dibuat: letakkan di atas gelas obyek, tutup
dengan gelas penutup, amati di bawah mikroskop dengan perbesaran 10 x 10, selanjutnya tambahkan

5
1-2 tetes pereaksi AlCl3 melalui celah antar gelas penutup dan gelas obyek, dan amati perubahan
warna yang terjadi. Dokumentasikan sebelum dan sesudah diberi pereaksi.

(3) Pereaksi Sitroborat

Terhadap irisan melintang preparat yang telah dibuat: letakkan di atas gelas obyek, tutup
dengan gelas penutup, amati di bawah mikroskop dengan perbesaran 10 x 10, selanjutnya tambahkan
1-2 tetes pereaksi sitroborat melalui celah antar gelas penutup dan gelas obyek, dan amati perubahan
warna yang terjadi. Dokumentasikan sebelum dan sesudah diberi pereaksi.

c) Saponin
(1) Pereaksi Lieberman Burchard
Terhadap irisan melintang preparat yang telah dibuat: letakkan di atas gelas obyek, tutup
dengan gelas penutup, amati di bawah mikroskop dengan perbesaran 10 x 10, selanjutnya tambahkan
1-2 tetes pereaksi Lieberman Burchard melalui celah antar gelas penutup dan gelas obyek, dan amati
perubahan warna yang terjadi. Dokumentasikan sebelum dan sesudah diberi pereaksi.

(2) Pereaksi Anisaldehid-asam sulfat

Terhadap irisan melintang preparat yang telah dibuat: letakkan di atas gelas obyek, tutup
dengan gelas penutup, amati di bawah mikroskop dengan perbesaran 10 x 10, selanjutnya tambahkan
1-2 tetes pereaksi anisaldehid-asam sulfat melalui celah antar gelas penutup dan gelas obyek, dan
amati perubahan warna yang terjadi. Dokumentasikan sebelum dan sesudah diberi pereaksi.

d) Fenolik
(1) Pereaksi FeCl3
Terhadap irisan melintang preparat yang telah dibuat: letakkan di atas gelas obyek, tutup
dengan gelas penutup, amati di bawah mikroskop dengan perbesaran 10 x 10, selanjutnya tambahkan
1-2 tetes pereaksi FeCl3 melalui celah antar gelas penutup dan gelas obyek, dan amati perubahan
warna yang terjadi. Dokumentasikan sebelum dan sesudah diberi pereaksi.

(2) Pereaksi Garam Fast Blue

Terhadap irisan melintang preparat yang telah dibuat: letakkan di atas gelas obyek, tutup
dengan gelas penutup, amati di bawah mikroskop dengan perbesaran 10 x 10, selanjutnya tambahkan
1-2 tetes pereaksi Garam Fast Blue melalui celah antar gelas penutup dan gelas obyek, dan amati
perubahan warna yang terjadi. Dokumentasikan sebelum dan sesudah diberi pereaksi.

6
 e) Alkaloid
(1) Dragendorf
Terhadap irisan melintang preparat yang telah dibuat: letakkan di atas gelas obyek, tutup
dengan gelas penutup, amati di bawah mikroskop dengan perbesaran 10 x 10, selanjutnya tambahkan
1-2 tetes pereaksi Dragendorf melalui celah antar gelas penutup dan gelas obyek, dan amati
perubahan warna yang terjadi. Dokumentasikan sebelum dan sesudah diberi pereaksi

(2) Wagner
Terhadap irisan melintang preparat yang telah dibuat: letakkan di atas gelas obyek, tutup
dengan gelas penutup, amati di bawah mikroskop dengan perbesaran 10 x 10, selanjutnya tambahkan
1-2 tetes pereaksi Wagner melalui celah antar gelas penutup dan gelas obyek, dan amati perubahan
warna yang terjadi. Dokumentasikan sebelum dan sesudah diberi pereaksi

(3) Bouchardat
Terhadap irisan melintang preparat yang telah dibuat: letakkan di atas gelas obyek, tutup
dengan gelas penutup, amati di bawah mikroskop dengan perbesaran 10 x 10, selanjutnya tambahkan
1-2 tetes pereaksi Bouchardat melalui celah antar gelas penutup dan gelas obyek, dan amati
perubahan warna yang terjadi. Dokumentasikan sebelum dan sesudah diberi pereaksi

f) Terpenoid
(1) Pereaksi Anisaldehid-asam sulfat
Terhadap irisan melintang preparat yang telah dibuat: letakkan di atas gelas obyek, tutup
dengan gelas penutup, amati di bawah mikroskop dengan perbesaran 10 x 10, selanjutnya tambahkan
1-2 tetes pereaksi anisaldehid-asam sulfat melalui celah antar gelas penutup dan gelas obyek, dan
amati perubahan warna yang terjadi. Dokumentasikan sebelum dan sesudah diberi pereaksi.

