Rekayasa Genetika

Sedehana Pada Bakteri

Kelompok 4:
Nanda Adjeng
Nyoman Keisha
Victor Jonathan
Vidya Adnina
 TABLE OF CONTENTS

01
Fitur-Fitur Plasmid
02
Exon,Intron
Secara umum dan secara Deskripsi umum, alasan
khusus pada plasmid pGEX- produksi cholesterol oxidase
6P-1 secara rekombinan

03
Proses-Proses dalam
Kloning DNA
Cut, ligation, transformasi,
pemurninan plasmid DNA
04
Metode Kloning DNA
Kloning gen ke plasmid pGEX-6P-1,
kriteria pemilihan enzim restriksi dan enzim
yang dipilih, bp sequence hasil PCR
TEORI DASAR
PLASMID
 Plasmid

■ DNA ekstrakromosomal pada bakteri

■ Berukuran kecil dan berbentuk sirkular
■ Mampu mereplikasi diri sendiri
(autonomous replication)
■ Fungsi: pembawa sifat non-esensial
bagi pertumbuhan bakteri
■ Umumnya memiliki gen pembawa
sifat resistensi terhadap antibiotik

Gambar 1. Plasmid E.coli pBR322

(sumber: mikrobio.net)
Cholesterol
Oxydase
 Cholesterol Oxydase

■ Mengkatalisis oksidasi kolesterol menjadi kolestenon (4-kolesten-3-one)

■ Reaksi yang terjadi:

■ Tergolong enzim oksidoreduktase

■ Diproduksi oleh bakteri patogenik dan patogenik seperti
Mycobacterium, Brevibacterium, Streptomyces, Corynebacterium
■ Aplikasi: biosensors, insektisida, sintesis steroid
 MENGENAL
EKSON INTRON
 EKSON

■ Ekson adalah sekuens nukleotida dalam DNA dan RNA yang

dikonservasi dalam pembuatan mature RNA
■ Transkripsi: Proses dimana DNA digunakan sebagai templat untuk
membuat mRNA
■ mRNA kemudian bekerja bersama dengan ribosom dan mentransfer RNA
(tRNA), keduanya ada dalam sitoplasma, untuk membuat protein dalam
proses yang dikenal sebagai translasi.
■ Ekson biasanya mencakup daerah mRNA 5’ dan 3’ yang tidak
diterjemahkan, mengandung kodon start dan stop, di samping urutan
pengkodean protein
 INTRON

■ Intron adalah urutan nukleotida dalam DNA dan RNA yang tidak
secara langsung mengkode protein
■ Intron dihapus selama tahap prekursor messenger RNA (pre-
mRNA) dari pematangan mRNA dengan RNA splicing
■ Intron dapat berkisar dari 10 pasang basa hingga 1000 pasang
basa
■ Dapat ditemukan di berbagai gen yang menghasilkan RNA di
sebagian besar organisme hidup, termasuk virus
 4 JENIS INTRON

■ Intron dalam gen pengkode protein, dihilangkan oleh spliceosom

■ Intron pada gen tRNA, yang dihilangkan oleh protein
■ Self-splicing Introns, yang mengkatalisis penghilangan mereka
sendiri dari prekursor mRNA, tRNA, dan rRNA menggunakan
guanosine-5'-trifosfat (GTP), atau kofaktor nukleotida lainnya
(Grup 1)
■ Self-splicing Introns, yang tidak memerlukan GTP untuk
menghilangkan mereka sendiri (Grup 2)
 PENTINGNYA PENGHILANGAN INTRON

■ Setiap nukleotida intron yang tersisa,

atau penghapusan nukleotida ekson,
dapat menyebabkan salah
memproduksi protein
■ Penghapusan intron yang tidak tepat
dengan demikian dapat
mengakibatkan frameshift, yang
berarti bahwa kode genetik akan
dibaca secara tidak benar.

Gambar 2. cDNA
(Sumber: Human Biochemistry. 2018)
PROSES DALAM
CLONING
PLASMID DNA
 MEKANISME

Digestion Transformation
(Cutting)

1 3

2 4

Ligation Purification
 1. DIGESTION (CUTTING)

■ Menyiapkan restriction digests untuk insert (atau donor plasmid) dan

plasmid backbone. Restriction digests adalah sekelompok enzim yang
disebut dengan enzim restriksi yang digunakan untuk memotong DNA.

