MAKALAH ILMIAH

SITOHISTOTEKNOLOGI

TEKNIK HISTOLOGI

OLEH:

NAMA : ASTI ARINI

NIM : P00341017055

TINGKAT : IIB

KEMENTRIAN KESEHATAN REPUBLIK INDONESIA

POLITEKNIK KESEHATAN KENDARI
JURUSAN ANALIS KESEHATAN
2019
 KATA PENGANTAR

Puji syukur saya panjatkan kepada Allah Yang Maha Pengasih Dan
Penyayang, karena atas berkat rahmat dan karunia-Nya sehingga saya dapat
menyelesaikan Makalah Ilmiah Sitohistoteknologi ini tepat pada waktunya.
Makalah ini dimaksudkan untuk memenuhi tugas dari dosen pengampuh mata
kuliah Sitohistoteknologi Bapak Rolly Iswanto S,ST.M.Si

Dalam proses penyusunannya tak lepas dari bantuan, arahan dan masukan
dari berbagai pihak. Untuk itu penyusun mengucapkan banyak terima kasih atas
segala partisipasinya dalam menyelesaikan makalah ini.

Penyusun menyadari Makalah ini jauh dari sempurna, sehingga kritik dan
saran membangun sangat penulis harapkan dari berbagai pihak untuk
kesempurnaan makalah ini.

Demikian apa yang dapat saya sampaikan. Semoga makalah ini dapat
bermanfaat untuk masyarakat umumnya, dan untuk saya sendiri khususnya.

Kendari, 22 Januari 2019

Penyusun

i
 DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR .................................................................................... i

DAFTAR ISI .................................................................................................. ii
BAB I PENDAHULUAN
1.1.Latar Belakang ............................................................................... 1-2
1.2.Rumusan Masalah ............................................................................. 2
1.3.Tujuan Makalah ................................................................................ 2
BAB II PEMBAHASAN
2.1. Mikroskop Cahaya (light microscopy)........................................ 3-12
2.2. Fiksasi Jaringan (fiksation of tissue) ......................................... 12-22
2.3. Pemrosesan Jaringan (tissue processing) .................................. 22-35
2.4. Mikrotom (microtomy).............................................................. 35-45
2.5. Pewarnaan Histologi (how histological stains works) .............. 45-54
BAB III PENUTUP
3.1. Kesimpulan .................................................................................... 55
3.2. Saran .............................................................................................. 55
DAFTAR PUSTAKA .................................................................................. 56

ii
 BAB I
PENDAHULUAN

1.1.Latar Belakang
Kata Histologi berasal dari bahasa Yunani yaitu Histo yang berarti
jaringan dan Logos yang berarti ilmu. Histologi adalah ilmu yang
mempelajari tentang sel dan matriks ekstraseluler dari jaringan.
Jaringan dibentuk oleh dua komponen yang saling berinteraksi yaitu
sel dan matriks ekstrasel. Matriks ekstrasel terdiri atas banyak jenis
molekul, dan kebanyakan diantaranya sangat rumit dan membentuk struktur
kompleks, seperti serabut dan membran basal. Fungsi matriks ekstrasel ini
adalah sebagai penunjang mekanis bagi sel- sel, mengangkut nutrien ke sel-
sel, dan membawa katabolit dan produk sekresi. Walaupun menghasilkan
matriks ekstrasel, sel tersebut dipengaruhi dan kadang diatur oleh molekul-
molekul matriks. Sehingga terdapat semacam interaksi intensif antara sel-
sel dan matriks.
Setiap jaringan dibentuk oleh beberapa jenis sel dan secara khas oleh
asosiasi sel dan matriks ekstrasel yang spesifik. Asosiasi yang khas ini akan
mempermudah pengenalan sejumlah besar subtipe jaringan. Kebanyakan
organ dibentuk oleh kombinasi beberapa jenis jaringan, kecuali susunan
saraf pusat, yang hampir seluruhnya terdiri atas jaringan saraf. Kombinasi
yang tepat dari jaringan- jaringan tersebut memungkinkan berfungsinya
setiap organ dan organisme secara keseluruhan.
Histologi mempelajari jaringan penyusun tubuh, kimia jaringan dan
sel dipelajari dengan metode analitik mikroskopik dan kimia. Zat- zat kimia
di dalam jaringan dan sel dapat dikenali dengan reaksi kimia yang
menghasilkan senyawa berwarna tak dapat larut, diamati dengan mikroskop
cahaya atau penghamburan elektron oleh presipitat yang dapat diamati
menggunakan mikroskop elektron. Disamping reaksi kimia yang terjadi
dalam jaringan, metode lain misalnya metode fisis sering digunakan,
misalnya mikroskop interferensi yang memungkinkan penentuan massa sel

1
 atau jaringan dan mikroskop spektrofotometri yang memungkinkan
penentuan jumlah DNA dan RNA di dalam sel.
Jaringan adalah kumpulan dari sel- sel sejenis atau berlainan jenis
termasuk matriks antar selnya yang mendukung fungsi organ atau sistem
tertentu. Meskipun sangat kompleks tubuh mamalia hanya tersusun oleh 4
jenis jaringan yaitu jaringan : epitel, penyambung/ pengikat, otot dan saraf.
Dalam tubuh jaringan ini tidak terdapat dalam satuan-satuan yang tersendiri
tetapi saling bersambungan satu dengan yang lain dalam perbandingan yang
berbeda- beda menyusun suatu organ dan sistem tubuh. Jaringan
penyambung ditandai banyaknya bahan intersel yang dihasilkan oleh sel-
selnya; jaringan otot terdiri dari sel- sel panjang yang mempunyai fungsi
khusus yaitu kontraksi dan jaringan saraf terdiri dari sel- sel dengan
prosedur panjang yang menonjol dari bahan sel dan mempunyai fungsi
khusus yaitu menerima, membangkitkan dan menhantarkan impuls saraf.

1.2.Rumusan Masalah
1. Apa yang dimaksud mikroskop cahaya ?
2. Bagaimana tahapan fiksasi jaringan ?
3. Bagaimana cara pemrosesan jaringan ?
4. Bagaimana proses penggunaan mikrotom ?
5. Bagaiamana proses pewarnaan jaringan ?

1.3.Tujuan Makalah
1. Untuk mengetahui tentang mikroskop cahaya
2. Untuk mengetahui tahapan fiksasi jaringan
3. Untuk mengetahui cara pemrosesan jaringan
4. Untuk mengetahui proses penggunaan mikrotom
5. Untuk mengetahui proses pewarnaan jaringan

2
 BAB II
PEMBAHASAN

2.1. Mikroskop Cahaya (light microscopy)

a) Cahaya dan Sifat-Sifatnya

Cahaya tampak adalah bagian dari spektrum elektromagnetik yang

dapat dideteksi oleh mata manusia. Dalam teks fisika, kisaran ini
umumnya didefinisikan sebagai panjang gelombang cahaya mulai dari
sekitar 400 nm (ungu tua) hingga 800 nm (merah jauh). Kebanyakan
manusia tidak dapat melihat cahaya dengan panjang gelombang jauh
melebihi 700 nm (merah tua).

(Gambar 2.1 Representasi sinar cahaya yang menunjukkan panjang

gelombang dan amplitudo.)

Cahaya yang memiliki panjang gelombang tunggal adalah

monokromatik: yaitu, warna tunggal. Kebanyakan sumber cahaya
memberikan campuran cahaya yang kompleks dengan panjang gelombang
yang berbeda, dan ketika campuran ini mendekati campuran cahaya yang
berasal dari matahari, kita menganggap ini sebagai cahaya 'putih'. Menurut
definisi, cahaya putih adalah campuran cahaya yang mengandung
beberapa persentase panjang gelombang dari semua bagian spektrum
elektromagnetik yang terlihat. Salah satu ukuran campuran cahaya yang
dilepaskan oleh sumber cahaya adalah suhu warna. Secara praktis,

3
 semakin tinggi suhu warna, semakin dekat cahaya ke siang hari alami yang
berasal dari matahari. Sinar matahari alami dari matahari umumnya
dinyatakan memiliki suhu warna sekitar 5.200 kelvin (K). Lampu pijar,
dari lampu tungsten, memiliki suhu warna sekitar 3200K. Sebagai aturan
umum, semakin tinggi suhu warnanya, semakin 'biru' atau putih cahaya
tampak di mata. Suhu warna yang lebih rendah tampak lebih merah ke
kuning, dan dianggap sebagai warna yang 'lebih hangat'.

(Gambar 2.2 Amplitudo (yaitu kecerahan) berkurang ketika cahaya

semakin jauh dari sumber karena penyerapan ke dalam
media yang dilaluinya.)

Sumber cahaya memancarkan cahaya ke segala arah, dan sebagian

besar sumber cahaya terdiri dari campuran panjang gelombang yang
kompleks. Campuran panjang gelombang inilah yang menentukan suhu
warna sumber cahaya. Sifat lain dari cahaya yang penting untuk
memahami optik mikroskop adalah penyerapan sebagian cahaya oleh
medium yang dilalui oleh cahaya (Gbr. 3.2). Ini dilihat sebagai
pengurangan amplitudo, atau tingkat energi, dari cahaya. Media yang
melaluinya cahaya juga dapat memiliki efek pada kecepatan aktual di
mana cahaya melewati material, dan ini disebut sebagai retardasi.

b) Retardasi dan refraksi

Media di mana cahaya dapat melewati akan memperlambat

kecepatan cahaya sebanding dengan kepadatan media. Semakin tinggi
kepadatan, semakin besar tingkat keterbelakangan. Sinar cahaya yang
memasuki selembar kaca pada sudut kanan terhambat dalam kecepatan

4
 tetapi arahnya tidak berubah. Jika cahaya memasuki kaca di sudut lain,
penyimpangan arah akan terjadi selain keterbelakangan, dan ini disebut
refraksi. Lensa lengkung akan menunjukkan retardasi dan refraksi diatur
oleh:

1) sudut di mana cahaya mengenai lensa - sudut datangnya,

2) kerapatan kaca - indeks biasnya, dan

3) kelengkungan lensa.

Sudut di mana sinar menyimpang di dalam gelas atau media

transparan lainnya disebut sinar yang lewat dari satu media ke media lain,
tegak lurus dengan antarmuka, diperlambat pada saat yang sama. Sinar
lewat pada sudut lain apa pun ke antarmuka diperlambat dalam urutan
yang melintasi antarmuka dan menyimpang. Sinar yang melewati lensa
melengkung menunjukkan retardasi dan refraksi.

c) Pembentukan Gambar

1. Sinar paralel yang memasuki lensa sederhana disatukan oleh

pembiasan ke satu titik, 'fokus utama' atau titik fokus, di mana gambar
yang jelas akan terbentuk dari suatu objek.

2. Jarak antara pusat optik lensa dan fokus utama adalah panjang fokus.
Selain fokus utama, sebuah lensa juga memiliki pasangan titik lain,
satu di kedua sisi lensa, yang disebut fokus konjugat, sehingga objek
yang ditempatkan pada satu akan membentuk gambar yang jelas pada
layar yang ditempatkan di sisi lainnya.

3. Fokus konjugasi bervariasi dalam posisi, dan ketika objek bergerak

lebih dekat lensa gambar akan dibentuk lebih jauh, pada perbesaran
yang lebih besar, dan terbalik. Ini adalah 'gambar asli' dan yang
dibentuk oleh lensa objektif mikroskop.

5
 4. Jika objek ditempatkan belum lebih dekat lensa, dalam fokus utama,
gambar dibentuk pada sisi yang sama dengan objek, diperbesar, naik
ke atas.

5. Sebuah gambar virtual dilihat melalui lensa. tampaknya berada di sisi

objek lensa.

6. Pembentukan kedua gambar dalam mikroskop senyawa tegak, seperti

yang biasa digunakan dalam histopatologi.

(gambar 2.3 sebuah gambar virtual dilihat melalui lensa. tampaknya

berada di sisi objek lensa.)

d) Kualitas Gambar

Cahaya putih terdiri dari semua warna spektral dan, saat melewati
lensa sederhana, setiap panjang gelombang akan dibiaskan ke tingkat yang
berbeda, dengan warna biru dibawa ke fokus yang lebih pendek daripada
merah. Lensa ini adalah chromatic aberration dan menghasilkan gambar
tidak terpotong dengan pinggiran berwarna. Dimungkinkan untuk
membuat lensa majemuk dari elemen kaca yang berbeda untuk
memperbaiki kesalahan ini. Akromat dikoreksi untuk dua warna, biru dan
merah, menghasilkan spektrum sekunder kuning / hijau, yang pada
gilirannya dapat dikoreksi dengan menambahkan lebih banyak komponen
lensa - apochromat yang lebih mahal. Tujuan mikroskopik dari tipe
akromatik dan apokromatik biasanya dikoreksi berlebihan untuk aberasi

6
 kromatik longitudinal dan harus dikombinasikan dengan eyepieces
kompensasi yang cocok untuk membentuk gambar berkualitas baik.