7
 III. SKRINING FITOKIMIA SIMPLISIA DAN EKSTRAK

Dalam praktikum ini mahasiswa akan diberi sampel berupa campuran dua ekstrak simplisia.
Praktikan di tugaskan untuk mengetahui: golongan senyawa yang terkandung dengan melakukan
tahapan sebagai berikut:

Tahap I. Uji pendahuluan (60 menit) dengan uji tabung dan reaksi warna seperti
praktikum farmakognosi (bawalah petunjuk praktikum farmakognosi)
untuk mengarahkan anda kepada golongan senyawa yang ada dalam
sampel.

Tahap II. Kromatografi lapis tipis (90 menit) masing-masing kelompok hanya diberi
maksimum 4 pelat KLT

Tahap III. Interpretasi hasil

Berikut uji-uji pendahuluan untuk menentukan atau identifikasi golongan Kimia Produk Alam.
Gunakan tabung reaksi 5 mL untuk percobaan.

A. Jalur Mevalonat
a) Uji terpenoid (Salkowski test)
Satu ml dari ekstrak dalam tabung reaksi dicampur dengan 0,5 mL kloroform, selanjutnya
secara hati-hati dialiri bertetes-tetes H2SO4 pekat melalui dinding tabung membentuk suatu lapisan (2
fase). Jika terbentuk warna merah tua dipertemuan kedua lapisan berarti positif ada terpenoid
(Edeoga. 2005).

b) Uji steroid
Satu mL asam asetat anhidrat ditambahkan ke 0,5 mL ekstrak etanol. Kemudian tambahkan
secara hati-hati dialiri bertetes-tetes H2SO4 pekat melalui dinding tabung membentuk suatu lapisan (2
fase). Perubahan warna dari ungu ke biru atau biru kehijauan menunjukkan adanya steroid. (Edeoga.
2005)

B. Jalur Poliketida
a) Uji kuinon (naftokuinon dan antrakuinon)
Ambil 0,5 mL ekstrak (dalam kloroform) ditambah 0,5 mL larutan NaOH 2 N dan digojog.
Adanya warna merah di fase air (lapisan atas) menunjukkan adanya antrakuinon bebas (Ajayi, 2012).

8
 C. Jalur Sikimat (dan kombinasi dengan poliketida)
a) Uji kumarin
Ambil 1 mL ekstrak dalam metanol (kadar 1mg/mL), tambahkan 0.5 ml NH4OH 10%. Teteskan
ke kertas saring dan diamati dibawah UV365. Fluoresensi kuat (biru terang hingga kuning kehijauan)
menunjukkan adanya kumarin (Zohra, 2012).

b) Uji Flavonoid (Shinoda test)

Ambil 1 mL ekstrak dicampur dengan sedikit serbuk 0,01 g magnesium dan ditambahkan 0,2
mL HCl pekat. Gojog kuat campuran. Terbentuknya warna merah, kuning atau jingga menunjukkan
adanya flavonoid (Zohra, 2012).

c) Uji Senyawa Fenolik dan Tanin

Ambil 5 mg ekstrak, tambahkan 5 mL etanol dan gojok hingga larut. Ambil larutan dan bagi
menjadi 2 tabung. Tabung pertama ditambahkan larutan FeCl3 10 bertetes-tetes. Reaksi positif jika
terbentuk warna biru (Fenolik) atau hijau kehitaman (Tanin). Untuk memastikan adanya tanin,
masukkan ke dalam tabung kedua larutan gelatin 1%. Jika terbentuk endapan menunjukkan adanya
tanin.

D. Alkaloid
Ekstrak ditambah 2 mL kloroform dan 2 mL amonia lalu disaring. Filtrat kemudian
ditambahkan 3-5 tetes H2SO4 pekat lalu dikocok hingga terbentuk dua lapisan. Lapisan atas
dipindahkan ke dalam tiga tabung reaksi masing-masing 2,5 mL. Ketiga larutan ini dianalisis dengan
pereaksi Mayer, Dragendorff dan Wagner sebanyak 4-5 tetes. Terbentuknya endapan menunjukkan
bahwa sampel tersebut mengandung alkaloid. Reaksi dengan pereaksi Mayer akan terbentuk endapan
putih, dengan pereaksi Dragendorff terbentuk endapan merah jingga dan dengan pereaksi Wagner
terbentuk endapan coklat.