■ Dalam proses ini, yang dibutuhkan adalah enzim sesuai dengan jumlah
yang dibutuhkan, larutan buffer, air distilasi, serta DNA yang ingin
dipotong. Temperatur dari campuran biasanya dijaga pada 37 °C.
 1. DIGESTION (CUTTING)

■ Enzim restriksi dapat menghasilkan ujung

potongan yang berbeda

■ Sticky ends memiliki “overhangs” pada ujung 3’

dan 5’ yang berguna pada proses ligase.
Contoh enzim yang menghasilkan sticky ends
adalah EcoRI.
Gambar 3. Sticky Ends vs Blunt Ends
■ Blunt ends memotong secara lurus dan tidak (sumber: khanacademy.org)

menghasilkan overhangs, dan lebih sulit untuk

diligasi. Contoh enzimnya adalah SmaI.
 2. LIGATION

■ Ligasi DNA adalah penyatuan 2 molekul DNA oleh enzim yang

disebut enzim DNA ligase. DNA ligase menyambungkan DNA
dengan menyambungkan tulang punggung fosfat pada
nukleotida. Reaksi ini menggunakan ATP sebagai kosubstrat.

■ Reaksi ligasi pada standard DNA terjadi dalam 3 langkah

 2. LIGATION

1. Kelompok adenylyl dari ATP secara kovalen

melekat pada ligase dan fosfat anorganik
dilepaskan. Terbentuk kompleks enzim-
AMP.

2. Kelompok adenylyl ditransfer dari ligase ke

5’ fosfat pada DNA.

3. Ikatan fosfodiester terbentuk ketika ujung

3’-OH menyerang 5’ fosfat yang diaktifkan.
AMP dilepaskan dalam proses.
Gambar 4. Tahap ligation
(sumber: LJ Cseke et al. 2011)
 3. TRANSFORMATION

■ Transformasi adalah proses memasukkan DNA asing (plasmid) ke dalam

sel bakteri. Proses ini memerlukan beberapa tahap:

1. Bakteri yang telah disiapkan dicampurkan dengan DNA dari ligasi.

2. Bakteri-bakteri diberikan heat shock: campuran bakteri dan DNA
plasmid rekombinan didinginkan dalam waktu yang lama dan
kemudian langsung dipanaskan dengan segera pada suhu 42oC
sehingga pada membrannya terbentuk pori-pori dan menjadi lebih
permeable terhadap plasmid sehingga plasmid dapat masuk ke
dalam sebagian bakteri.
 3. TRANSFORMATION

3. Plasmid yang digunakan untuk

cloning memiliki gen resistan
antibiotic. Bakteri-bakteri
diletakkan di atas antibiotic plate
untuk seleksi.

4. Bakteri tanpa plasmid mati, dan

bakteri yang mengandung
plasmid membentuk koloni- Gambar 5. Tahap Transformation
(sumber: khanacademy.org)
koloni.
 4. PURIFICATION

■ Pemurnian plasmid adalah teknik yang digunakan untuk mengisolasi dan

memurnikan DNA plasmid dari DNA genom, protein, ribosom, dan dinding sel
bakteri.
■ Dipilih 3-10 koloni dan dikultur semalaman untuk pemurnian DNA. Dalam
pemurnian ini, pada bakteri dilakukan lisis; ditambahkan bahan kimia untuk
mengendapkan DNA genomik dengan berat molekul tinggi; sisa DNA plasmid
disaring melalui kolom yang mengendapkan plasmid dan meloloskan bahan lain;
dan, akhirnya, secara selektif mengelusi DNA plasmid dari kolom menggunakan
buffer tertentu atau air.
4. PURIFICATION