Pembatasan perubahan kombinasi lensa ini diatasi dengan

menggunakan optik chromatic, aberration-free (CF), yang mengoreksi
kromatik longitudinal dan lateral serta menghilangkan semua pinggiran
warna, yang sangat berguna untuk mikroskop fluoresensi dan interferensi.
Distorsi lain dalam gambar mungkin karena koma, astigmatisme,
kelengkungan bidang, dan penyimpangan bola, dan karena bentuk dan
kualitas lensa. Aberasi bola disebabkan ketika sinar cahaya yang masuk ke
lensa melengkung di pinggirannya dibiaskan lebih dari sinar yang masuk
ke tengah lensa dan karenanya tidak dibawa ke fokus yang sama.
Kesalahan ini juga diperbaiki dengan membuat kombinasi elemen lensa
dari kaca yang berbeda, misalnya fluorit, dan bentuk yang berbeda.

e) Komponen-Komponen Mikroskop

1. Sumber Cahaya

Cahaya tentu saja adalah bagian penting dari sistem.

Perkembangan sumber cahaya telah berkembang dari lampu minyak ke
lampu listrik bertegangan rendah saat ini. Hal ini beroperasi melalui
transformator dan dapat disesuaikan dengan intensitas yang diperlukan.
Untuk mendapatkan perkiraan cahaya putih yang lebih seimbang, sumber
cahaya ini harus sering dioperasikan pada tingkat kecerahan yang
berlebihan. Kecerahan berlebih dikurangi hingga tingkat tampilan yang
nyaman melalui penggunaan filter kepadatan netral.

2. Kondensor

Cahaya dari lampu diarahkan ke komponen optik utama yaitu

kondensor baik secara langsung atau oleh cermin atau prisma. Fungsi
utama kondensor adalah memfokuskan atau memusatkan cahaya yang
tersedia ke bidang objek. Dalam kondisi normal, semakin banyak cahaya

7
 pada spesimen maka semakin baik resolusi gambar. Banyak mikroskop
memiliki kondensor yang mampu melakukan pengaturan vertikal, untuk
memungkinkan ketinggian atau ketebalan slide yang berbeda-beda.

Semua kondensor memiliki diafragma apertur yang dengannya

diameter sinar dapat dikontrol. Pengaturan yang benar untuk diafragma
adalah ketika bukaan numerik dari kondensor dicocokkan dengan bukaan
numerik dari tujuan yang digunakan dan penyesuaian yang diperlukan
harus dilakukan ketika mengubah dari satu tujuan ke yang lain.

(Gambar 2.4. Kondensor)

3. Meja Objek

Di atas kondensor adalah meja objek, yang merupakan platform

kaku dengan platform bukaan di mana cahaya dapat lewat. Fungsinya
untuk menahan slide dengan kuat, dan untuk memungkinkan operator
untuk memindahkannya dengan mudah dan lancar.

4. Lensa Objektif

Fungsi utamanya adalah untuk mengumpulkan jumlah cahaya

maksimum yang mungkin dari objek, menyatukannya, dan membentuk
gambar nyata yang diperbesar berkualitas tinggi.

8
5. Tubuh Tabung

Tiga bentuk utama tabung yaitu monokuler, teropong, dan

gabungan foto-binokular.

6. Lensa Mata (Okuler)

Fungsinya adalah untuk memperbesar gambar yang dibentuk oleh

tubuh tabung, dan menyajikan mata dengan gambar virtual, tampaknya di
bidang objek yang diamati.

f) Pembesaran dan penerangan

1) Nilai pembesaran

Pembesaran total adalah produk dari nilai pembesaran tujuan

dan lensa mata, asalkan sistem standar untuk panjang tabung optik 160
mm. Rumusnya adalah:

panjang tabung optik

x perbesaran lensa mata
panjang fokus optik

2) Penerangan

Untuk gambaran dan semua bentuk khusus mikroskop yang

terbaik ialah menggunakan pencahayaan Köhler, di mana gambar
sumber cahaya difokuskan oleh kolektor lampu atau lensa lapangan di
bidang fokus kondensor subtage (pada diafragma apertur). Gambar
diafragma bidang atau lampu akan difokuskan pada bidang objek dan
pencahayaannya merata. Gambar sumber cahaya dan diafragma
apertur pada gilirannya akan difokuskan pada bidang fokus belakang
tujuan dan dapat diperiksa dengan lensa mata dilepas. Resolusi yang
buruk akan dihasilkan kecuali iluminasi terpusat sehubungan dengan
sumbu optik mikroskop.

3) Penerangan medan gelap

9
 Mikroskop medan gelap mengatasi masalah dengan mencegah
cahaya langsung memasuki bagian depan tujuan dan satu-satunya
cahaya yang dikumpulkan adalah yang dipantulkan atau difraksi oleh
struktur dalam spesimen. Ini menyebabkan spesimen muncul sebagai
gambar terang pada latar belakang gelap, kontrasnya terbalik dan
meningkat. Medan gelap memungkinkan pendeteksian partikel yang
lebih kecil dari resolusi optik yang akan diperoleh pada medan terang,
karena kontras tinggi dari cahaya yang tersebar.

g) Fase kontras mikroskop

Spesimen biologis yang tidak terwarnai dan hidup memiliki sedikit

kontras dengan media di sekitarnya, meskipun terdapat perbedaan kecil
indeks bias (RI) dalam strukturnya. Untuk melihatnya lebih jelas
melibatkan :

1) Menutup diafragma iris kondensor, yang mengurangi bukaan

numeriknya (NA) menghasilkan efek difraksi dan menghancurkan
daya penyelesaian tujuan, atau

2) Menggunakan iluminasi medan gelap, yang meningkatkan kontras

dengan pembalikan, tetapi sering gagal mengungkapkan detail
internal.

Fase kontras mengatasi masalah ini dengan pencahayaan terkontrol

menggunakan bukaan penuh kondensor dan meningkatkan resolusi.
Semakin tinggi RI dari suatu struktur maka semakin gelap akan muncul
dengan latar belakang yang terang, yaitu dengan lebih kontras.

 Prinsip optic

Jika kisi difraksi diperiksa di bawah mikroskop, spektra

difraksi dibentuk di bidang fokus belakang (BFP) dari tujuan karena
gangguan antara sinar cahaya langsung dan difraksi. Kisi terdiri dari
strip bahan alternatif dengan RIs sedikit berbeda, di mana cahaya

10
 memperoleh perbedaan fase kecil, dan ini membentuk gambar. Sel
yang tidak bernoda mirip dengan kisi difraksi karena isinya juga
sedikit berbeda di RI. Dua sinar cahaya dari sumber yang sama
dengan frekuensi yang sama dikatakan koheren, dan ketika
digabungkan kembali mereka akan berlipat ganda dalam amplitudo
atau kecerahan jika mereka berada dalam fase satu sama lain
(gangguan konstruktif).

h) Interferensi mikroskop

Dalam mikroskop, interferensi sinar terbelakang sepenuhnya

dipisahkan dari sinar langsung atau rujukan, memungkinkan peningkatan
kontras gambar, kelulusan warna, dan pengukuran kuantitatif perubahan
fasa (atau 'perbedaan jalur optik'), indeks bias, massa sel kering
(penimbangan optik) ), dan ketebalan bagian. Setiap kali cahaya melewati
tepi benda buram, sinar yang dekat dengan tepi itu terdifraksi, atau
bengkok dari jalur normalnya. Jika, alih-alih satu sisi, sinar melewati celah
sempit, maka sinar di tepi balok akan mengembang di kedua sisi ke sudut
yang cukup lebar. Dua celah erat berdampingan membentuk dua
penggemar sinar yang akan menyeberang dan, jika koheren, akan diamati
'mengganggu'. Jika setiap sinar dianggap sebagai gelombang, dapat dilihat
bahwa kondisi fase peningkatan amplitudo dan kepunahan terikat terjadi
pada titik-titik di mana gelombang melintas dan mengganggu.

Hasil dari ini dalam mikroskop adalah serangkaian pita paralel,

bergantian terang dan gelap melintasi bidang pandang. Dengan cahaya
putih, pita warna spektral terlihat, karena panjang gelombang yang
membentuk cahaya putih terdifraksi pada sudut yang berbeda. Dengan
cahaya monokromatik, pita-pita itu bergantian gelap dan terang, dan satu
warna. Efek yang sama dapat ditunjukkan jika sinar terpisah dari cahaya
koheren disatukan kembali.

11
i) Cahaya terpolarisasi mikroskop
Penggunaan cahaya terpolarisasi dalam mikroskop memiliki
banyak aplikasi yang berguna dan diagnostik yaitu sejumlah kristal,
struktur berserat (baik alami maupun buatan), pigmen, lipid, protein,
tulang, dan endapan amiloid menunjukkan birefringence.
j) Tanda birefringence
Tanda birefringence bermanfaat secara diagnostik dan ditentukan
dengan menggunakan kompensator (pelat birefringent keterbelakangan
yang diketahui) baik di atas spesimen atau di bawah polarizer pada 45 ° ke
arah cahaya terpolarisasi. Putar kompensator atau spesimen sampai arah
lambat kompensator (ditunjukkan oleh panah) sejajar dengan sumbu
panjang kristal atau serat. Lapangan merah dan jika kristal berwarna biru
birefringence positif. Jika kristal berwarna kuning, arah lambat
kompensator sejajar dengan arah cepat kristal dan birefringence negatif.
Kuarsa dan kolagen menunjukkan birefringence positif sedangkan cakram
polaroid, kalsit, urat, dan kromosom negatif. Kompensator sederhana
dapat dibuat dari mika atau lapisan selotip.
 Fluoresensi cahaya yang ditransmisikan

Sumber cahaya :
Semua cahaya memancarkan berbagai panjang gelombang,
termasuk panjang gelombang ultraviolet dan biru pendek yang menarik
untuk fluoresensi. Hanya beberapa sumber yang memancarkan cahaya
gelombang pendek yang cukup untuk penggunaan praktis. Yang paling
umum digunakan adalah lampu gas bertekanan tinggi, seperti uap merkuri
dan lampu gas xenon. Untuk beberapa eksitasi panjang gelombang, dalam
rentang biru dan hijau misalnya, lampu filamen halogen menghasilkan
cahaya yang cukup untuk berguna. Pilihan sumber yang cocok tergantung
pada jenis pekerjaan yang akan dilakukan, dan untuk tujuan pengamatan
rutin lebih baik menggunakan pembakar uap merkuri. Ini beroperasi pada
arus bolak-balik dan peralatan awal mereka tidak begitu mahal. Pembakar

12
 xenon beroperasi pada arus searah dan membutuhkan penyearah untuk
disertakan dengan peralatan starter jika mereka akan digunakan pada
pasokan listrik normal.
Penyaringan :
Sediaan untuk fluoresensi dapat mengandung bahan fluoresensi
lain selain dari yang diminati. Karena itu perlu untuk menyaring semua
kecuali panjang gelombang eksitasi spesifik untuk menghindari
kebingungan antara fluoresensi penting dan tidak penting.
k) Perawatan mikroskop

Pastikan bahwa bagian optik bersih, dan bebas dari debu. Sidik jari
dan debu berminyak adalah musuh kaca optik. Penggunaan xylene untuk
mencuci lensa paling baik dilakukan. Alkohol dan aseton harus dihindari
karena dapat meresap melarutkan semen. Lensa sulit dibersihkan karena
bentuknya yang cekung, dan banyak orang merekomendasikan
penggunaan kapas atau tisu untuk menghilangkan kotoran.
l) Pengaturan pada mikroskop
1. Memusatkan lampu
2. Menyesuaikan kondensor
3. Memasukkan slide

2.2. Fiksasi Jaringan (fiksation of tissue)

a) Jenis fiksasi

Fiksasi jaringan dapat dilakukan dengan metode fisik dan atau

kimia. Metode fisik seperti pemanasan, gelombang mikro, dan
pengeringan beku adalah proses independen dan tidak digunakan secara
umum dalam praktik rutin patologi medis atau kedokteran hewan,
anatomi, dan histologi, kecuali untuk penggunaan fiksasi panas kering
mikroorganisme sebelum pewarnaan Gram. Sebagian besar metode fiksasi
yang digunakan dalam pemrosesan jaringan untuk diagnosis histopatologis
bergantung pada fiksasi kimia yang dilakukan oleh fiksatif cair.

13
 Reproduksibilitas dari waktu ke waktu penampilan mikroskopis jaringan
setelah pewarnaan H&E adalah persyaratan utama fiksatif yang digunakan
untuk patologi diagnostik. Metode fiksasi yang digunakan dalam protokol
penelitian mungkin lebih bervariasi, termasuk fiksasi menggunakan uap
dan fiksasi seluruh hewan dengan perfusi sistem vaskular hewan dengan
fiksatif (Eltoum et al. 2001a, 2001b).