9
 IV. KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS KUALITATIF

A. Cara Kerja Kromatografi Lapis Tipis

1. Penyiapan larutan uji dan larutan pembanding. Baca dan kerjakan sesuai prosedur di masing-
masing sampel.
2. Hidrolisis. Untuk sampel yang membutuhkan hidrolisis dilakukan dengan prosedur sebagai
berikut: uapkan sisa pelarut hingga tinggal ± 0,5 mL, masukkan ke tabung reaksi tutup lubang
tabung dengan kapas basah, tambahkan HCl 0,5 N sebanyak 4,5 mL hidrolisis selama 30
menit di tangas air. Partisi hasil dengan etil asetat 2 kali 5 mL, pekatkan fraksi etil asetat
hingga tinggal 1 mL.
3. Siapkan fase gerak. Masukkan sejumlah tertentu fase gerak (sesuai ukuran bejana dan pelat
KLT) kedalam bejana KLT dan diamkan selama 10 menit untuk menjenuhi bejana dengan uap
fase gerak.
4. Prosedur KLT. Totolkan volume tertentu larutan uji dan
larutan pembanding menurut cara yang tertulis pada masing-
masing sampel uji dengan jarak penotolan seperti gambar
disamping (bisa ditandai dengan pensil), kemudian biarkan
5 cm
mengering. Tetapkan jarak rambat 5 cm dari titik penotolan
dan tandailah dengan pensil garis pendek disamping pelat.
1 cm

1 cm

1 cm
Masukkan lempeng KLT pada bejana yang sudah dijenuhi fase
gerak dengan hati-hati. 1 cm P S
5. Biarkan fase gerak bergerak keatas pada permukaan lempeng P : pembanding
S : sampel
hingga mencapai batas jarak rambat. Keluarkan lempeng dan
keringkan.
6. Amati bercak sesuai petunjuk. Jika terdapat lebih dari satu metode deteksi, lakukan secara
berurutan. dengan sinar tampak, sinar ultra violet gelombang pendek (254 nm) kemudian
dengan ultraviolet gelombang panjang (365 nm) dan bila perlu gunakan pereaksi penampak
bercak (baca cara deteksi untuk masing-masing sampel). Hitunglah harga Rf dari bercak-
bercak senyawa hasil pemisahan dan bandingkan dengan senyawa pembanding. Jika
senyawa belum terdeteksi atau belum diperoleh pemisahan yang baik, lakukan analisis KLT
ulang dengan fase gerak yang berbeda. Pisahkan komponen-komonen senyawa dalam
sampel secara KLT, hitung harga Rf dan amati visualisasi bercak senyawa dengan detektor
yang telah ditentukan (dokumetasikan hasilnya dengan foto). Tabulasikan datanya di tabel
seperti dibawah ini (masuk laporan sementara)

10
 B. Senyawa Bahan Alam dari Jalur Asetat-Malonat
Jalur asetat-malonat menghasilkan senyawa-senyawa yang terbentuk dari unit-unit asetat
(C2) yang terbagi lagi menjadi dua macam, yaitu asam-asam lemak (palmitat, oleat, laurat, dll) dan
poliketida. Berikut ini dikenalkan senyawa-senyawa golongan poliketida

1. Kromatografi Lapis Tipis

a) Aloin
Bahan yang diperiksa Getah Aloe vera atau jadam arab

Kandungan yang diperiksa Aloin

Fase diam Silica gel F254

Fase gerak Etil asetat – metanol – air (100:17:13)

Deteksi 1. UV365 nm
2. KOH etanolik 10% visibel dan UV365 nm, aloin
berfluoresensi kuning kecoklatan di Rf ~0,5 sedangkan
antron berada di atas

Larutan percobaan satu gram serbuk simplisia diekstraksi dengan 10 mL

metanol dan dipanasi di waterbath selama 5 menit,
saring. Bagi dua filtrat. Satu bagian diuapkan hingga
tinggal ½ volume (SA). Satu bagian dihidrolisis dengan cara
seperti di cara kerja KLT no 2 (SB).
Pembanding antron 5 mg dilarutkan dalam 5mL etanol (P).
Masing-masing ditotolkan 5 µL

b) Emodin
Bahan yang diperiksa Rhei radix

Kandungan yang diperiksa emodin

Fase diam Silica gel F254

Fase gerak Toluen – etil asetat – metanol (5:1,5:3,5 v/v)

Deteksi 1. UV365 nm berwarna kuning terang

2. uap amonia berwarna merah
3. KOH etanolik 10% visibel dan UV365 nm
Emodin muncul di Rf ~0,7

11
 Larutan percobaan satu gram serbuk simplisia diekstraksi dengan 10 mL
metanol dan dipanasi di waterbath selama 5 menit,
saring. Bagi dua filtrat. Satu bagian diuapkan hingga
tinggal ½ volume (SA). Satu bagian dihidrolisis dengan cara
seperti di cara kerja KLT no 2 (SB).
Pembanding antron 5 mg dilarutkan dalam 5mL etanol.
ditotolkan 5 µL (P)

C. Senyawa Bahan Alam dari Jalur Asetat-Mevalonat

Jalur asetat-mevalonat menghasilkan senyawa dengan building block isopren sehingga
beberapa buku menyebutnya isoprenoid tetapi lebih sering disebut sebagai golongan terpenoid.