Gambar 6. Proses Purifikasi Plasmid

(sumber: addgene.org)
Teknologi DNA
Rekombinan
 Teknologi DNA Rekombinan

■ Teknik penggabungan DNA dari spesies yang berbeda sehingga akan

diperoleh organisme baru dengan sifat-sifat yang diinginkan
■ Melibatkan penyisipan informasi genetik baru ke dalam organisme,
biasanya bakteri, untuk memberikan kemampuan baru.
■ Pemilihan metode bergantung kepada gen mana yang akan dipindahkan
dan jenis organisme yang akan menerima informasi genetik baru.
■ Contoh penggunaan teknologi DNA rekombinan yang telah berhasil
dilakukan adalah kloning gen protease Bacillus stearothermophillus
DSM297 ke dalam Escherichia coli DH5 alfa
VISUALISASI
PROSES
CLONING
■ Pada setiap langkah proses kloning, apa yang terjadi pada molekul DNA
di tabung reaksi dapat dipantau menggunakan elektroforesis gel.

■ DNA dimuat pada gel dan diberikan arus listrik. Karena DNA bermuatan
negatif, ia akan bergerak dalam gel menuju kutub positif.

■ DNA bermigrasi atau bergerak dalam arus listrik berdasarkan ukuran

dan bentuk. Semakin besar molekul DNA, semakin lambat bergerak.
Semakin supercoiled sepotong DNA, maka akan lebih cepat bergerak.
Gel yang biasa digunakan adalah agarose.
■ Setelah DNA terpisah dalam gel, gel direndam
dalam larutan ethidium bromide supaya dapat
berfluoresens saat disinarkan dengan sinar
UV.

■ Setiap band terdiri dari molekul-molekul DNA

yang mirip dalam bentuk dan ukuran.
Supercoiled DNA bermigrasi sangat cepat
dalam gel agarose. Open circles bermigrasi
lebih lama, dan DNA linear paling lambat.
Gambar 7. Diagram Gel Agarose Setelah Elektroforesis
Sumber: LJ Cseke et al. 2011
 Analisis
Restriction
Digest
 Restriction Digest Analysis

• Analisis Restriction Digest: membandingkan expected dengan experimental result

Nicked DNA

Supercoiled DNA

Gambar 8. Restriction Digest Analysis

(Sumber: addgene.org)
DESAIN PRIMER
UNTUK PCR
 FITUR PENTING DESAIN PRIMER
Primer PCR untuk cloning molekuler: Dengan pemilihan Restriction Site
■ Leader Sequence : Pasangan basa menggunakan Addgene’s
ekstra pada ujung primer 5’ Sequence Analyzer, akan
membantu pencernaan enzim
diketahui enzim restriksi apa yang
restriksi (biasanya 3-6 bp)
dimilki gen tsb. Dan dicocokkan
■ Restriction Site : Situs pembatasan
yang dipilih untuk cloning (biasanya dengan plasmid penerima
6-8 bp). (Multiple Cloning Site)
■ Hybridization : Bagian primer yang
mengikat urutan yang akan
diamplifikasi (biasanya 18-21 bp).
Gambar 9. Penggunaan EcoRI dan NotI dalam Primer
(Sumber: addgene.org)
 FITUR PENTING DESAIN PRIMER

Pembuatan Forward primer Pembuatan Reverse primer

■ Menggunakan urutan 5’ ke 3’ untuk ■ Mengambil 18 urutan basa
bagian yang mengikat ORF. terakhir ORF termasuk kodon stop
■ Kemudian menambahkan restriction (TGA)
site, misal EcoRI (GAATTC) ke ujung ■ Menambahkan, misal Notl
5’ primer. (GCGGCCGC) dan kemudian
■ Menambahkan 3-6 basa upstream TAAGCA untuk meningkatkan
pada restriction site untuk pencernaan enzim restriksi.
meningkatkan efisiensi pemotongan. ■ Kemudian mencari reverse
■ Memastikan bahwa urutan basa complement dari urutan basa
tersebut tidak membentuk struktur tersebut kemudian didapatkan
hairpin pada primer yang dibuat. reverse primer
Jenis Enzim
Restriksi
Macam-Macam Enzim Restriksi