Beberapa bahan kimia atau kombinasinya dapat bertindak sebagai

fiksatif yang baik, dan mencapai banyak tujuan fiksasi yang dinyatakan.
Beberapa fiksatif menambahkan kelompok reaktif kovalen yang dapat
menginduksi ikatan silang antara protein, gugus protein individu, dalam
asam nukleat, dan antara asam nukleat dan protein (Horobin 1982; Eltoum
et al. 2001a, 2001b; Rait et al. 2004, 2005).

b) Fiksasi Fisik

1. Pemanasan

Dalam histopatologi pemanasan terutama digunakan untuk

mempercepat bentuk fiksasi lain serta langkah-langkah pemrosesan
jaringan.

2. Fiksasi microwave

Kecepatan pemanasan microwave dapat mengurangi waktu

untuk fiksasi beberapa spesimen kotor dan bagian histologis dari lebih
dari 12 jam menjadi kurang dari 20 menit (Anonim 2001; Kok & Boon
2003; Leong 2005).

3. Pengeringan-pembekuan dan substitusi pembekuan

Beku-pengeringan-beku adalah teknik yang berguna untuk

mempelajari bahan larut dan molekul kecil, jaringan dipotong menjadi
beberapa bagian tipis, direndam dalam nitrogen cair, dan air
dihilangkan dalam ruang vakum pada suhu -40 ° C. Jaringan dapat

14
 diperbaiki dengan uap formaldehyde. Dalam substitusi, spesimen
direndam dalam fiksatif pada suhu -40 ° C, seperti aseton atau alkohol,
yang secara perlahan menghilangkan air melalui pelarutan kristal es,
dan protein tidak terdenaturasi; membawa suhu secara bertahap ke 4 °
C akan menyelesaikan proses fiksasi (Pearse 1980).
c) Fiksasi kimia
Fiksasi kimia menggunakan solusi organik atau non-organik untuk
mempertahankan pelestarian morfologi yang memadai. Fiksatif kimia
dapat dianggap sebagai anggota dari tiga kategori utama: koagulan,
pengikat silang, dan fiksatif senyawa (Baker, 1958).
1. Fiksasi koagulan
2. Fiksasi dehidrasi koagulan
Koagulasi yang paling umum digunakan adalah alkohol (misalnya
etanol, metanol) dan aseton. Metanol lebih dekat dengan struktur air
daripada etanol. Karena itu, etanol bersaing lebih kuat daripada metanol
dalam interaksi dengan area hidrofobik molekul; dengan demikian,
fiksasi koagulan dimulai pada konsentrasi 50-60% untuk etanol tetapi
membutuhkan konsentrasi 80% atau lebih untuk metanol (Lillie &
Fullmer 1976).
3. Jenis lain dari fiksatif koagulan
Koagulan asam seperti asam pikrat dan asam trikloroasetat
mengubah muatan pada rantai samping terionisasi, misalnya (-NH2 →
NH3 +) dan (COO− → COOH), dari protein dan mengganggu ikatan
elektrostatik dan hidrogen. Asam-asam ini juga dapat memasukkan
anion lipofilik ke dalam daerah hidrofilik dan karenanya mengganggu
struktur tersier protein (Horobin 1982).
4. Fiksatif ikatan silang non-koagulan
Beberapa bahan kimia dipilih sebagai fiksatif sekunder dari
potensi aksi pembentukan ikatan silang di dalam dan di antara protein
dan asam nukleat serta antara asam nukleat dan protein. Tautan silang
mungkin bukan mekanisme utama pada saat-saat fiksasi singkat saat ini,

15
 dan karena itu 'fiksatif aditif kovalen' mungkin nama yang lebih baik
untuk grup ini. Contohnya termasuk formaldehida, glutaraldehida, dan
aldehida lainnya, misalnya hidrat klorida dan glioksal, garam logam
seperti merkuri dan seng klorida, dan senyawa logam lainnya seperti
osmium tetroksida. Kelompok aldehida secara kimia dan biologis
reaktif dan bertanggung jawab untuk banyak reaksi histokimia,
misalnya kelompok aldehida bebas mungkin bertanggung jawab atas
reaksi argentaffin (Papanikolau & Kokkinidis 1997).
5. Fiksasi formaldehida
Formaldehida dalam bentuk buffered netral (NBF) 10% adalah
fiksatif yang paling umum digunakan dalam patologi diagnostik.
Formaldehida murni adalah uap yang, ketika sepenuhnya larut dalam
air, membentuk larutan yang mengandung 37-40% formaldehida; solusi
berair ini dikenal sebagai 'formalin'. '10% formalin 'yang biasa
digunakan dalam fiksasi jaringan adalah 10% larutan formalin; yaitu,
mengandung sekitar 4% berat terhadap volume formaldehida. Reaksi
formaldehida dengan makromolekul sangat banyak dan kompleks.
Fraenkel-Conrat dan rekan-rekannya, menggunakan kimia sederhana,
dengan cermat mengidentifikasi sebagian besar reaksi formaldehida
dengan asam amino dan protein (French & Edsall 1945; Fraenkel-
Conrat & Olcott 1948a, 1948b; Fraenkel-Conrat & Mecham 1949).
6. Gugus Reversibilitas reaksi formaldehydemacromolecular
Reaktif dapat bergabung dengan gugus hidrogen atau dengan satu
sama lain, membentuk jembatan metilen. Jika formalin terhanyut,
kelompok reaktif dapat dengan cepat kembali ke keadaan semula, tetapi
segala penghalang yang telah terjadi mungkin tetap ada. Mencuci
selama 24 jam menghilangkan sekitar setengah dari kelompok reaktif,
dan 4 minggu mencuci menghilangkan hingga 90% (Helander 1994).
7. Fiksasi glutaraldehida
Glutaraldehida adalah aldehida bifungsional yang mungkin
bergabung dengan kelompok reaktif yang sama dengan formaldehida.

16
 Dalam larutan air polimerisasi glutaraldehid, membentuk senyawa
siklik dan oligomer (Hopwood 1985), dan juga dioksidasi menjadi asam
glutarat. Untuk membantu stabilitas, diperlukan penyimpanan pada 4 °
C dan pada pH sekitar 5 (Hopwood 1969).
8. Fiksasi Osmium tetroxide
Osmium tetroxide (OsO4), zat padat beracun, larut dalam air serta
pelarut non-polar dan dapat bereaksi dengan situs hidrofilik dan
hidrofobik termasuk rantai samping protein, yang berpotensi
menyebabkan ikatan silang (Hopwood et al. 1990).
9. Fiksasi ikatan silang untuk mikroskop elektron
Fiksatif yang disukai adalah fiksatif pengikat silang yang kuat
seperti glutaraldehida, kombinasi glutaraldehida dan formaldehida, atau
Millonig termodifikasi milik Carson, diikuti dengan pasca-fiksasi dalam
suatu zat yang selanjutnya menstabilkan serta menekankan membran
seperti OsO4.
10. Merkuri klorida
Secara historis, merkuri klorida sangat disukai untuk kualitasnya
meningkatkan sifat pewarnaan jaringan, terutama untuk pewarnaan
trikoma. Namun, sekarang jarang digunakan di laboratorium klinis
karena masalah kesehatan dan keselamatan yang terlibat dengan
penggunaan fiksatif yang mengandung merkuri, dan juga karena
berkurangnya ketergantungan pada 'noda khusus'. Kelemahan utama
selanjutnya dari fiksasi merkuri klorida adalah pembentukan endapan
yang tidak terelakkan dari endapan pigmen merkuri yang sangat hitam
di dalam jaringan.
11. Sulfydryl 2 (RSH) Hg Cl2 ↔ (RS) 2 - Hg + 2H ++ 2Cl-
Fiksatif merkuri (Hopwood 1973) tidak lagi digunakan secara rutin
kecuali oleh beberapa laboratorium untuk memperbaiki jaringan
hematopoietik (terutama B5). Pengganti yang potensial untuk merkuri
klorida adalah seng sulfat. Formulasi khusus seng sulfat dalam
formaldehida menggantikan merkuri klorida dalam B5 dapat

17
 memberikan detail nuklir yang lebih baik daripada formaldehida saja
dan meningkatkan penetrasi jaringan (Carson 1990).
d) Fiksasi Khusus
1. Dikromat dan fiksasi asam kromat
Chromium trioksida larut dalam air untuk menghasilkan larutan
asam asam kromat, dengan pH 0,85. Asam kromat adalah zat pengoksidasi
kuat yang menghasilkan aldehida dari residu polisakarida 1, 2-diglikol.
Aldehida ini dapat bereaksi dalam pewarnaan histokimia (PAS dan
argentaffin / argyrophil) dan harus meningkatkan latar belakang
pewarnaan imunohistokimia (Grizzle 1996a).
2. Fiksatif untuk analisis DNA, RNA, dan protein
Asam nukleat dan protein ditemukan stabil selama 6-14 bulan.
Selain itu, fiksatif ini kurang beracun daripada formulasi formaldehida.
Sementara fiksatif ini tampaknya menunjukkan harapan besar, harus
diingat bahwa fiksasi dalam NBF juga akan memungkinkan ekstraksi
fragmen DNA dan RNA dengan ukuran yang sama untuk dianalisis oleh
teknologi berbasis PCR, dalam kerangka waktu ini.
3. Ion logam sebagai suplemen fiksatif
Beberapa ion logam telah digunakan sebagai bantuan dalam
fiksasi, termasuk Hg2 +, Pb2 +, Co2 +, Cu2 +, Cd2 +, [UO2] 2+, [PtCl6]
2+, dan Zn2 +. Merkuri, timbal, dan seng digunakan paling umum dalam
fiksatif saat ini, misalnya formaldehida yang mengandung seng disarankan
untuk menjadi fiksatif yang lebih baik untuk imunohistokimia daripada
formaldehida saja. Namun ini tergantung pada pH formaldehida, serta seng
formaldehida (Arnold et al. 1996; Eltoum et al. 2001a).
e) Fiksatif senyawa

Gugus aldehida yang tidak bereaksi dalam fiksasi

glutaraldehydeformaldehyde misalnya dapat meningkatkan pewarnaan
latar belakang, dan formalin beralkohol dapat menyebabkan pewarnaan

18
 saraf myelinated yang tidak spesifik (Grizzle et al. 1995, 1997, 1998a,
1998b; Arnold et al. 1996; Grizzle 1996b).
f) Faktor-faktor yang mempengaruhi kualitas fiksasi
1. Buffer dan pH
 Pengaruh pH pada fiksasi dengan formaldehida mungkin sangat
dalam, tergantung pada aplikasi di mana jaringan akan terpapar.
 Pada pH asam formaldehida yang tidak terbuai, produk-produk
metabolisme hemoglobin dimodifikasi secara kimia untuk
membentuk pigmen coklat-hitam, tidak larut, kristal, birefringent.
 Asam asetat dan asam lain bekerja terutama melalui penurunan pH
dan mengganggu struktur tersier protein.
2. Durasi fiksasi dan ukuran spesimen
 dkt = Konstanta (k) adalah koefisien difusabilitas, yang khusus
untuk masing-masing yg digambarkan. Contohnya adalah 0,79
untuk formaldehida 10%, 1,0 untuk etanol 100%, dan 1,33 untuk
3% kalium dikromat (Hopwood 1969).
3. Suhu fiksasi
 Difusi molekul meningkat dengan naiknya suhu karena gerakan
dan getaran yang lebih cepat; yaitu laju penetrasi jaringan oleh
formaldehida lebih cepat pada suhu yang lebih tinggi.
4. Konsentrasi fiksatif
 Efektivitas dan kelarutan terutama menentukan konsentrasi fiksatif
yang tepat. Konsentrasi formalin di atas 10% cenderung
menyebabkan peningkatan pengerasan dan penyusutan (Fox et al.
1985).
5. fiksatif dan komposisi ion
 Osmolalitasosmolalitas buffer dan fiksatif penting; solusi
hipertonik dan hipotonik menyebabkan penyusutan dan
pembengkakan, masing-masing.
6. Aditif

19
  Penambahan elektrolit dan non-elektrolit ke fiksatif meningkatkan
morfologi jaringan tetap. Aditif ini termasuk kalsium klorida,
kalium tiosianat, amonium sulfat, dan kalium dihidrogen fosfat.
7. Memilih atau menghindari fiksatif tertentu
 Pilihan fiksatif adalah kompromi, menyeimbangkan efek
menguntungkan dan merugikan. Kiernan (1999) awalnya
menghasilkan tabel tindakan fiksatif; ini kemudian dimodifikasi
dan diterbitkan oleh Eltoum et al. (2001b)
g) Jaringan yang difiksasi
1. Mata
Bola harus dipasang dengan kuat untuk memotong bagian yang
baik untuk ditanamkan. Mata mungkin tertuju pada NBF, biasanya sekitar
48 jam; untuk mempercepat fiksasi satu atau dua jendela kecil dapat
dipotong menjadi globe (hindari retina dan iris) setelah 24 jam. Setelah
deskripsi kasar, anterior (iris) dan posterior (mis. Saraf optik) dihilangkan
dengan pisau silet baru yang tajam dan komponen globe diperbaiki selama
48 jam tambahan, atau lebih, dalam formaldehida buffer, sebelum
diproses. Penanaman mungkin dalam celloidin atau parafin. Fiksasi perfusi
mata direkomendasikan untuk studi kanal Schlemm dan / atau jalur aliran
air.
2. Otak
Masalah memperbaiki seluruh otak adalah membuatnya cukup kuat
untuk menyelidiki neuroanatomi dan menghasilkan bagian untuk
menunjukkan histopatologi dan untuk menanggapi imunokimia jika
diperlukan. Secara konvensional fiksasi ini memakan waktu setidaknya 2
minggu. Adickes et al. (1997) mengusulkan teknik perfusi yang
memungkinkan semua hal di atas dapat diselesaikan dan laporan
dikeluarkan dalam 5-6 hari. Metode ini tergantung pada perfusi otak
melalui arteri serebri tengah. Fiksatif juga dapat ditingkatkan dengan
menggunakan teknologi gelombang mikro (Anonymous 2001; Kok &
Boon 2003; Leong 2005)