1. Kromatografi Lapis Tipis

a) Thymol dan Mentol
Bahan yang diperiksa Herba thymi (Thymus vulgaris), daun oregano (Origanum
vulgare) dan Daun mint (Mentha piperita)

Kandungan yang diperiksa Timol dan mentol

Fase diam Silica gel

Fase gerak toluen – etil asetat (93:7 v/v)

Deteksi vanilin – asam sulfat dan dipanaskan 110°C selama 5

menit; mentol berwarna biru Rf ~0,2; timol berwarna
merah violet Rf ~0,5

Larutan percobaan 1 gram serbuk simplisia herba thymi dimaserasi dengan 5

mL diklorometan selama 5 menit, ditotolkan 10 µL (SA)
1 gram serbuk simplisia daun mint dimaserasi dengan 5
mL diklorometan selama 5 menit, ditotolkan 10 µL (SB)
5 mg mentol dan 5 mg timol masing-masing dilarutkan
dalam 5 mL toluen. Totolkan masing-masing 2 µL pada
titik yang sama (P)

b) Sineol
Bahan yang diperiksa Minyak kayu putih, daun kayu putih, bunga cepliksari

Kandungan yang diperiksa Sineol

Fase diam Silica gel

Fase gerak toluen – etil asetat (93:7 v/v)

12
Deteksi vanilin – asam sulfat dan dipanaskan 110°C selama 5
menit; mentol berwarna biru Rf ~0,2; timol berwarna
merah violet Rf ~0,5; sineol diantara kedua pembanding
Rf ~0,4 warna biru orange

Larutan percobaan Dua gram serbuk simplisia dimaserasi dengan 5 mL n-

heksan, penotolan 10 µL
50 µL sineol dilarutkan dalam 5 mL toluen. Penotolan 2
µL

c) Geraniol dan sitronellal

Bahan yang diperiksa Minyak sereh dan ekstrak n-heksan sereh

Kandungan yang diperiksa Geraniol dan sitronellal

Fase diam Silica gel

Fase gerak n-heksana – etil asetat (93:7 v/v)

Deteksi anisaldehid – asam sulfat dan dipanaskan 110°C selama 5

menit;
geraniol berwarna biru-violet Rf ~0,1; sitronelal berwarna
violet Rf ~0,5;

Larutan percobaan Dua gram serbuk simplisia dimaserasi dengan 5 mL n-

heksan totolkan 10 µL (SA)
50 µL minyak sereh dilarutkan dalam 3 mL toluen.
Totolkan 2 µL (SB)
Pembanding geraniol dan sitronelal ditotolkan sebanyak 2
µL pada titik yang sama. (P)

d) Steroid
Bahan yang diperiksa Rhizoma Pacing (Costus specious), Purwoceng (Pimpinella
pruatjan)

Kandungan yang diperiksa stigmasterol

Fase diam Silica gel

Fase gerak n-heksana – etil asetat (4:1 v/v)

Deteksi anisaldehid – asam sulfat dan dipanaskan 110°C selama 5

menit; stigmasterol terdeteksi di pertengahan dengan
warna ungu

13
 Larutan percobaan Dua gram serbuk simplisia dimaserasi dengan 5 mL n-
heksan atau 10 µL
5 mg mentol dan 10 mL toluen.
Penotolan 2 µL

D. Senyawa Bahan Alam dari Jalur Sikimat

Jalur sikimat menghasilkan beragam senyawa-senyawa organik sederhana seperti asam galat
dan asam salisilat. Kelanjutan dari jalur ini adalah sikimat-korismat yang menghasilkan senyawa
turunan fenilpropan seperti fenilpropanoid sederhana (asam sinamat, sinamaldehid, sinamil alkohol
dll), serta senyawa-senyawa yang lebih kompleks seperti: kumarin, lignan, lignin.

Selain itu terdapat pula jalur kombinasi antara sikimat-korismat dan poliketida, yaitu
fenilpropan dengan penambahan unit-unit asetat (gingerol), kurkuminoid, stilben, stirilpiron,
flavonoid.

1. Kromatografi Lapis Tipis

a) Fenilpropanoid
(1) Skopoletin
Bahan yang diperiksa Buah mengkudu (Morinda citrifolia)

Kandungan yang diperiksa Skopoletin (turunan kumarin)

Fase diam Silica gel F254

Fase gerak Diklorometan – metanol (19:1 v/v)

Deteksi Skopoletin dibawah UV 365nm di Rf sekitar 0,7 berpendar

biru terang; deteksi di UV 254nm dan pereaksi KOH-
etanolik (sinar tampak)

Larutan percobaan Larutan uji: 100 mg serbuk kering buah mengkudu di

ekstrak dengan 5 mL metanol, totolkan 5 mikroliter
pembanding: skopoletin 5 mg dilarutkan dalam 5 mL
metanol. Ditotolkan 2 µL

14
 b) Jalur kombinasi fenilpropan dengan poliketida
(1) Gingerol
Bahan yang diperiksa Rimpang jahe

Kandungan yang diperiksa Gingerol, shogaol

Fase diam Silica gel F254

Fase gerak n-heksan-eter(40:60)