Gambar 10. Macam Macam Enzim Restriksi

(sumber: researchgate.net)
 Macam-Macam Enzim Restriksi
■ Type I : memotong DNA pada restriction site yang jauh dari recognition site,
membutuhkan ATP dan adomet sebagai kofaktor, memiliki fitur metilasi dan
restriction digest
■ Type II : memotong DNA pada situs berjarak spesifik dari tempat pengenalan
(palinadromik) dan membutuhkan magnesium, memiliki fitur restriction digest
■ Type III : mengenali 2 sekuens non-palindromik yang terpisah dan berorientasi
terbalik serta memotong DNA pada jarak 20-30 pasangan basa dari tempat
pengenalan. mengandung lebih dari 1 subunit dan membutuhkan ATP untuk
restriction digestion serta adomet untuk metilasi DNA
■ Type IV : mengenali modifikasi DNA (methylated, hydroxymethylated, dan
glucosyl-hydroxymethylated).
SOAL DAN
JAWABAN
 1
Jelaskan fitur-fitur yang terdapat di dalam
plasmid? Bagaimana dengan fitur plasmid
yang terdapat pada pGEX-6P-1?
 FITUR PLASMID

Gambar 1.1 Fitur Plasmid Secara Umum

(sumber: ib.bioninja.com.au)
 FITUR PLASMID
VECTOR ELEMENT DESKRIPSI

Origin Of Replication Origin of replication adalah lokasi spesifik di

(ORI) untai DNA dimana replikasi dimulai

Antibiotic Resistance Mendeteksi bakteri yang mengandung plasmid,

Gene memberikan bakteri-bakteri itu tekanan untuk
menjaga plasmid

Urutan pendek DNA yang terdiri dari beberapa situs

Multiple Cloning Site untuk pembelahan oleh enzim restriksi.
(MCS) Memungkinkan penyisipan DNA yang mudah melalui
ligasi atau restriksi enzim restriksi

Insert Insersi gen, promoter, atau DNA fragmen yang akan

di cloning
 FITUR PLASMID
VECTOR ELEMENT DESKRIPSI

Promoter Region Mendorong transkripsi gen target. Komponen

vital untuk vektor ekspresi: menentukan jenis
sel gen mana yang diekspresikan dan jumlah
protein rekombinan yang diperoleh

Selectable Marker Memungkinkan eksperimen untuk mengidentifikasi

sel-sel bakteri yang telah mengambil plasmid selama
proses transformasi

Sekuens pendek DNA pada untai tunggal yang

Primer Bindind Site biasanya digunakan untuk keperluan amplifikasi PCR
atau sekuensing DNA
FITUR PLASMID PADA pGEX-6P-1

Gambar 1.2 Fitur Plasmid pGEX-6P-1

(sumber: snapgene.com)
 2
Apa itu exon dan intron? Apakah exon dan intron
terdapat pada sequence DNA diatas? Mengapa
ilmuwan ingin memproduksi cholesterol oxidase
secara rekombinan?
 Ekson dan Intron

■ Ekson adalah sekuens nukleotida dalam DNA dan RNA yang

dikonservasi dalam pembuatan mature RNA yang mengandung
urutan pengkodean protein

■ Intron adalah urutan nukleotida dalam DNA dan RNA yang tidak
secara langsung mengkode protein dan dihapus saat pembuatan
mRNA dengan splicing
 Ekson dan Intron

■ Dalam soal pemicu, gen penyandi enzim

cholesterol oxidase yang digunakan adalah
cds atau complete cDNA sequence dari
mRNA
■ Dari gambar 2.1 terlihat bahwa cDNA
merupakan sekuens DNA yang tidak memiliki
intron, dan ekson yang sudah digabungkan
■ Dari website blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
didapatkan bahwa enzim cholesterol oxidase
berasal dari organisme bakteri prokariotik
Streptomyces virginiae, yang artinya DNA
keseluruhan tidak memilki ekson maupun
Gambar 2.1 cDNA Making
intron (sumber: https://www.addgene.org/)
 Pemilihan Metode Rekombinan

■ Produksi enzim cholesterol oksidase secara rekombinan

dipilih karena manfaat kloning secara rekombinan yang
dapat memperoleh produk gen tertentu dalam waktu lebih
cepat dan jumlah lebih besar dibandingkan produksi
konvensional biasa
■ Misalnya: Vaksin, bioinsektisida, hormone insulin
 3
Bagaimana proses cut, ligation, transformasi, dan
pemurnian plasmid DNA dapat dilakukan?
 CUTTING

■ Cutting dilakukan menggunakan enzim restriksi. Dalam proses ini, yang

dibutuhkan adalah enzim sesuai dengan jumlah yang dibutuhkan, larutan buffer,
air distilasi, serta DNA yang ingin dipotong. Bahan-bahan dicampurkan pada
tabung reaksi dan temperatur dijaga pada 37 °C.