20
3. payudara
Sampel klinisharus diperbaiki dalam NBF 10% untuk antara
minimal 6-8 jam dan maksimum 72 jam, dan harus diiris pada interval
5mm setelah inspeksi bruto dan penunjukan margin yang tepat. Waktu dari
akuisisi jaringan hingga fiksasi harus sesingkat mungkin untuk mencegah
lisis biomarker penting secara klinis, seperti reseptor estrogen, reseptor
progesteron, dan reseptor faktor pertumbuhan epidermal manusia 2
(HER2). Mereka harus ditempatkan dalam volume NBF yang cukup untuk
memungkinkan penetrasi jaringan yang memadai. Jika spesimen tumor
telah datang dari lokasi geografis yang terpencil, itu harus dibagi dua
melalui tumor pada saat pengangkatan dan dikirim ke laboratorium
direndam dalam volume NBF yang cukup (Hammond et al., 2010).
4. Paru-paru
Biopsi paru biasanya diperbaiki di NBF. Paru-paru dari otopsi
dapat dipompa oleh dan difiksasi dalam NBF melalui trakea atau bronkus
mayor, dan menurut pengalaman kami, paru-paru ini dapat dipotong dalam
waktu 2 jam. Bagian kotor diperbaiki dalam semalam dan bagian yang
akan diproses dan dipotong pada hari berikutnya.
5. Jaringan limfoid
Perhatian khusus harus diberikan pada semua jaringan limfoid,
karena banyak organisme (mis. Mycobacterium tuberculosis dan virus)
dapat menyita diri mereka dalam sistem reticular limfoid. Jaringan limfoid
biasanya diiris dan sampel yang representatif dari jaringan segar diambil
untuk studi khusus (misalnya flow cytometry atau analisis molekuler). Sisa
kelenjar getah bening diperbaiki dalam NBF, meskipun beberapa
laboratorium memperbaiki bagian dari jaringan dalam B5 atau seng.
6. Testis
Biopsi testis tetap rutin di NBF.
7. Otot biopsi
Biopsi otot diterima segar. Sebagian dipisahkan untuk histokimia
enzim. Jaringan untuk penilaian histologis rutin difiksasi dalam NBF dan

21
 tertanam sehingga serat spesimen dilihat secara melintang dan memanjang.
Setelah diproses, ini diwarnai dengan H&E, noda trichrome, dan Congo
merah jika dicurigai amiloid.
h) Larutan untuk fiksasi
1. Netral buffered 10% formalin
2. Formalin, buffered saline
3. Formalin, buffered zinc
4. Solusi Zenker
5. Larutan Helly
6. Larutan Schaudinn
7. Larutan Carnoy-Lebrun
8. B5 fixative
9. Larutan Miller atau Möller
10. Larutan Orth's
11. Larutan Bouin Larutan
12. Solusi Hollande
13. Larutan Clarke
14. Alkoholik formalin
15. Alcoholic Bouin's (Gendre's solution)
16. Larutan Gendre
17. Alkoholik formalin

2.3. Pemrosesan Jaringan

a) Prinsip pemrosesan jaringan
Pemrosesan jaringan dirancang untuk menghilangkan semua air
yang dapat diekstraksi dari jaringan. Menggantinya dengan media
pendukung yang memberikan kekakuan yang cukup untuk memungkinkan
pemotongan jaringan tanpa kerusakan parenkim atau distorsi.

22
 Faktor-faktor yang mempengaruhi tahap pemrosesan :
1) Agitasi, meningkatkan aliran solusi segar di sekitar jaringan. Agitasi
yang efisien dapat mengurangi keseluruhan waktu pemrosesan hingga
30%.
2) Panas, meningkatkan tingkat penetrasi dan pertukaran cairan. Panas
harus digunakan dengan hemat untuk mengurangi kemungkinan susut,
pengerasan, atau embrittlement dari sampel jaringan. Temperatur
terbatas pada 45 ° C dapat digunakan, tetapi suhu yang lebih tinggi
dapat merusak imunohistokimia berikutnya.
3) Viskositas, adalah sifat resistensi terhadap aliran fluida. Semakin kecil
ukuran molekul dalam larutan, semakin cepat laju penetrasi
cairan. Sebaliknya, jika ukuran molekul lebih besar, nilai tukar lebih
lambat (viskositas tinggi). Paling dari solusi yang digunakan dalam
pemrosesan, dehidrasi dan pembukaan, memiliki viskositas yang sama,
dengan pengecualian minyak kayu cedar. Media penyisipan memiliki
viskositas yang bervariasi. Parafin memiliki viskositas yang lebih
rendah di keadaan cair (meleleh), meningkatkan kecepatan impregnasi.
4) Vakum, yang digunakan pada prosesor otomatis tidak boleh melebihi
50,79 kPa untuk mencegah kerusakan dan penurunan kualitas karena
masalah tersebut. Vakum juga dapat membantu menghilangkan udara
yang terjebak di jaringan berpori.Waktu impregnasi untuk padat,
jaringan lemak dapat sangat berkurang dengan penambahan ruang
hampa selama pemrosesan.

b) Tahapan pemrosesan jaringan

 Fiksasi - menstabilkan dan mengeraskan jaringan dengan distorsi sel
yang minimal.
 Dehidrasi - menghilangkan air dan fiksatif dari jaringan.
 Kliring - menghilangkan larutan dehidrasi, membuat komponen
jaringan
 Infiltrasi - meresapi jaringan dengan reseptif ke media pendukung.

23
 Penanaman - mengorientasikan sampel jaringan dalam media
pendukung dan membiarkannya membeku.
1) Fiksasi

Fiksasi menstabilkan protein, membuat sel dan komponennya

resisten terhadap autolisis lebih lanjut dengan menonaktifkan enzim
lisosom. Fiksasi harus selesai sebelum langkah selanjutnya, jadwal
pemrosesan dimulai. Jika jaringan tidak diperbaiki dengan baik, maka ini
perlu dilakukan solusi dehidrasi dapat menyelesaikan proses, mungkin
mengubah karakteristik pewarnaan jaringan. Ukuran dan jenis spesimen
dalam kaset ini menentukan waktu yang diperlukan untuk fiksasi dan
pemrosesan lengkap. Reagen yang paling umum digunakan untuk fiksasi
dari spesimen histologis adalah 10% buffer netral formalin (NBF).

Perawatan pasca-fiksasi :
Teknik fiksasi khusus mungkin memerlukan langkah-langkah
tambahan sebelum pemrosesan dimulai. Fiksatif asam pikrat (Bouin)
membentuk pembuatan pikrat yang larut dalam air perlu untuk
menempatkan kaset tisu langsung ke alkohol 70% untuk
diproses. Fiksatif alkohol, seperti cairan Carnoy, harus ditempatkan
langsung ke dalamnya 100% alkohol. Untuk membantu dalam visualisasi
kecil fragmen jaringan selama embedding, beberapa tetes dari 1% eosin
dapat ditambahkan ke wadah spesimen 30 menit sebelum
pemrosesan. Warna merah muda jaringan tetap selama pemrosesan,
tetapi membasuh selama pewarnaan berikutnya.
2) Dehidrasi

Tahap pertama pemrosesan adalah menghilangkan air bebas yang

terikat dan fiksatif berair dari komponen jaringan. Dehidrasi yang
berlebihan dapat menyebabkan jaringan menjadi keras, rapuh dan
menyusut. Dehidrasi yang tidak lengkap akan merusak penetrasi reagen
kliring ke dalam jaringan, meninggalkan spesimen lunak dan tidak dapat

24
menerima infiltrasi. Ada banyak agen dehidrasi; etanol, etanol aseton,
metanol isopropil, glikol dan alkohol terdenaturasi.

Cairan dehidrasi :
a. Etanol (C2H5OH), digunakan untuk dehidrasi; jaringan direndam
dalam 70% etanol dalam air, diikuti oleh 95% dan 100%
larutan. Etanol memastikan dehidrasi total, menjadikannya reagen
pilihan untuk pemrosesan spesimen mikroskop elektron.
b. Alkohol terdenaturasi, alkohol didenaturasi terdiri dari etanol,
dengan penambahan metanol (sekitar 1%), isopropil alkohol atau
kombinasi alkohol. Untuk keperluan pemrosesan jaringan digunakan
dengan cara yang sama seperti etanol.
c. Methanol (CH3OH), adalah cairan bening, tidak berwarna dan
mudah terbakar yang larut dengan air, etanol dan sebagian besar
pelarut organik.
d. Propan-2-ol, isopropil alkohol (CH3CHOHCH), Isopropyl alkohol
larut dengan air, etanol, dan sebagian besar pelarut organik. Ini
digunakan dalam jadwal pemrosesan gelombang mikro. Alkohol
isopropil tidak menyebabkan pengerasan yang berlebihan atau
penyusutan jaringan.
e. Butil alkohol (butanol) (C4H9OH), digunakan terutama untuk
histologi tumbuhan dan hewan. Butyl alkohol adalah dehidrasi
lambat yang menyebabkan berkurangnya penyusutan dan pengerasan
jaringan.
f. Aseton (CH3COCH3), adalah cairan bening, tidak berwarna, mudah
terbakar yang larut dengan air, etanol, dan sebagian besar pelarut
organik. Itisrapid beraksi, tetapi memiliki penetrasi yang buruk dan
menyebabkan kerapuhan pada jaringan jika penggunaannya
diperpanjang.

25
 g. Pelarut universal, baik jaringan dehidrasi dan membersihkan selama
pemrosesan jaringan.Dioksan, butanol tersier, dan tetrahidrofuran
dianggap sebagai pelarut universal.
3) Clearing

Reagen clearing bertindak sebagai perantara antara dehidrasi

dan larutan infiltrasi. Kriteria untuk memilih agen clearing yang cocok
ialah :
a) penetrasi jaringan yang cepat
b) penghilangan agen dehidrasi secara cepat
c) mudah dihilangkan dengan lilin parafin yang meleleh
d) kerusakan jaringan minimal
e) mudah terbakar rendah
f) toksisitas rendah
g) biaya rendah

Reagen clearing yang rutin digunakan :

1) Xylene, adalah cairan yang mudah terbakar dan tidak berwarna
dengan karakteristik minyak bumi atau bau aromatik, yang larut
dengan sebagian besar pelarut organik dan lilin parafin.
2) Toluene, memiliki sifat yang mirip dengan xylene, meskipun
kurang merusak dengan perendaman jaringan yang
berkepanjangan. Ini lebih mudah terbakar dan tidak stabil
dibandingkan xylene.
3) Kloroform, lebih lambat dalam aksi daripada xilena tetapi
diproses, dengan ketebalan lebih dari 1 mm. Jaringan yang
ditempatkan di kloroform tidak menjadi tembus cahaya.
4) Pengganti Xylene, adalah hidrokarbon alifatik yang ada dalam
bentuk rantai panjang dan pendek. Alifatik rantai pendek
memiliki sifat penguapan yang sama seperti xylene, dan tidak
memiliki afinitas terhadap air. Alifatik rantai panjang tidak

26
 menguap rapi dan dapat menyebabkan kontaminasi lilin parafin
pada prosesor jaringan.
5) Pereaksi limonene, adalah ekstrak dari kulit jeruk dan
lemon; mereka tidak beracun dan larut dengan air.
4) Reagen infiltrasi dan embedding
a. Lilin parafin, adalah campuran dari rantai panjang hidrokarbon
diproduksi dalam pemecahan minyak mineral. Sifat-sifatnya
bervariasi tergantung pada titik lebur yang digunakan, mulai dari
47 hingga 64 ° C. Lilin parafin meresap ke jaringan dalam bentuk
cair dan membeku dengan cepat ketika didinginkan. Jaringan
diresapi dengan medium, membentuk amatrix dan mencegah
distorsi struktur jaringan selama mikrotomi.
b. Aditif lilin paraffin, Aditif ini membuat lilin parafin dengan
kekerasan yang dapat dipilih yang kompatibel dengan jaringan
yang akan ditanamkan.
c. Resin, digunakan secara eksklusif sebagai media penempelan
untuk mikroskop elektron
d. Agar, Penggunaan utamanya adalah sebagai agen kohesif untuk
potongan-potongan kecil jaringan rapuh setelah fiksasi, sebuah
proses yang dikenal sebagai embedding ganda.
e. Gelatin, terutama digunakan dalam produksi bagian dari seluruh
organ menggunakan Teknik Gough-Wentworth dan di bagian
beku. Ini jarang dilupakan.
f. Penggunaan celloidin atau LVN (viskositas rendah nitroselulosa),
tidak dianjurkan karena persyaratan khusus yang diperlukan
untuk menampung reagen pemrosesan dan terbatasnya
penggunaan jenis bagian ini dalam neuropatologi.