Deteksi  UV λ 254 & 365nm,

 vanilin-asam sulfat
bercak gingerol muncul sebagai bercak ganda di
Rf ~0,38 sedangkan vanilin muncul bercak di Rf
~0,5

Larutan percobaan Sampel: Satu gram rimpang jahe Zingiber officinale

diekstrak dengan kloroform 25 mL. Ekstrak ditepatkan
volumenya 25 mL. Totolkan 10 µL di pelat KLT
gingerol (campuran) 5 mg/mL dan vanilin 5 mg/5mL
masing-masing penotolan 5 µL

(2) Kurkuminoid
Bahan yang diperiksa Curcuma xanthorizza atau Curcuma domestica

Kandungan yang diperiksa Kurkuminoid

Fase diam Silica gel F254

Fase gerak kloroform : metanol (98:2 v/v)

Deteksi  Sinar tampak berwarna kuning

 UV 254,
 UV365 kuning menyala
Bercak kurkumin, demetoksikurkumin dan
bisdemetoksi kurkumin berurutan di Rf sekitar
0,8; 0,6 dan 0,5

Larutan percobaan 2 L larutan isolat dalam metanol dan larutan

pembanding kurkuminoid 1%

(3) Flavonoid
Bahan yang diperiksa daun ketela pohon

Kandungan yang diperiksa Rutin

Fase diam Silika gel F254

15
 Fase gerak Etil asetat:asam formiat:asam asetat glasial:air
(100:11:11:22 v/v)

Deteksi sinar tampak, UV254, UV365

semprot dengan sitroborat amati dibawah sinar tampak
dan UV365
rutin muncul di Rf ~0,8

Larutan percobaan 0,5 g serbuk simplisia diekstraksi dengan 5 mL metanol

80% selama 5 menit di tangas air diaduk-aduk.
2 mg rutin dilarutkan dalam 10 mL metanol. Penotolan 2
µL

E. Senyawa Bahan Alam dari Alkaloid

Alkaloid adalah senyawa nitrogen biasanya terdapat dalam tumbuh-tumbuhan kebanyakan
bersifat basis dan serig mempunyai aksi farmakologi tertentu. Alkaloid terdapat pada tumbuhan
familia terteniu misalnyaz Leguminosae, Papaveraceae, Ranuncuiaceae, Rubiaceae, Solanaceae, dan
Berbiridaceae. Berdasarkan strukur kimisnya alkaloid dapat digolongkan sebagai:

1. Gol. Piridina, misalnya arekolina (Areca catechu), nikotina (Nicotiana tabacum)

2. Gol. Tropan, misalnya hiosiamin, skopolamin (Atropabel/adona, Hyoscyamus niger, Datura
stramonium)
3. Gol. Kinolin, misalnya kinin dan kinidin (Cinchona succirubra)
4. Gol. Iso-kinolin, misainya hidrastin (Hydrastis canadensis), emetin (Cephaelis ipecacuanhae),
morfin dan kodein (Papaver somniferum)
5. Gol. lndol, misalnya ergotamine (Secale cornutum), strichnin dan brusina (Strychnos nux
vomica), reserpin (Rauwoltia serpentine)
6. Gol. Amina, misalnya efedrina (Ephedra sinica), Kolkisina (Colchicum autumnale)
7. Gol. Steroid, misalnya akonitin (Aconitum napellus)
8. Gol. Purina misalnya kofeina (Cola nitida, Coffea arabica, Camellia sinensis), teofilina
(Camellia sinensis), teobromina (Theobroma cacao)

1. Kromatografi Lapis Tipis

a) Pemerlksaan Alkaloid dengan Kromatografi Lapis Tipis
(1) Golongan Kinolin
Bahan yang diperiksa Chinae Cortex

Kandungan yang diperiksa kinina, kinidina, sinkonina, sinkonidina

16
 Fase diam Silica gel F254

Fase gerak diklorometan-dietilamina (90:10 v/v)

Deteksi UV 254 & 365 sebelum penyemprotan

Setelah pengembangan selesai, panaskan lempeng KLT
100°C selam 10 menit untuk menghilangkan sisa amina.
Setelah itu disemprot dengan asam sulfat 5% etanolik,
panaskan 105°C selama 5 menit dilihat di bawah UV-
365nm nampak bercak biru gelap Rf ~0,7; bercak biru
terang sinkonidin (0,65); kinidin (0,50); dan sinkonin (0,4)

Larutan percobaan 500 mg serbuk dibasahi dengan 5 tetes ammonia 25%

kemudian disari dengan 3 ml metanol selama 10 menit
dengan menggojok. Filtratnya dipekatkan.
Pembanding 5 mg kinidin dalam 5 mL metanol. Totolkan
5-10 µL.