■ Pemilihan enzim disesuaikan dengan restriction site. Pada contoh di bawah ini
EcoRI mengenali daerah dengan sekuens GAATTC

Gambar 3.1 Tahap Cut (Digestion) Pada Proses Cloning

(sumber: https://www.addgene.org/)
 LIGATION

■ Ligasi DNA dilakukan pada tabung reaksi berisi DNA vektor, DNA insert,
buffer ligase, enzim DNA ligase, serta H2O. Tabung diinkubasi selama dua
jam pada suhu kamar.
■ Proses ligasi antar DNA standard telah dijelaskan di bagian teori dasar
■ Berikut adalah proses ligasi DNA pada plasmid
 LIGATION

Ligase DNA pada plasmid:

1. DNA mixture diberi T4 ligase → berbagai kombinasi
hasil ligasi mungkin terjadi seperti penyambungan
antar vektor dengan vektor, vektor dengan vektor lain,
ataupun penyambungan vektor dengan DNA inseret.
2. Penambahan enzim alkaline phosphatase untuk
menghilangkan 5′-phosphate groups dari plasmid
DNA sehingga tidak terbentuk produk yang tidak
diinginkan
3. T4 ligase menyatukan single-stranded nicks dengan
nukleotida yang berdekatan dalam rantai DNA
4. Kelompok adenylyl dari ATP secara kovalen melekat
pada ligase dan fosfat anorganik dilepaskan. Gambar 3.2 Tahap Ligation
Terbentuk kompleks enzim-AMP. (sumber: biologydiscussion.com)
 LIGATION

Ligase DNA pada plasmid:

5. Kelompok adenylyl ditransfer dari ligase ke 5’ fosfat
pada DNA.
6. Ikatan fosfodiester terbentuk ketika ujung 3’-OH
menyerang 5’ fosfat yang diaktifkan. AMP dilepaskan
dalam proses.
7. Nicks yang terbentuk akan disegel/dihubungkan
dengan DNA ligase sel inang

Gambar 3.2 Tahap Ligation

(sumber: biologydiscussion.com)
 TRANSFORMATION

Transformasi dilakukan untuk memasukkan fragmen DNA ke sel

inang. Terdapat beberapa cara, diantaranya:

Heat shock Elektroporasi

Bakteri diberikan heat shock
untuk membentuk pori-pori
sehingga DNA plasmid dapat
masuk ke dalam bakteri
seperti pada teori dasar.
Aliran listrik bertegangan
tinggi menembus membran
sel bakteri dan merusak
lapisan lipid sehingga DNA
plasmid dapat masuk.
 TRANSFORMATION

Chemical Transformation/Heat Shock

1. Mengambil bakteri dari freezer bersuhu −80℃
2. Mensuspensikan bakteri dan DNA dalam tube polypropylene berisi 𝐶𝑎𝐶𝑙2 sebagai
penetral (DNA dan bakteri umumnua bermuatan negatif)
3. Menginkubasi pada es selama 5-30 menit agar terjadi thawing pada bakteri
4. Meletakkan campuran DNA dan bakteri pada water bath bersuhu 42℃ selama 30-45
detik → terbentuk pori-pori pada membran (permeabel) sehingga DNA masuk
5. Meletakkan kembali pada es selama 2 menit agar tidak terjadi kerusakan pada sel

Gambar 3.3 Heat Shock

(sumber: thermofischer)
 TRANSFORMATION

Electroporation
• Tahapan sama dengan heat shock
• Menggunakan electroporator
• Memindahkan suspensi bakteri dan DNA ke dalam kuvet elektroporasi → memasukkan
ke electroporator dengan daya tertentu (ex: 15 kV/cm)
• Kejutan listrik menginduksi terbentuknya pori-pori sementara pada membrane sehingga
DNA dapat masuk