c) Pemrosesan jaringan
Prinsip dasar untuk pemrosesan jaringan memerlukan pertukaran
cairan menggunakan serangkaian solusi untuk jangka waktu yang telah

27
 ditentukan sebelumnya dalam lingkungan yang terkendali. Selama
beberapa dekade, instrumentasi yang digunakan dalam pemrosesan
jaringan tetap relatif tidak berubah. Kemajuan terbaru sekarang termasuk
oven microwave khusus, munculnya prosesor throughput konstan, dan
prosesor dengan retort multi-bagian.

d) Prosesor jaringan
Prosesor ini biasanya menggunakan sistem alarm dan program
diagnostik untuk pemecahan masalah instrumentasi apa pun
malfungsi. Instrumentasi yang lebih baru telah membagi retort yang
memungkinkan berbagai program berjalan secara bersamaan,
memungkinkan pemanfaatan peralatan yang lebih baik dan memberikan
kesempatan untuk membagi jaringan berdasarkan ukuran. Banyak prosesor
memiliki sistem manajemen solusi, yang memungkinkan pereaksi
dimonitor untuk kemurnian dan untuk digunakan untuk periode waktu
yang lebih lama tanpa merugikan jaringan.

e) Prosesor gelombang mikro

Oven microwave yang dirancang khusus untuk pemrosesan

jaringan sekarang umum. Oven microwave mempersingkat waktu
pemrosesan dari jam menjadi menit. Paparan gelombang mikro
merangsang difusi larutan ke jaringan dengan meningkatkan panas internal
spesimen, sehingga mempercepat reaksi. Jaringan secara manual
dipindahkan dari wadah ke wadah reagen. Kebanyakan oven microwave
laboratorium mengandung kontrol suhu, timer, dan sistem ekstraksi asap
yang tepat. Waktu pemrosesan tergantung pada ketebalan dan kerapatan
spesimen. Reagen yang digunakan untuk pemrosesan gelombang mikro
meliputi etanol, isopropanol dan campuran alkohol, dan parafin. Solusi
konsentrasi bertingkat adalah tidak dibutuhkan. Zat pembersih tidak
diperlukan karena suhu tahap parafin akhir memudahkan penguapan
alkohol dari jaringan. Xylene dan formalin tidak digunakan dalam proses

28
 ini, yang menghilangkan asap dan karsinogen beracun. Pemrosesan yang
terkontrol dengan baik memberikan morfologi dan antigenisitas tanpa
kompromi pada waktu penyelesaian, pereaksi yang ramah lingkungan, dan
keuntungan yang lebih besar karena pengurangan jumlah dan volume
pereaksi adalah keuntungan dari sistem ini. Kerugian sistem mencakup
fakta bahwa prosesnya padat karya karena solusinya secara manual
dimanipulasi, suhu harus dijaga antara 70 dan 85 ° C, dan ukuran sampel
jaringan sangat penting (2 mm). Juga biaya gelombang mikro tingkat
laboratorium mungkin mahal, dan penggunaan microwave oven yang tepat
membutuhkan kalibrasi dan pemantauan yang cermat.

f) Pemrosesan alternatif
Keuntungan teknologi baru dalam pemrosesan :
1) program khusus untuk jaringan yang sedang diproses, penambahan vakum,
agitasi atau panas pada tahap apa pun
2) jadwal cepat
3) penahanan cairan dan asap
4) pereaksi ramah lingkungan
5) penundaan waktu untuk memulai jadwal pemrosesan
6) manajemen reagen

Pemeliharaan prosesor :
Setiap institusi harus memiliki kebijakan yang menguraikan rotasi
dan perubahan solusi pada prosesor jaringan. Jumlah, ukuran, jenis
jaringan yang diproses dan reagen yang digunakan akan berperan dalam
penentuan kebijakan ini. Solusi harus dipantau dengan cermat untuk
memastikan kualitas. Setiap pabrikan memiliki buku pegangan yang
menjabarkan jadwal perawatan yang tepat.
Cara perawatan :
1) Tumpahan atau luapan apa pun harus segera dibersihkan
2) Akumulasi lilin pada permukaan apa pun seharusnya dihapus

29
 3) Suhu rendaman lilin parafin harus diatur pada 3 ° C di atas titik lebur lilin
parafin dan dimonitor setiap hari
4) Pengaturan waktu harus diperiksa ketika menempatkan kaset tisu dalam
prosesor, terutama ketika jadwal yang tertunda dipilih
5) Siraman air hangat harus dimasukkan, menjaga garis bebas dari garam,
protein dan puing-puing

Jadwal pemrosesan otomatis :

Meskipun jadwal semalam untuk pemrosesan jaringan tetap
populer di banyak laboratorium, jadwal telah berubah untuk
mencerminkan penekanan pada pengurangan waktu penyelesaian untuk
pelaporan spesimen. Pemrosesan cepat untuk biopsi kecil atau spesimen
stat dapat dengan mudah diakomodasi.

g) Pemrosesan semalam

Proses ini dapat meliputi formalin alkohol, berbagai konsentrasi

alkohol, xylene, atau pengganti xylene, diikuti oleh infiltrasi dalam lilin
parafin. Jadwal disesuaikan untuk jaringan yang sedang diproses. Faktor-
faktor yang mempengaruhi jadwal pemrosesan termasuk waktu akhir yang
dibutuhkan, reagen yang digunakan, dimasukkannya panas dan vakum dan
ukuran dan jumlah kaset jaringan yang diproses.

h) Pemrosesan jaringan manual

Pemrosesan jaringan manual telah berhenti di sebagian besar

laboratorium. Ada beberapa kondisi yang mengharuskan yaitu:
1) Kegagalan daya atau kerusakan peralatan.
2) Sampel jaringan besar membutuhkan lebih banyak waktu daripada dapat
dialokasikan pada prosesor otomatis.
3) Biopsi kecil, seperti spesimen transplantasi membutuhkan diagnosis
cepat, meskipun di atas Jadwal 2–5 jam sering mencukupi sampel untuk
diproses secara manual.

30
i) Tisu microarray

Lena T. Spencer, John D. Bancroft Tissue microarray (TMA)

dikembangkan sebagai metode untuk mengevaluasi berbagai sampel
jaringan di periode singkat. TMA menggunakan beberapa sampel jaringan
yang dapat diatur dalam blok parafin tunggal menggunakan alat presisi
untuk mempersiapkan blok penerima.
Tujuan :
Teknik histologis mengambil peran penting dalam pengembangan
biologi molekuler dan TMA telah menjadi alat diagnostik yang kuat,
menghemat sampel jaringan dan menghemat waktu untuk penelitian
(termasuk kanker) dan pekerjaan klinis. TMA memiliki aplikasi dalam
patologi klinis dan berfungsi sebagai kontrol kualitas untuk antibodi
baru. Produksi antibodi adalah proses yang mahal dan panjang, dan TMA
adalah alat unik yang dapat membantu merampingkan validasi rumit dan
kontrol kualitas jaringan arsip serta kontrol imunohistokimia harian (IHC).
Jenis mikroarray jaringan :
1) Prevalensi TMA dikumpulkan dari sampel tumor dari satu atau beberapa
jenis tanpa informasi klinis dan patologis yang terlampir. Digunakan
untuk menentukan prevalensi perubahan yang diberikan dalam bidang
minat tertentu pada tumor.
2) Perkembangan TMA mengandung sampel berbagai tahapan dari satu jenis
tumor dan digunakan untuk memutuskan hubungan antara genotipe tumor
dan fenotipe. Misalnya, TMA perkembangan kanker payudara dapat berisi
sampel payudara normal dari pasien dengan dan tanpa riwayat kanker
payudara, berbagai penyakit payudara non-neoplastik, karsinoma duktal
dan lobular in situ , kanker invasif pada semua tahap, tingkatan dan
subtipe histologis. serta metastasis dan kekambuhan setelah pengobatan
awalnya berhasil.

Persiapan blok donor :

31
 Slide dan blok file ditinjau untuk menentukan blok mana yang
akan di-array. Area yang menarik untuk dijadikan sampel biasanya
ditandai dengan berputar-putar dengan pilot pena atau penanda titik halus
permanen, meskipun beberapa ahli patologi lebih suka menandai blok
daripada slide. Setelah slide ditinjau dan ditandai, blok biasanya
dicocokkan dengan slide kaca yang sesuai ( Gambar 6.3 dan 6.4). Adalah
penting bahwa blok ditandai pada bidang minat yang sama dengan yang
ditandai meluncur. Blok donor harus memiliki ketebalan minimal 1 mm
agar sesuai untuk konstruksi larik; jika area yang ditandai memiliki
ketebalan kurang dari 1 mm, dua inti dari situs ini adalah ditumpuk di atas
satu sama lain. Saat menandai slide dan blok, berikut ini warna dapat
digunakan sebagai indicator.
1) Merah - Kanker
2) Hijau - Normal
3) Hitam - Pra-invasif

Database untuk analisis microarray jaringan :

1) Langkah pertama dalam pembangunan TMA adalah pemilihan kasus
dari basis data dan pembuatan
2) Kemudian, setelah bagian-bagian diwarnai, satu gambar per inti
diambil dan disimpan sebagai file terkompresi
3) Kemudian dicatat sebagai pengidentifikasi posisinya sendiri. Akuisisi
gambar seringkali memakan waktu kurang dari satu menit, termasuk
pemilihan bidang, fokus manual, dan identifikasi.

32
 Gambar 2.5. Proses pembuatan preparat
1. Array manual
Array manual bergantung pada peta atau grid grid yang dirancang
dan identifikasi visual dan manual langsung

33
 Gambar 2.6. MTAI arrayer jaringan manual

2. Array otomatis
Array otomatis mudah digunakan dan mencakup sistem perangkat
lunak pelacakan spesimen. Instrumen menandai, mengedit, dan
menyimpan koordinat punch menggunakan tampilan layar dan alat
perangkat lunak. Array otomatis sangat ideal untuk laboratorium dengan
volume TMA yang tinggi, karena 120-180 core dapat 'dilubangi' per jam

Gambar 2.7. ATA27 arrayer jaringan otomatis

34
 Pemeliharaan arrayer :
Selama proses susunan, disarankan untuk membersihkan parafin
sisa dari pukulan, blok pengambilan sampel dan pemegang blok, menyeka
semua dengan spons kasa 5 5 cm. Bagian tidak boleh direndam dalam
xylene, tetapi orang harus meminyaki XY atau Z rails setiap beberapa
bulan sekali. Pukulan harus diganti secara berkala sebagai mereka terbuat
dari tabung tipis. Mereka dapat dengan mudah menekuk atau ujung
tusukan dapat menjadi tumpul setelah beberapa ratus pukulan. Punch
pengganti diposisikan dengan benar ketika alur di hub punch ditempatkan
dengan kuat pada batang logam di blok-v, memastikan tidak
bergoyang. Penyelarasan pukulan pengganti harus diperiksa sebelum
memulai array.

2.4. Mikrotom

Mikrotomi adalah cara jaringan dipotong dan dilekatkan ke

permukaan untuk pemeriksaan mikroskopis lebih lanjut. Kebanyakan
mikrotomi dilakukan pada blok jaringan lilin parafin. Instrumen dasar yang
digunakan dalam mikrotomi adalah mikrotom; mekanisme maju
menggerakkan objek (parafinblock) untuk jarak yang telah ditentukan sampai
bersentuhan dengan alat pemotong (pisau atau bilah). Spesimen bergerak
secara vertikal melewati permukaan pemotongan dan bagian jaringan
diproduksi. Teknik yang baik dicapai melalui latihan yang berkelanjutan.
a) Peralatan mikrotom

Ada beberapa jenis peralatan mikrotom, masing-masing dirancang

untuk tujuan tertentu, walaupun banyak yang memiliki peran multifungsi.
1) Mikrotom
Mikrotom putar sering disebut sebagai "Minot" setelah
penemunya. Mekanisme dasar membutuhkan rotasi roda tangan muka
yang halus sebesar 360 derajat, memindahkan spesimen secara vertikal
melewati permukaan pemotongan dan mengembalikannya ke posisi awal.