(2) Golongan Xantin

Bahan yang diperiksa Theae Folium, Cacao Semen

Kandungan yang diperiksa Kafeina, teobromin

Fase diam Silica gel F254

Fase gerak Kloroform - aseton (50:50 v/v) Pavlik

Deteksi a. UV-254 nm (pemadaman fluoresensi), UV365 nm

b. Uapi dengan iod, akan timbul bercak barwarna coklat
gelap. Masukkan kromatogram ke dalam wadah berisi
sedikit kristal I2, diamkan hingga bercak kafein berubah
warna. Bercak kafein muncul di Rf sekitar 0,5.

Larutan percobaan 1 g serbuk diekstraksi dengan 10 metanol dengan bantuan

pemanasan waterbad selama 5 menit, saring pekatkan
hingga tinggal separuh, totolkan 10 µL
5 mg kofeina, 3 mg teobromina, dilarutkan dalam 5 mL
kloroform metanol (60:40 v/v). Totolkan 10µL.

(3) Golongan lndol

Strichnin

Bahan yang diperiksa Strychni semen, Rauwolfia radix

Kandungan sampel Strichnin

17
 Fase diam Silica gel F254

Fase gerak Toluena-etil asetat-dietilamina (70:20:10 v/v)

Deteksi Diamati di bawah sinar UV 254 nm dan 365 nm

Disemprot dengan pereaksi Dragendorff, dilanjutkan
dengan NaNO2

Cara kerja 500 mg serbuk dicampur dengan 1 ml larutan ammonia

10% atau larutan Na2CO3 10% kemudian disari dengan
metanol selama 5 menit pada susu 60°C (diatas penangas
air) sambil digojog. Setelah dingin disari kemudian
dipekatkan.

reserpin

Bahan yang diperiksa Rauwolfia radix

Kandungan yang diperiksa Reserpin

Fase diam Silica gel F254

Fase gerak Diklorometan – metanol (8:2 v/v)

Deteksi 1. UV365 nm warna biru turki

2. Dragendorff

Larutan percobaan 1 gram diekstraksi dengan 5 mL metanol dan dipanasi di

tangas air selama 5 menit.
Reserpin 1 mg/5mL metanol.
Masing-masing ditotolkan 2 µL

(4) Golongan Tropan

Bahan yang diperiksa Atropa belladona, Hyoscyamus niger, Datura stramonium

Kandungan sampel Atropin, skopolamin

Fase diam Silica gel F254

Fase gerak Toluena-etil asetat-dietilamina (70:20:10 v/v)

Deteksi Diamati di bawah sinar UV 254 nm.

Disemprot dengan pereaksi Dragendorff, dllanjutkan
dengan NaNO2

Larutan percobaan 200 mg serbuk dicampur dengan 1 ml larutan ammonia

10% atau larutan Na2CO3 10% kemudian disari dengan
metanol selama 5 menit pada susu 60°C ( diatas penangas

18
 air) sambil digojog. Setelah dingin disari kemudian
dipekatkan.

(5) Golongan Piridin

Bahan yang diperiksa Tembakau (Nicotiana tabacum)

Kandungan yang diperiksa Nikotin

Fase diam Silica gel F254

Fase gerak etil asetat - metanol – ammonia pekat - air (80:25:0,2:15,8

v/v/v/v) (Hosu & Cimpoiu, 2015)

Deteksi 1. UV254 nm
2. Dragendorff

Larutan percobaan Cara ekstraksi: 1 g serbuk simplisia dicampur dengan 1 mL

ammonia 10% kemudian diekstraksi dengan 5 mL metanol
di dalam waterbath selama 5 menit. Saring dan pekatkan
hingga separuhnya.
5 mg asam nikotinat dilarutkan dalam etil asetat 5 mL.
Penotolan 5µL.

19
 V. PEMISAHAN BAHAN ALAM

Praktikan ditargetkan di akhir praktikum mendapatkan satu isolat yang mendekati murni
sehingga dapat digunakan untuk analisis kadar. Praktikum ini merupakan satu contoh sederhana
proses pemisahan bahan alam yang jauh dari sempurna. Pemisahan dilakukan dalam dua Tahap yaitu
tahap pertama fraksinasi dengan KCV dan tahap kedua pemurnian dengan KLT Preparatif.

A. Kromatografi Cair Vakum

Tahap pertama pemisahan adalah fraksinasi kasar menggunakan KCV. Serbuk sampel
diekstraksi dengan cara maserasi dan kemudian dipisahkan dengan KCV.