Gambar 3.4 Electroporation Electric Field Gambar 3.5 Tahap Electroporation

(sumber: socmucimm.com) (sumber: thermofischer)
 PURIFICATION

• Berbagai metode pemurnian plasmid diantaranya adalah boiling lysis,

lysis with detergent, mechanical lysis, alkaline lysis, dan enzimatic
digestion.
• Metode yang paling banyak digunakan adalah alkaline lysis sebagai
berikut

Menyiapkan kultur bakteri E. coli yang diinkubasi dalam suhu 37 C dan

dalam waktu 1 malam.
Mengambil 8 ml bakteri dalam kultur cair dengan menggunakan
mikropipet dan memasukkan ke dalam tabung Eppendorf 15 ml

Menambahkan NaOH untuk melisiskan membran

Menambahkan Kac untuk menetralkan

Memisahkan lysate dengan sentrifugasi atau filtrasi dan diperoleh

supernatant berisi plasmid DNA
 PURIFICATION

Gambar 3.6 Alkaline Lysis Purification

(sumber: thermofischer)
 4
Jelaskan metode kloning DNA ke bakteri yang anda ketahui?
Bagaimana melakukan kloning gen ke plasmid pGEX-6P-1? Apa
kriteria pemilihan enzim restriksi yang dipakai untuk melakukan
kloning? Apa enzim restriksi yang akan kalian gunakan? Berapa
bp sequence DNA yang dihasilkan dari hasil PCR nya?
Metode
Kloning
 Restriction-Recombination Cloning

• Metode kloning klasik menggunakan enzim restriksi

• Memotong double-stranded DNA menjadi fragmen DNA yang
mengandung 3’ atau 5’ single-strand overhangs (sticky ends) atau blunt
ends
• Dua potongan DNA yang memiliki overhangs yang saling
berkomplemen ataupun blunt-ended yang berkomplemen dapat
difusikan menjadi satu melalui reaksi ligase
• Keuntungan:
- Relatif lebih ekonomis dibandingkan metode lain
- Enzim dapat memilih sekuens DNA target secara spesifik
- Hasil akhir yang diinginkan dapat diprediksi
- Mampu menghasilkan GOI secara cepat dalam jumlah banyak
 Restriction-Recombination Cloning
• Tahapan:
1. Memilih Gene of Interest (GOI) pada DNA dan enzim restriksi
yang sesuai dengan restriction site pada DNA dan plasmid.
2. Melakukan restriction digest pada DNA dan plasmid
3. Memasukkan DNA hasil restriksi ke agarose gel dan
melakukan purifikasi gel untuk mengisolasi DNA.
4. Melakukan ligasi DNA untuk menggabungkannya pada
plasmid.
5. Melakukan diagnosa akhir hasil ligasi menggunakan agarose
gel
6. Melakukan transformasi sel (memasukkan plasmid ke sel
inang) Gambar 4.1 Metode Kloning dengan
7. Mengecek koloni bakteri dengan PCR atau DNA sequencing Enzim Restriksi dan Rekombinan
(Sumber: pathwayz.org)
8. Memurnikan DNA
 Isothermal Cloning (Gibson Assembly)