35
 Mikrotom putar mungkin manual (sepenuhnya dimanipulasi oleh
operator), semi-otomatis (satu motor untuk memajukan roda tangan halus
atau roda saja), atau sepenuhnya otomatis (dua motor yang menggerakkan
roda tangan halus dan roda gerak saja) ). Mekanisme untuk memajukan
blok mungkin menarik atau tidak menarik. Keuntungannya termasuk
kemampuan untuk memotong 2–3 m bagian tipis dan adaptasi yang mudah
untuk semua jenis jaringan (keras, rapuh atau berlemak). Kemajuan
teknologi dalam otomatisasi mikrotomi telah meningkatkan kualitas
bagian, meningkatkan produktivitas, dan meningkatkan keselamatan kerja
bagi teknolog. Menghilangkan operasi roda manual manual mikrotom
mengurangi insiden gangguan berulang, masalah kesehatan kerja yang
umum terjadi di laboratorium histologi.
2) Base sledge microtom
Dengan sledge, spesimen disimpan diam dan pisau meluncur
melintasi bagian atas spesimen selama pemotongan. Digunakan terutama
untuk blok besar, jaringan keras, atau seluruh tunggangan, sangat berguna
dalam neuropatologi dan patologi mata. Tiga bagian mikron sulit
diproduksi.
3) Mikrotom goyang rotari
Biasa digunakan dalam cryostats, aksi retraksi memindahkan blok
jaringan menjauh dari pisau pada gaya naik, menghasilkan wajah datar ke
blok jaringan.
4) Sliding microtome
Pisau atau pisau stasioner dan spesimen meluncur di bawahnya
selama pemotongan. Microtome ini dikembangkan untuk digunakan
dengan blok jaringan yang tertanam selloidin.
5) Ultra mikrotom
Digunakan khusus untuk mikroskop electron.
6) Pisau Microtome
Ada banyak bentuk, ukuran dan bahan untuk pisau microtome.
Pisau dikembangkan agar sesuai dengan jenis mikrotom tertentu, dan

36
 untuk mengatasi berbagai tingkat kekerasan jaringan dan media tanam.
Sebagian besar pisau baja telah diganti dengan pisau pembuangan,
meskipun pengecualian termasuk pisau tepi-alat untuk resin, dan pisau
baja untuk beberapa cryostats.
7) Waterbath
Air yang dikontrol secara termostatis digunakan untuk melayang
pita jaringan setelah dibelah. Suhu air dalam bak harus 10 ° C di bawah
titik leleh parafin untuk dipotong. Perawatan harus diambil untuk
mencegah gelembung air dari terperangkap di bawah bagian. Ini dapat
dicapai dengan menggunakan air suling di bak mandi. Alkohol atau setetes
deterjen kecil dapat ditambahkan ke air untuk mengurangi tegangan
permukaan, yang memungkinkan bagian tersebut menjadi rata dengan
lebih mudah.
8) Pengeringan oven atau hot plate
Pengeringan oven menggabungkan kipas yang menjaga sirkulasi
udara hangat di sekitar slide. Pengaturan suhu harus kira-kira sama dengan
titik leleh parafin. Jika oven terlalu panas mungkin ada distorsi pada sel-
sel, menyebabkan nuklei nukleotida gelap atau gelembung nuklir; sel-sel
yang sama sekali tidak memiliki detail nuklir. Waktu pengeringan
bervariasi tergantung pada jenis jaringan, jumlah slide yang akan
dikeringkan dan ukuran perangkat pengeringan. Banyak stainers otomatis
memiliki oven pengeringan sebagai bagian dari instrumen, sehingga waktu
dan suhu mudah diatur. Perhatian khusus harus diambil ketika
mengeringkan jaringan halus atau jaringan dari sistem saraf pusat;
diperlukan suhu yang lebih rendah untuk mencegah pecah dan pecahnya
bagian; Disarankan 37 ° C selama 24 jam.
9) Sikat dan forceps
Forceps, sikat atau jarum menggoda sangat membantu dalam
menghilangkan lipatan, lipatan dan gelembung yang mungkin terbentuk
selama mengambang keluar dari bagian di bak air. Mereka juga membantu
untuk memanipulasi bagian saat melewati tepi mata pisau.

37
10) Slide
Untuk pekerjaan rutin normal, slide 76x25 mm digunakan secara
universal. Meskipun slide tersedia dalam berbagai ketebalan, yang
ditentukan dengan ketebalan 1,0-1,2 mm lebih disukai karena tidak mudah
pecah. Kebanyakan rak slide dibuat untuk mengakomodasi ukuran slide
ini. Slide yang lebih besar tersedia untuk digunakan dengan jaringan
khusus seperti mata atau otak. Nomor identifikasi unik atau kode, nama
pasien atau informasi lain harus diukir, diembos atau ditulis pada setiap
slide. Instrumen otomatis yang menanamkan informasi pasien pada slide
kaca sudah tersedia. Pena dan pensil yang tahan bahan kimia secara rutin
digunakan untuk memberi label pada slide. Slide yang diisi positif atau
pra-perawatan dengan perekat yang menahan pelepasan jaringan dari slide
selama pewarnaan. Slide yang berwarna dan diakhiri dengan es dapat
digunakan untuk mengidentifikasi penanganan khusus (decal, pewarnaan
khusus, imunohistokimia, dll.)
11) Bagian perekat
Menyediakan slide yang bersih digunakan dan bagian cukup
dikeringkan, masalah bagian terlepas dari slide selama pewarnaan tidak
boleh terjadi. Ada kalanya bagian mungkin terlepas dari slide:
 Paparan terhadap larutan alkali yang kuat selama pewarnaan
 Bagian cryostat untuk imunofluoresensi,,imunohistokimiaatauintra-
operatif konsultasi
 jaringan sistem saraf pusat (SSP)
 Bagian yang dimasukkan keekstrem suhu
 Jaringan yang mengandung darah dan lendir
 Jaringan yang didekalsifikasi Perekat dapat mengurangi masalah
kehilangan jaringan.Perekat protein seperti albumen, gelatin dan pati
mungkin rentan terhadap pertumbuhan bakteri atau berat pewarnaan;
pemantauan ketat akan mencegah masalah ini.
12) Slide yang dibebankan atau ditambah

38
 Laboratorium sering menggunakan slide yang telah diproduksi
dengan muatan positif permanen. Menempatkan muatan positif pada slide
dilakukan dengan melapisi slide dengan polimer dasar di mana reaksi
kimia terjadi, meninggalkan gugus amino yang dihubungkan oleh ikatan
kovalen ke atom silikon kaca. Slide ini telah terbukti lebih unggul dalam
ketahanannya terhadap kehilangan sel dan jaringan selama pewarnaan atau
pra-perawatan seperti pengambilan enzim dan antigen.

b) Pemeliharaan mikrotom

Pemeliharaan mikrotom penting untuk produksi slide berkualitas

untuk diagnosis.Rekomendasipabrik mengenai perawatan yang tepat dari
instrumen harus secara cermat.diikuti Kebijakan departemen harus diterapkan
yang menjabarkan harian, mingguan, triwulanan dan tahunan prosedur
pemeliharaan preventif.Bak air dan mikrotom harus ergonomis diposisikan
secarauntuk mengurangi stres dan ketegangan pada leher dan bahu karyawan.
Bak air dapat diisi dengan air suling atau air ledeng, dan disesuaikan dengan
suhu parafin yang tepat. Perawatan harus diambil untuk mengurangi
gelembung udara yang dapat merusak bagian jaringan.Pisau harus tajam dan
bebas cacat. Pisau atau pisau pemegang harus disesuaikan untuk
mengoptimalkan sudut clearance, jarak antara yang lebih rendah sudutsegidan
permukaan blok wajah. Sudutdirekomendasikan bervariasi 2-4 ° untuk parafin
untuk 5-7 ° untuk bagian beku. Sudut yang benar mengurangi gesekan saat
blade melewati blok, mencegah kompresi bagian. Menentukan sudut yang
tepat sebagian besar adalah masalah coba-coba.Klem dan sekrup harus
dikencangkan dengan kuat. Jika pisau sekali pakai akan digunakan, harus
dilakukan kehati-hatian untuk memastikan tekanan yang cukup diberikan
pada blade untuk memberikan dukungan, tetapi itu tidak boleh terlalu
dikencangkan, karena ini menyebabkantebal dan tipis pemotongan.

39
c) Memotong blok jaringan

Memotong blok jaringan -parafin dapat berhadapan atau "dipotong

kasar" dengan mengatur mikrometer pada 15-30 μm atau dengan memajukan
blok menggunakan mekanisme umpan kasar. Pemangkasan yang agresif akan
menyebabkan artefak "lubang ngengat". Perawatan harus diambil untuk
memastikan bahwa blok yang dijepit di chuck telah ditarik sehingga tidak ada
kontak dengan blade pada down-stroke awal. Dimungkinkan untuk merusak
jaringan dengan mencungkil atau mencetak gol saat memotong blok.

d) Bagian pemotongan

Blok harus disusun dalam urutan numerik pada baki es, mendinginkan
jaringan dan parafin, sehingga memberikan suhu yang konsisten. Sejumlah
kecil air diserap ke dalam jaringan, menyebabkan sedikit pembengkakan, dan
membuat pembelahan lebih mudah. Oversoaking dapat menyebabkan
ekspansi dan distorsi pada bagian jaringan. Pemrosesan yang tepat sangat
mengurangi atau menghilangkan kebutuhan untuk pra-rendam blok. Bahan
bedah rutin harus dipotong pada 3-4 m. Pengaturan mikrometer tidak
menjamin bahwa setiap bagian akan memiliki ketebalan yang tepat.
Ketebalan tergantung pada banyak faktor, termasuk suhu, sudut pisau dan
kecepatan potong. Pengalaman akan menentukan kecepatan stroke, tetapi
secara umum, seseorang harus menggunakan stroke yang halus dan lambat.
Jika ada kesulitan memotong bagian datar yang halus, menghangatkan wajah
blok dengan air hangat, atau mengembuskan napas dengan lembut ke
permukaan blok selama pemotongan, dapat membantu. Ini memiliki efek
memperluas blok, memberikan bagian yang sedikit lebih tebal. Idealnya,
bagian-bagian yang berurutan akan menempel ujung-ke-ujung karena tekanan
lokal dengan setiap goresan, membentuk pita. Jika seluruh blok harus
dipotong dan ditahan, pita disimpan dalam wadah untuk penggunaan di masa
mendatang.

40
e) Bagian melayang

Bagian melayang keluar dari pita harus halus, dengan ujung belakang
pita membuat kontak dengan air terlebih dahulu. Tarik sedikit dihasilkan
ketika sisa pita diletakkan di atas air sudah cukup untuk menghapus sebagian
besar, jika tidak semua, dari lipatan yang terjadi. Bagian melayang di bak air,
sisi mengkilap ke bawah. Lipatan di bagian tersebut dapat dihilangkan dengan
hanya menggoda dengan forsep. Kira-kira 30 detik harus cukup lama untuk
pita meratakan, karena waktu yang lama di atas air menyebabkan ekspansi
berlebihan, mendistorsi jaringan. Masing-masing bagian atau pita dapat
melayang ke slide. Struktur lingkaran seperti mata mungkin sulit untuk
diratakan. Berbagai teknik berguna dalam situasi ini, seperti menempatkan
bagian pada slide yang telah dibanjiri dengan alkohol 50%. Perosotan dengan
lembut direndam dalam bak air dan bagian mata akan mengambang di
permukaan. Kehadiran alkohol akan mengatur arus difusi yang membantu
meratakan bagian jaringan. Mandi air harus dibersihkan setelah setiap blok
dipotong, menghilangkan puing-puing dan fragmen jaringan dengan menyeret
kertas tisu di permukaan. Kebersihan tidak bisa terlalu ditekankan; bahan
debris (“pick-up”) dari blok yang berbeda adalah masalah serius.

f) Bagian pengeringan

Jumlah kecil air yang ditahan di bawah bagian akan memungkinkan

perataan lebih lanjut terjadi ketika panas diterapkan untuk mengeringkan
bagian. Temperatur harus berada di titik leleh parafin. Pewarnaan otomatis
memiliki oven pengeringan sebagai bagian dari instrumentasi. Geser dapat
dipasang pada stainer dengan penahan geser individual atau di rak yang
dirancang untuk instrumen. Penting untuk menghilangkan panas berlebih
selama tahap pengeringan slide, karena detail seluler dapat terganggu. Piring
panas dapat menyebabkan overheating slide yang terlokalisasi. Ketika
jaringan halus harus dikeringkan, distorsi akan lebih sedikit jika suhu

41
berkurang dan waktu memanjang. Pengeringan semalaman pada 37 ° C
direkomendasikan untuk banyak jaringan.

g) Memotong jaringan keras

Sejak diperkenalkannya pisau sekali pakai, memotong jaringan keras

tidak terlalu bermasalah. Alasan untuk memotong kesulitan adalah
kemungkinan fiksasi yang buruk atau pemrosesan yang berlebihan.
Perendaman blok yang berkepanjangan, atau memaparkan permukaan blok
terhadap air leding selama 30 menit, seringkali dapat mengatasi banyak
masalah yang terkait dengan pemotongan jaringan keras. Sedikit pengurangan
sudut pisau juga dapat memberikan hasil. Jika solusi ini gagal, bahan pelunak
dapat digunakan pada permukaan blok.