1. Alat dan Bahan

a) Bahan
1. Serbuk sampel
2. Metanol 95%
3. Kloroform
4. Heksana
5. Etil asetat
6. Silika gel untuk KLT preparatif tanpa gipsum
b) Alat
1. Erlenmeyer bertutup 250 ml 1 buah
2. Labu Erlenmeyer 250 ml 1 buah
3. Cawan porselin 1 buah
4. Perangkat penangas air 1 unit
5. Kolom kromatografi cair vakum

2. Cara kerja
1. Serbuk sampel (10 gram) dimasukkan kedalam labu Erlenmeyer 250 ml ditambahkan 100 ml
campuran pelarut metanol, kemudian digojog kuat setiap 10 menit selama 1 jam dan
disaring.
2. Filtrat yang diperoleh diuapkan cawan porselin diatas penangas air, hingga volume 10 ml.
Ambil 200 µL cuplikan (Cuplikan 1) untuk KLT simpan di plastic tube dan disimpan.
3. Tambahkan ke dalam sisanya 1 gram serbuk silica gel. Uapkan hingga kering.
4. Persiapkan kolom KCV. Masukkan silika TLC grade tanpa gipsum secara packing kering hingga
diperoleh ketinggian silika ~4 cm padatkan dengan bantuan pompa vakum.
5. Masukkan ekstrak kering di atas permukaan silika KCV dan padatkan dengan bantuan vakum.
Letakkan diatasnya segumpal kapas

20
 6. Masukkan berturut-turut fase gerak sebagai berikut:
Fraksi Pelarut Komposisi Volume (mL)
1 Heksana 100 50
2 heksana-etil asetat 50:50 50
3 etil asetat 100 50
4 etil asetat-metanol 60:40 50
5 etil asetat-metanol 40:60 50
6 Metanol 100 50
7. Setiap kali ditampung fraksi sebanyak 50 ml, pekatkan dalam cawan porselen di atas tangas
air.
8. Terhadap setiap fraksi dilakukan KLT dengan sistem dan deteksi yang sesuai

B. Kromatografi Lapis Tipis Preparatif

Fraksi yang memilik senyawa yang dituju hasil dari tahap pertama (KCV), dimurnikan
menggunakan KLT preparatik. Ekstrak dilarutkan dengan kadar 1 mg/mL dalam pelarut yang cocok.
Totolkan berbentuk pita atau spot rapat memanjang. Keringkan hasil penotolan dengan aliran udara
hangat. Selanjutnya elusi dengan fase gerak yang cocok (lihat Praktikum III)

21
 VI. ANALISIS KUANTITATIF BAHAN ALAM

A. Spektrofotometri Ultraviolet Visibel

1. Flavonoid Total
Ambil larutan uji sejumlah 500µL dan ditambah metanol 1,5 mL pada tabung reaksi, kemudian
ditambahkan pereaksi yang terdiri dari 0,1 ml AlCl3 10%; 0,1 ml Na-asetat; 2,8 ml air suling, larutan
dicampur hingga homogen dan diinkubasi pada suhu kamar selama 30 menit. Selanjutnya larutan diukur
serapannya pada alat spektrofotometer UV-Vis 415 nm dengan menggunakan larutan blanko larutan uji
B1 diperlakukan sama seperti diatas tanpa penambahan AlCl3. Pengukuran dilakukan tiga kali, kadar
dihitung sebagai rata-rata. Kandungan flavonoid total dinyatakan dengan kesetaraan pembanding
kuersetin. Pembuatan kurva kalibrasi dilakukan menggunakan pembanding kuersetin. Kuersetin baku
ditimbang seksama 10 mg dan dilarutkan dengan metanol dalam labu takar bersumbat 10 ml dan
diencerkan hingga garis batas. Larutan tersebut digunakan sebagai larutan induk yang selanjutnya dipipet
dan diencerkan dengan metanol sehingga diperoleh minimal 6 konsentrasi yang berbeda. Tiap-tiap
konsentrasi dipipet 2 ml, kemudian ditambahkan pereaksi 0,1 ml AlCl3 10%, 0,1 ml Na-asetat, 2,8 ml air
suling, larutan dicampur hingga homogen dan diinkubasi pada suhu kamar selama 30 menit. larutan diukur
serapannya pada alat spektrofotometer UV-Vis 415 nm dengan menggunakan larutan blanko tanpa
kuersetin dan AlCl3.

2. Penetapan Kadar Total Fenolik dan Tannin

Penetapan kadar total fenolik dan tannin dapat dilakukan secara paralel dengan metode Folin-
Ciaoucalteau untuk kadar fenolik (2b) dan bersama dengan reaksi ikatan protein untuk kadar total
tanin (2b-2c), secara spektrofotometri.

a) Penyiapan cuplikan
1. Timbang 500 mg serbuk sampel diekstraksi dengan 25 mL metanol 80% dengan bantuan
pemanasan sedang selama 30 menit. Saring dan sesuaikan volume hingga 50 mL, sehingga
didapatkan ekstrak dengan kadar 50 mg serbuk/mL atau setara dengan 5 mg ekstrak / mL
metanol 80%.
2. Saring ekstrak dan tepatkan volumenya hingga 20 mL.
3. Gunakan sebagai larutan uji penetapan kadar di b da c di bawah ini.
b) Penetapan kadar Fenolik Metode Folin-Ciocalteu
1. 100 L larutan uji di masukkan dalam tabung 12 mL ditambah 7,9 mL air.
2. campuran ini divortex selama 20-30 detik,
3. kemudian tambahkan 500 L reagen FC, catat waktu sebagai waktu ke 0.