• Memanfaatkan fungsi 3 enzim: 5’ eksonuklease, polimerase, dan ligase

• Dilakukan pada 1 tube secara isotermal
• 5’ eksonuklease → mencerna ujung 5’ dari fragmen double-stranded DNA,
menghasilkan 3’ single-stranded overhangs
• Polimerase → mengisi sisa daerah dari single-stranded DNA dengan basa
yang sesuai
• Ligase → melakukan fusi menjadi fragmen DNA yang seutuhnya
• Keuntungan:
- Fragmen DNA dengan overhangs yang tepat dapat diligasi ke tulang punggung
plasmid
- Dapat menggabungkan lebih dari 1 fragmen DNA
- Efisien dilakukan pada vektor apapun dalam waktu kurang dari 2 jam
 Isothermal Cloning (Gibson Assembly)
• Tahapan:
1. Mendesain plasmid dan primer (4 primers) sesuai
yang diinginkan
2. Membuat segmen DNA dengan PCR
3. Melakukan pengecekan dengan agarose gel. Jika
terdapat banyak produk yang tidak diinginkan, maka
perlu dilakukan purifikasi DNA.
4. Melakukan kombinasi segmen dalam satu tabung
reaksi menggunakan Gibson Cloning Master Mix yang
terdiri atas:
- T5 Exonuclease
- Phusion DNA Polymerase
- Taq DNA Ligase
5. Menginkubasi selama 1 jam pada suhu 500 𝐶
Gambar 4.2 Metode Isothermal
6. Melakukan transformasi DNA dan screening Cloning
plasmid dengan analisis Restriction Digest (Sumber: addgene.org)
7. Pemurninan DNA
 Ligation Independent Cloning

• Memanfaatkan aktivitas dari T4 DNA polimerase untuk membuat 5'

overhangs pada vektor dan fragman DNA insert
• Dengan adanya dNTP bebas tunggal, T4 polimerase akan berfungsi
sebagai eksonuklease sampai ada satu basa yang merupakan
komplemen dari nukleotida bebas
• T4 akan melakukan aktivitas polimerase, menambah kembali basa
bebas hingga usai
• Komplemen dari overhang dibuat dalam bentuk primer PCR untuk insert,
berdasarkan sekuens target vektor dan situs restriksi
 Ligation Independent Cloning
• Tahapan:
1. Mendesain primer DNA
2. Melakukan linearisasi dengan vektor. Bagian
plasmid dipotong dengan enzim restriksi sesuai
situsnya
3. Membuat vector overhangs dengan memasukkan
T4 DNA polimerase dan dNTP
4. Mengamplifikasi DNA masukan (insert)
menggunakan PCR
5. Membuat insert overhangs dengan memasukkan
T4 DNA polimerase dan dNTP
6. Mencampurkan vektor dan insert untuk proses
annealing
7. Melakukan tranformasi ke bakteri Gambar 4.4 LIC Cloning Protocol
(Sumber: qb3.Berkeley.edu)
 Yeast-Mediated Cloning and
Oligonucleotide Stitching

• Prinsip kerja serupa dengan Gibson Cloning

• Memanfaatkan kemampuan rekombinan dari Yeast
• Dapat melakukan fusi dua atau lebih fragmen dsDNA yang memiliki basa
yang saling overlapping secara homolog
• Keuntungan yaitu adanya kemampuan untuk melakukan oligonucleotide
stitching → bagian DNA yang tidak memiliki ujung yang homolog tetap
dapat difusi, yaitu dengan cara menambahkan custom DNA oligos
sepanjang 60-80 bp
• Syarat: harus mengandung 30-40 bp homolog di ujung kedua fragmen
• Kekurangan: sulit melakukan purifikasi DNA dari yeast
 Type IIS Assembly

• Memanfaatkan kerja enzim type IIS restriction endonuclease →

memotong dsDNA pada jarak tertenttu dari recognition sequence
• Memungkinkan pembentukan custom overhangs yang tidak dapat
dilakukan pada teknik kloning biasa
• Keuntungan:
1. Proses digest dan ligasi dapat dilakukan dalam 1 wadah dengan satu
enzim restriksi
2. Restriction site disandi/diatur sedemikian rupa pada DNA insert dan
plasmid sehingga tidak ada sisa sekuens DNA yang tidak diinginkan
 TOPO Cloning
• Memanfaatkan kerja enzim taq polymerase → meninggalkan single adenosine overhang pada ujung
3’ dari hasil PCR
• TOPO vector biasasnya dijual khusus dalam keadaan sudah dipotong dan ujung 3’ difusikan ke DNA
topoisomerase I
• Dengan demikian, akan terjadi hibridisasi antara 3’ A overhang dari produk PCR dengan 5’ T
overhang dari TOPO backbone, sehingga sangat mudah untuk melakukan kloning ke plasmid
• Kekurangan: jumlah plasmid atau TOPO vector hanya sedikit dan sulit untuk memastikan efisiensi
proses