h) Dekalsifikasi permukaan

Blok dibilas dengan baik, dibersihkan kering, didinginkan dan

dikembalikan ke mikrotom. Bagian segera harus diambil karena dekalsifikasi
yang dicapai akan terbatas. Bahan diagnostik dapat dikompromikan jika
terjadi dekalsifikasi berlebih. Harus dicatat bahwa sifat pewarnaan jaringan
dapat terpengaruh setelah perawatan ini dan kelonggaran harus dilakukan
untuk mencapai hasil yang optimal.

i) Masalah dan solusi

Pita / bagian berurutan melengkung :

1) Tepi blok tidak paralel
2) Ujung pisau tumpul
3) Parafin berlebihan
4) Konsistensi jaringan bervariasi
Solusi :
1) Potong blok sampai sejajar
2) Ganti pisau atau pindahkan ke area yang berbedaUbah

42
3) Potong sisa parafin
4) Orientasi blok

Bagian tebal dan tipis :

1) Parafin terlalu lunak untuk jaringan atau kondisi
2) Sudut jarak bebas tidak memadai
3) Mekanisme mikrotom rusak
4) Blade atau blok longgar di pemegang
Solusi :
1) Dingin dengan es atau pasang kembali dalam lilin MP yang lebih tinggi
2) Tingkatkan sudut clearance
3) Pertahankan mikrotom - lumasi dan kalibrasi. Periksa kesalahan yang jelas
dengan mikrotom, bagian-bagian yang mungkin aus
4) Kencangkan blok dan bilah

Bagian tebal dan tipis sejajar dengan tepi pisau :

1) Blade atau blok longgar di pemegangnya
2) Sudut clearance atau kemiringan pisau terlalu curam
3) Jaringan atau parafin terlalu keras untuk dibelah
4) Area kalsifikasi dalam jaringan
5) Dehidrasi berlebihan pada jaringan
6) Pisau tumpul
Solusi :
1) Kencangkan bilah dan penahan blok
2) Kurangi sudut
3) Gunakan cairan pelembut
4) Rehidrasi dan dekalsifikasi permukaanTanamkan
5) 5.kembali dalam parafin segar
6) Ganti atau gunakan area baru blade; juga bersihkan ujung pisau untuk
menghilangkan kelebihan berlebih

Membelah bagian pada sudut kanan ke tepi pisau :

43
1) Torehan pada pisau
2) Partikel keras dalam jaringan
3) Partikel keras dalam paraffin
Solusi :
1) Gunakan bagian pisau yang berbeda atau ganti
2) Jika deposit kalsium - permukaan decal
3) Jika mineral atau partikel lainnya, lepaskan dengan pisau bedah runcing
tajam yang halus pasang

Bagian tidak akan membentuk pita :

1) Parafin terlalu keras untuk kondisi pengelompokan
2) Puing-puing di tepi pisau
3) Sudut salah
Solusi :
1) 1.kembali di parafin titik lelehlebih rendah
2) 2 yang. Bersihkan dengan kain lembab xylene
3) Atur ke sudut optimal

Bagian melampirkan pada blok pada langkah balik Izin :

1) Sudut jarak tidak cukup
2) Puing-puing di tepi pisau
3) Puing-puing di tepi blok
4) Listrik statis pada pita
Solusi :
1) Tingkatkan jarak bebas
2) Bersihkan dengan kain lembab xylene
3) Trim tepi blok
4) Lembapkan udara di sekitar mikrotom; letakkan pelindung statis atau
lembaran pengering di dekat mikrotom

Bagian yang tidak lengkap :

1) Impregnasi jaringan yang tidak lengkap dengan parafin

44
 2) Jaringan yang tidak terpasang dengan benar
3) Bagian dipotong secara dangkal
Solusi :
1) Proses ulang blok jaringan
2) Jaringan yang ditanamkan kembali; pastikan orientasi benar dan jaringan
dalam cetakan
3) Blok ulang wajah, potong lebih dalam ke jaringan

2.5. Pewarnaan Histologi

Dalam literatur pewarnaan histologis, untuk mengatakan komponen

jaringan memiliki afinitas tinggi untuk pewarna mungkin hanya berarti bahwa,
di bawah kondisi penggunaan, komponen menjadi sangat ternoda. Namun
afinitas juga digunakan untuk menggambarkan kekuatan-kekuatan menarik
yang dianggap mengikat pewarna pada jaringan. Ahli kimia fisik
menggunakan istilah afinitas dalam pengertian sebelumnya, dan
penggunaannya diadopsi di sini. Jadi dalam bab ini afinitas menggambarkan
kecenderungan pewarnaan untuk berpindah dari larutan ke bagian. Besarnya
afinitas tergantung pada setiap faktor yang mendukung atau menghambat
gerakan ini. Interaksi noda-jaringan, noda-pelarut, dan noda-noda semua harus
dipertimbangkan, karena memang harus interaksi pelarut-pelarut.Pendekatan
ini awalnya mengasumsikan pewarnaan berlanjut sampai keseimbangan
tercapai, tetapi dalam praktiknya hal ini sering tidak tercapai. Apalagi serapan
pewarna dan pereaksi seringkali multistep, baik dalam ruang maupun
waktu. Suatu reagen pada awalnya dapat memasuki jaringan karena,
katakanlah, daya tarik coulomb. Begitu masuk, ia dapat membentuk ikatan
kovalen dengan beberapa kelompok jaringan. Intensitas pewarnaan juga dapat
dibatasi oleh kelarutan noda dalam lingkungan pelarut dan jaringan. Berbagai
kontribusi untuk afinitas jaringan-noda diuraikan dalam Tabel 2.1 , dan
dibahas di bawah ini.

45
Tabel 2.1. Faktor-faktor yang berkontribusi pada afinitas jaringan pewarna
Interaksi Contoh-contoh praktis di mana faktor itu penting

Interaksi jaringan reagen

Objek wisata Coulomb
Pasukan Van der Waals
Ikatan hidrogen
Ikatan kovalen
Interaksi pelarut-pelarut
Efek hidrofobik
Pewarna asam dan basa, dan pereaksi ionik
lainnya, termasuk garam anorganik. Paling
penting dengan molekul besar seperti pewarnaan
serat elastis, dan produk reaksi akhir seperti
bisformazans dalam enzim histokimia. Pewarnaan
glikogen oleh asam karminat, dan kolagen dengan
Sirius merah. Metode seperti nukleus Feulgen,
PAS, & oranye merkuri untuk tiol

Sistem pewarnaan menggunakan larutan pewarna

Interaksi reagen-reagen atau pereaksi organik lainnya yang mengandung
air; substrat enzim misalnya

Pewarnaan metakromatik dengan pewarna dasar,

pigmen anorganik dalam histokimia enzim tipe
Gomori, peresapan perak

Pewarnaan dipertahankan di jaringan setelah itu dicuci dari pewarnaan

ini terjadi karena noda memiliki afinitas yang sangat tinggi untuk elemen
jaringa n dan / atau afinitas rendah untuk memproses cairan dan media
pemasang, atau paling tidak larut dalam bahan yang terakhir ini dengan
sangat lambat. Untuk menggambarkan poin-poin ini, pertimbangkan beberapa
noda umum. Pigmen seperti biru Prusia yang dihasilkan dalam metode Perls
untuk zat besi, dan sulfida timbal yang diproduksi dalam histokimia enzim
gaya Gomori, adalah hampir tidak larut dalam pelarut standar. Ini juga
berlaku untuk mikrokristal perak dan emas yang dihasilkan oleh impregnasi
logam. Beberapa pigmen organik kurang memuaskan. Jadi, pewarna azo,

46
formazan dan indigo tersubstitusi diproduksi sebagai produk reaksi akhir
dalam histokimia enzim memiliki kelarutan yang rendah dalam air, tetapi
dapat larut dalam media hidrofobik seperti alkohol, xilena, dan
polistirena. Dalam kasus seperti itu media pemasangan hidrofilik digunakan,
dan pewarnaan elemen jaringan yang kaya lipid harus dianggap sebagai
mungkin artifaktual. Kelarutan formazan dan azody kadang-kadang dikurangi
dengan konversi in situ menjadi kompleks logam. Noda kompleks logam
rutin lainnya adalah kompleks aluminium, kromium dan besi hematein, dan
kompleks kromium gallocyanine. Pewarna kompleks logam ini tidak mudah
dihilangkan dari jaringan dengan cairan pemrosesan rutin atau media
pemasangan (lihat di atas). Ini kontras dengan pewarna dasar (kationik) rutin
seperti kristal violet atau biru metilen, yang secara bebas dan cepat larut
dalam alkohol yang lebih rendah. Pewarna asam rutin (anionik), seperti eosin
Y atau jeruk G, sering kurang larut dalam alkohol, karena memang pewarna
basa hidrofilik dengan aromatik yang besar sistem, seperti alcian
blue. Pewarna non-ionik seperti pewarnaan lemak Sudan larut dalam zat-zat
dehidrasi dan pelarut pembersih, dan pada zat-zat penguat resin. Catatan:
struktur pewarna dasar hidrofilik dan lipofilik. Oleh karena itu, bagian yang
diwarnai dengan pewarna dasar rutin harus didehidrasi dengan cepat melalui
alkohol, atau dengan menggunakan pelarut non-alkohol, atau dengan
pengeringan udara, sedangkan dehidrasi kurang penting dengan pewarna
asam. Bagian yang diwarnai dengan asam atau pewarna basa biasanya
dipasang pada media yang tidak berair untuk mencegah ekstraksi
pewarna. Sebagai alternatif, pewarna dapat diimobilisasi, misalnya dengan
pembentukan senyawa koordinasi logam, fosfatungstat atau kompleks
yodium. Pewarna non-ionik harus dipasang di media berair.

a) Factor-faktor Pewarnaan tidak terangkat ke dalam setiap bagian dari

jaringan
1) Jumlah dan kedekatan situs yang mengikat

47
 Kedua faktor ini mempengaruhi pewarnaan. Namun, dengan tidak
adanya penyelidikan kuantitatif, mereka tidak mudah dibedakan - jadi di
sini akan dibahas sebagai efek tunggal. Afinitas dan jaringan-noda jumlah
situs pengikat hadir dalam jaringan dapat bervariasi secara independen.
Pewarna Sudan dapat digunakan sebagai contoh. Ini memiliki afinitas
tinggi untuk lemak tetapi afinitas rendah untuk protein terhidrasi di
sekitarnya. Atau orang dapat mempertimbangkan sistem pewarnaan di
mana kovalen Obligasi terbentuk. Reagen memberikan produk berwarna
hanya dengan kisaran terbatas pengelompokan bahan kimia jaringan. Jadi,
urutan reagen hidrolisis asam-Schiff dari teknik nukleat Feulgen
menghasilkan warna merah turunannya hanya dengan DNA. Pemahaman
sistem pewarnaan sering membutuhkan pertimbangan pola
afinitas. Dengan pasangan pewarna asam-basa asam tradisional (H&E,
Papanicolaou, dan Romanowsky) yang dituntut secara negatif AC
id Pewarna memiliki afinitas tinggi untuk struktur jaringan membawa
muatan kationik (protein, dalam kondisi asam) .Bagaimana
pernah mereka memiliki rendah afinitas untuk struktur membawamuatan
negatif (mereka yang kaya glikosaminoglikan tersulfasi, atau dalam) asam
nukleat fosfat), dengan kebalikannya menjadi basa pewarna. Ini
menghasilkan pola pewarnaan dua nada di mana sitoplasma berbeda
dengan bahan nuklir. Kondisi pewarnaan yang praktis memaksimalkan
afinitas selektif. Pewarna dasar diterapkan dari larutan netral atau asam,
karena dalam kondisi basa protein membawa muatan negatif keseluruhan
dan karenanya juga dapat mengikat pewarna dasar. Afinitas juga
dipengaruhi oleh memvariasikan konsentrasi hadir garam
anorganik. Berbagai aluminium-hematoxylin, misalnya, berbeda secara
substansial dalam hal ini. Metodologi konsentrasi elektrolit kritis
( Scott 1973 ) dan beberapa prosedur empiris lainnya didasarkan pada
kontrol konten elektrolit. Namun, pewarnaan yang membedakan dua
struktur masih mungkin terjadi bahkan ketika afinitas dan jaringan-
noda jumlah situs pengikat noda adalah sama. Ini karena laju pengambilan