22
4. vortex kembali selama 20-30 detik,
5. setelah 1 menit pendiaman tambahkan 1,5 mL larutan Natrium karbonat 20% (sudah
disaring).
6. diamkan selama ± 30 menit di suhu kamar dari waktu ke 0,
7. larutan berwarna yang terbentuk di ukur pada maks 765 nm.
8. lakukan hal yang sama terhadap larutan baku asam galat.
9. Kadar fenol total dihitung sebagai ekuivalen mg asam galat per gram sampel

c) Penetapan kadar residual fenolik

1. Kedalam 2,5 mL ditambahkan 500 mg serbuk kasein dan 7,5 mL air, vorteks selama 5 menit
sentrifus selama 2 menit.
2. Ambil supernatan dan lakukan analisis kadar fenolik total metode Folin Ciocalteau di atas.
3. Kadar tannin diperoleh dari selisih kadar fenol hasil penetapan 2b dan 2c (2b-2c).

3. Total Alkaloid
a) Penyiapan larutan brom kresol hijau
1. Timbang 69,8 mg brom kresol hijau (BCG = Brom Creosol Green)
2. Tambahkan 3 mL NaOH 2N dan 5 mL akuades, larutkan dengan bantuan pemanasan
3. Encerkan larutan dengan akuades hingga 1000 mL.
b) Penyiapan larutan buffer fosfat
1. Timbang 71,6 g Na2HPO4 larutkan dalam 1 L air.
2. Sesuaikan ke pH 4,7 dengan menambahkan asam sitrat 0,2 M (42,02 g asam sitrat dalam 1 L
air)
c) Penyiapan cuplikan
1. Sejumlah 500 mg ekstrak di larutkan dalam HCl 2N dan disaring
2. Satu mL filtrat dimasukkan corong pisah dan dicuci dengan 10 mL kloroform (3 kali)
3. Larutan di netralkan dengan NaOH 0,1N.
4. Bagi ekstrak menjadi 2 bagian sama banyak (10 mL).
5. Tambahkan 5 mL Brom kresol hijau dan 5 mL buffer fosfat
6. Gojog campuran no 5 dan kompleks yang terbentuk di ekstrak dengan kloroform 1, 2, 3, dan
4 mL klorofom. Gabungkan fraksi kloroform di labu takar 10 mL, tepatkan volume hingga 10
mL.
7. Ukur absorbansi pada  470 nm terhadap blanko pelarut yang diperlakukan sama seperti
diatas
d) Penyiapan kurva baku
1. Timbang 1 mg kafein dan larutkan dalam 10 mL etanol

23
 2. Buat seri pengenceran dengan mengambil 0,4; 0,6; 0,8; 1; dan 1,2 mL larutan kafein ke
tabung yang berbeda
3. Tambahkan masing-masing 5 mL buffer fosfat dan 5 mL BCG
4. Gojog campuran diatas dan kompleks yang terbentuk di ekstrak dengan kloroform 1, 2, 3,
dan 4 mL klorofom. Gabungkan fraksi kloroform di labu takar 10 mL, tepatkan volume hingga
10 mL.
5. Ukur absorbansi pada  470 nm terhadap blanko tanpa kafein yang diperlakukan sama
seperti diatas.

4. Penetapan Terpenoid Total

1. Sejumlah 50mg ekstrak dilarutkan dalam 3,5 mL metanol.
2. Ambil 200µL larutan sampel dan tambahkan 1,5 mL kloroform.
3. Buat larutan baku pembanding setara dengan 100mg/200µL, buat seri pengenceran baku
pembanding.
4. Vorteks hingga bercampur sempurna, diamkan selama 3 menit.
5. Tambahkan 100 µL H2SO4 pekat (dinginkan jika timbul panas)
6. Inkubasi selama 1,5-2 jam ditempat gelap (Standar linalool hanya membutuhkan inkubasi 5
menit) hingga terjadi presipitasi coklat gelap.
7. Dekantir secara hati-hati seluruh supernatan
8. Tambahkan 1,5 mL metanol 95% dan vorteks hingga seluruh presipitat larut.
9.
metanol.
10. Hitung kadar terpenoid total terhadap pembanding linalool.

B. Kromatografi Lapis Tipis Densitometri

Gunakan sistem kromatografi lapis tipis sesuai dengan studi pustaka dan diskusi dengan dosen
penguji. Timbang ekstrak dan larutkan dalam pelarut yang cocok hingga diperoleh kadar ekstrak setara
dengan 10mg/mL.

C. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Gunakan metode pemisahan sesuai dengan pustaka yang ditemukan dan diskusi dengan
penguji. Timbang ekstrak dan larutkan dalam pelarut yang cocok hingga diperoleh kadar ekstrak setara
dengan 1mg/5mL.

24