48
 reagen, atau laju reaksi selanjutnya, atau tingkat kehilangan reagen atau
produk, mungkin tidak sama dalam dua struktur.
2) Tingkat penyerapan reagen
Metode pewarnaan progresif dapat dikontrol laju, misalnya
pewarnaan musin menggunakan alcian blue atau besi koloid. Selektivitas
membutuhkan periode pewarnaan yang singkat, yang hanya menghasilkan
lendir yang cepat memperoleh warna ( Goldstein 1962 , Goldstein &
Horobin 1974a ). Jika pewarnaan berkepanjangan, bahan baso-philic
tambahan seperti inti dan sitoplasma yang kaya RNA juga bisa
ternoda. Pewarna yang digunakan dengan cara ini adalah sering berukuran
besar, dan karenanya menyebar perlahan, memaksimalkan kontrol yang
dimungkinkan melalui efek tingkat diferensial. Laju reaksi Pewarnaan
selektif oleh reagen reaktif, menghasilkan turunan berwarna, dapat
bergantung pada tingkat diferensial reaksi . Misalnya, asam periodik dapat
mengoksidasi berbagai substrat yang ada di jaringan. Namun,
dalam aplikasi histokimia dari asam periodik.
3) Tingkat kehilangan reagen
Diferensiasi atau pewarnaan regresif melibatkan hilangnya noda
secara selektif dari jaringan. Banyak metode pewarnaan mengeksploitasi
fenomena ini, misalnya pewarnaan lecet otot dengan besi-hematoklin, dan
selubung mielin dengan luxol cepat biru. Dalam prosedur tersebut,
pewarnaan non selektif awal diikuti dengan ekstraksi dalam
pelarut. Pewarna pertama kali hilang struktur permeabel seperti serat
kolagen. Struktur yang relatif tidak tembus cahaya seperti pita otot A dan
Z, dan selubung mielin, mempertahankan noda paling lama. Kontrol laju
kehilangan reagen sangat penting dalam metodologi yang sangat berbeda,
yaitu pewarnaan perak serabut saraf.Selama langkah impregnasi, perak ion
mengikat secara selektif ke banyak kelompok jaringan. Selanjutnya,
jaringan diperlakukan dengan pengembang yang mampu mengurangi
kation perak menjadi logam perak. Laju reaksi dengan zat pereduksi ini
sangat penting. terlalu cepat, karena konsentrasi tinggi atau reaktivitas

49
 tinggi reagen, butir perak disimpan secara non-selektif di seluruh
jaringan. Jika reduksi terlalu lambat, pewarnaan tidak terjadi karena
sebagian besar ion perak berdifusi ke dalam pelarut sebelum
berkurang. Pewarnaan selektif terjadi ketika ion perak berdifusi dari latar
belakang dengan cepat, ditahan dalam entitas yang kurang permeabel
(misalnya, serabut saraf, nukleolus, sel darah merah) di mana mereka
kemudian berkurang ( Peters 1955a, 1955b ).
4) Metakromasia dan fenomena terkait
Ketika baik afinitas maupun laju tidak mengontrol pola pewarnaan,
pewarnaan selektif masih dapat diperoleh. Misalnya pewarna dasar seperti
metilen biru dan toluidin biru diserap oleh berbagai substrat basofilik
dalam jaringan. Noda kromatin berwarna ortokromatik biru, tetapi matriks
tulang rawan, butiran sel mast, dan noda lendir berwarna metakromatik
kemerahan ungu (ditinjau oleh Pearse 1968 ) karena pembentukan agregat
pewarna di situs yang kaya polianion ini.

b) Efek pewarnaan sebelum modifikasi

1) Efek fiksasi
Fiksasi dilakukan untuk mencegah hilangnya jaringan konstituen
menjadi solusi pemrosesan dan pewarnaan, dan untuk mengurangi
perubahan morfologis jaringan postmortem. Fiksasi mengubah
komponen jaringan larut menjadi turunan yang tidak larut, tahan
terhadap autolisis atau serangan oleh bakteri dan jamur. Untuk akun
umum fiksasi, lihat Bab 4; di sini hanya pengaruh pewarnaan yang
dibahas. Zat yang diberikan sering disimpan pada batas yang berbeda
oleh agen fiksatif yang berbeda, dan tidak ada yang bisa ternoda yang
tidak ditahan. Sebagai contoh, banyak lipid yang diawetkan dengan
baik setelah fiksasi dalam osmium tetroxide atau dichromate,
diawetkan dengan buruk setelah formalin, dan secara aktif diekstraksi
selama fiksasi alkohol atau aseton. Pewarnaan lemak setelah fiksasi
alkohol Karena itu tidak efektif.

50
 Fiksasi memiliki pengaruh yang lebih halus pada pola pewarnaan,
yang, pewarna asam dan basa memberikan contoh instruktif. Seperti
yang ditunjukkan oleh Singer (1952) , pewarnaan seperti itu umumnya
ditingkatkan oleh protein denaturasi diproduksi oleh fiksatif. Selain itu
keseimbangan acidophilia-basophilia dari suatu jaringan juga
dipengaruhi. Jadi formalin dan osmium tetroxide biasanya mengurangi
acidophilia jaringan, sedangkan larutan acidic dichromate biasanya
meningkatkan acidophilia jaringan ( Baker 1958 ).
2) Efek pemblokiran dan ekstraksi histokimia
Masalah analog muncul selama ekstraksi enzim ketika jejak
pengotor enzim hadir. Polisakarida juga dapat hilang dengan solvolisis
kimia selama 'metilasi' jaringan asam oleh metanol-HCl, dan DNA dan
RNA diekstraksi oleh asetat anhidrida-piridin yang digunakan untuk
memblokir histones nuklir. Memang bahan bisa diekstraksi dengan
larutan pewarnaan, terutama jika bersifat asam atau basa atau ketika
jaringan tidak terpasang dengan baik.
Selain efek kimia yang sempit ini, semuanya prosedur tersebut
memodifikasi sifat fisik a bagian jaringan, seperti
permeabilitasnya. Setelah terpapar pada agen pembengkakan atau
protease, jaringan dapat menodai lebih cepat: misalnya, nuklei dapat
ternoda oleh alcian blue dan sitoplasma oleh zat pewarna 'kolagen' dari
pewarnaan trichrome.

c) Efek geometris pada pewarnaan

1) Pengaruh geometris sederhana
Dalam sistem dengan mekanisme pewarnaan yang dikendalikan
laju, efek seperti itu dapat mengganggu selektivitas. Beberapa noda
trikoma memerlukan waktu pewarnaan yang lebih pendek dengan
cryosections daripada dengan bagian parafin,
sebaliknya cryosections menjadi berlebihan oleh T he lebih
tinggi ionik berat pewarna.

51
 2) Efek yang lebih kompleks dari geometri spesimen
Geometri kompleks juga muncul pada sediaan apus. Misalnya,
apusan dari epitel sering mengandung gumpalan sel multisel
serta dispersi monoseluler. Sel di pusat gumpalan seperti itu kurang
dapat diakses oleh noda sel perifer. Konsekuensinya, dalam tingkat
yang dikendalikan metode seperti noda Papanicolaou dan
Romanowsky , sel-sel yang terletak di pusat dapat dilebih-lebihkan
oleh zat pewarna terkecil, seperti yang diilustrasikan olehBoon
dan Drijver (Pelat 6.4 dan 24.4; 1986 ).

d) Efek resin pada pewarnaan

1) Resin sebagai eksklusi noda
Resin biasanya menginfiltrasi spesimen biologis secara tidak
merata, dengan struktur padat atau hidrofilik yang kurang terinfiltrasi. Ini
karena bahkan sistem resin 'larut dalam air' atau 'viskositas rendah'
menggunakan monomer yang sedikit lipofilik dan cukup
kental. Konsekuensi dari infiltrasi resin yang tidak merata adalah
kompleks. Misalnya, dalam spesimen yang tertanam glikol metakrilat,
struktur seperti butiran sekresi padat sering disusupkan dengan buruk,
sehingga mereka dapat bebas resin dan mudah ternoda. Jika sitoplasma di
sekitarnya lebih baik diinfiltrasi dengan resin, akibatnya butiran dapat
menonjol lebih jelas dan renyah daripada di bagian parafin.
2) Resin sebagai pengikat warna
Glikol metakrilat, unsur utama dari banyak kit penyematan resin
mikroskopis cahaya, menunjukkan artefak pengikat zat warna lain, yaitu
pengikatan 'tidak dapat dipulihkan' dari pewarna tertentu. Ini muncul
dengan pewarna berukuran sedang, misalnya aluminium hematoxylin atau
eosin. Ini dapat memasuki resin dan memodifikasi struktur polimer,
membuatnya lebih permeabel. Efek antiplastik ini menjebak pewarna,
meskipun terkadang dapat dihilangkan dengan membedakan pelarut
dengan aksi plastisisasi, seperti etanol.

52
e) Masalah pada pewarnaan
1) Masalah tentang prosedur pewarnaan
 Noda yang digunakan harus kompatibel dengan media fiksatif dan
sematan. Contoh kasus : bagian resin yang larut dalam air tidak
memungkinkan pewarnaan serat elastis selektif dengan fuchsin
aldehida.
 Gunakan protokol pewarnaan rutin, lebih disukai yang
terstandarisasi. Tip : lihat daftar protokol tersebut di belakang Horobin
dan Bancroft (1998) .
 Gunakan kontrol untuk mendeteksi masalah secara proaktif, bukan
hanya untuk menyelidiki kesalahan secara retrospektif. Kiat : simpan
sampel kumpulan noda yang efektif untuk digunakan saat Anda
mencurigai kemurnian noda yang tidak memadai.
 Pertimbangkan apakah Anda memiliki keterampilan dan pengetahuan
yang diperlukan atau, jika tidak, apakah seorang mentor
tersedia? Tip: banyak noda perak yang rumit; mengharapkan masalah
dengan penggunaannya.
2) Masalah tentang pewarnaan reagen
 Dapatkan noda dan reagen yang andal. Kiat : gunakan pewarna
bersertifikat Komisi Biologis , karena pewarna tersebut rata-rata lebih
tidak murni sementara tidak lebih mahal.
 Pastikan noda tetap andal. Tip : simpan reagen Schiff dalam wadah
kedap gas; simpan larutan pewarna dalam wadah kedap cahaya.

f) Cara mengenali kesalahan

1) Solusi pewarnaan atau pewarnaan tidak sesuai dengan harapan warna,
kelarutan, atau stabilitas. Kasus contoh : beberapa sampel biru alcian
larut, tetapi kemudian mengendap dari larutan dalam waktu satu jam
atau kurang.

53
2) Struktur yang diharapkan ternoda, tetapi hanya lemah. Contoh kasus :
pewarnaan kalsium yang tak terduga oleh alizarin red S hasil dari
ekstraksi ion kalsium jaringan menjadi fiksatif berair.
3) Warna pewarnaan tidak terduga. Contoh kasus : pewarnaan merah
berlebihan yang terlihat dengan trikoma Gomori mungkin timbul dari
larutan pewarnaan yang kurang asam.
4) Noda struktur yang tidak terduga. Contoh kasus : bahan granular yang
diwarnai oleh prosedur inti Feulgen mungkin merupakan endapan
karbonat.
5) Sifat pewarnaan tidak biasa. Contoh kasus : jika pewarnaan diferensial
dari organisme Gram positif dan negatif buruk, sediaan mungkin terlalu
tebal.
6) Dan selalu ada masalah lain ! Contoh kasus : hilangnya bagian-bagian
dari slide dalam metode perak Grocott hexamine untuk jamur,
karena terlalu panas; dan endapan hitam pada slide dan bagian dalam
prosedur Von Kossa, karena peralatan gelas yang terkontaminasi.
Setelah kesalahan diketahui, dan penyebab yang masuk
akal diidentifikasi, solusinya dapat dicari. Ini adalah terkadang
sederhana. Mungkin situasi paling sulit muncul ketika pewarnaan
spesimen disiapkan di laboratorium lain . Sekali lagi
berbagai saran pemecahan masalah praktis , untuk berbagai noda
histopatologi rutin dan khusus, diberikan dalam Horobin dan Bancroft
(1998) .

54
 BAB III
PENUTUP

3.1. Kesimpulan

Perawatan mikroskop pastikan bahwa bagian optik bersih, dan

bebas dari debu. Sidik jari dan debu berminyak adalah musuh kaca optik.
Penggunaan xylene untuk mencuci lensa paling baik dilakukan. Alkohol
dan aseton harus dihindari karena dapat meresap melarutkan semen. Lensa
sulit dibersihkan karena bentuknya yang cekung. Semua fiksatif yang
banyak digunakan dipilih dengan kompromi; aspek baiknya
diseimbangkan dengan fitur yang kurang diinginkan. Tujuan utama fiksasi
dalam patologi adalah untuk mempertahankan fitur morfologis yang jelas
dan konsisten.
Pemrosesan jaringan dirancang untuk menghilangkan semua air
yang dapat diekstraksi dari jaringan. Menggantinya dengan media
pendukung yang memberikan kekakuan yang cukup untuk memungkinkan
pemotongan jaringan tanpa kerusakan parenkim atau distorsi. Mikrotomi
adalah cara jaringan dipotong dan dilekatkan ke permukaan untuk
pemeriksaan mikroskopis lebih lanjut. Dalam literatur pewarnaan
histologis, untuk mengatakan komponen jaringan memiliki afinitas tinggi
untuk pewarna mungkin hanya berarti bahwa, di bawah
kondisi penggunaan, komponen menjadi sangat terwarnai.

3.2. Saran

Diharapkan agar para teknisi laboratorium selalu memahami cara

pembuataan sediaan histologi baik dari peralatan ataupun prosesnya.

55
 DAFTAR PUSTAKA

D.Bancrof,dkk.2013. Bancrof Theori and Practice of Histologi Techniques.

China:Evensier Limited

56