Gambar 4.5 TOPO Cloning

(Sumber: thermofischer)
 Kloning Gen ke
Plasmid pGEX-6P-1
 Kloning Gen ke Plasmid pGEX-6P-1
• Tahapan:
1. Memilih Gene of Interest (GOI) pada DNA → cholesterol
oxidase
2. Pemilihan enzim restriksi sesuai MCS
3. Mendesain primer (Forward dan Reverse)
4. Melakukan restriction digest pada DNA dan plasmid
5. Memasukkan DNA hasil restriksi ke agarose gel dan
melakukan purifikasi gel untuk mengisolasi DNA.
6. Melakukan ligasi DNA
7. Melakukan diagnosa akhir hasil ligasi menggunakan
agarose gel
8. Melakukan transformasi sel
9. Mengecek koloni bakteri dengan PCR atau DNA
sequencing
10. Memurnikan DNA
Gambar 4.6 GOI Cholesterol Oxydase
(Sumber: adweb.expasy.org)
 Desain Primer
• Multiple Cloning Site pada plasmid pGEX-6P-1 (basepair 940-981)

Gambar 4.7 MCS pGEX-6P-1

(Sumber: addgene.org)
 Desain Primer (Forward)
• Pemilihan enzim berdasarkan restriction site: BamHI

Gambar 4.7 MCS pGEX-6P-1

(Sumber: addgene.org)

Basa ekstensi (match dengan plasmid) Basa restriction site

• Penentuan Primer: 5’ TG GGA TCC ATG ACG GCC CTC 3’

 Desain Primer (Forward)

Basa ekstensi (match dengan plasmid) Basa restriction site

• Penentuan Primer: 5’ TG GGA TCC ATG ACG GCC CTC 3’

• 20 nukleotida
• 𝑇𝑚 = 4 𝑛𝐺 + 𝑛𝐶 + 2 𝑛𝐴 + 𝑛𝑇 = 4 6+7 + 2 3+4 = 66oC
𝑛𝐺+𝑛𝐶 13
• 𝐺𝐶 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑒𝑛𝑡 = . 100% = . 100% = 65%
𝑝𝑎𝑛𝑗𝑎𝑛𝑔 𝑝𝑟𝑖𝑚𝑒𝑟 20
 Desain Primer (Reverse)
• Pemilihan enzim berdasarkan restriction site: XhoI

Gambar 4.7 MCS pGEX-6P-1

(Sumber: addgene.org)

Basa ekstensi (match dengan plasmid) Komplemen asa restriction site

• Penentuan Primer: 5’ CG CTC GAG CTA CGC GGC GG 3’

Desain Primer (Reverse)

Basa ekstensi (match dengan plasmid) Komplemen basa restriction site

• Penentuan Primer: 5’ CG CTC GAG CTA CGC GGC GG 3’

• 19 nukleotida
• 𝑇𝑚 = 4 𝑛𝐺 + 𝑛𝐶 + 2 𝑛𝐴 + 𝑛𝑇 = 4 8+7 + 2 2+2 = 68oC
𝑛𝐺+𝑛𝐶 15
• 𝐺𝐶 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑒𝑛𝑡 = . 100% = . 100% = 78,9%
𝑝𝑎𝑛𝑗𝑎𝑛𝑔 𝑝𝑟𝑖𝑚𝑒𝑟 19
 Kriteria Pemilihan Enzim Restriksi

■ Enzim restriksi yang digunakan umumnya 2 jenis yang berbeda

■ Hal ini untuk memastikan spesifitas proses
■ Beberapa kriteria yang mempengaruhi pemilihan enzim restriksi:
1. Pemilihan restriction site sesuai plasmid (MCS)
2. Ukuran fragmen
3. Jenis fragmen (blunt ends atau sticky ends)
4. Sensivitas terhadap metilasi (mempengaruhi tahapan pembelahan)
5. Kompatibiliti terhadap kondisi reaksi
6. Komposisi buffer serta suhu inkubasi
 BP Sequence Hasil PCR

■ Berdasarkan Hasil ORF pada web.expasy.org gen yang tertranslasi menjadi

protein sebanyak 1590 basa (1629 – 39 basa)
■ Pada desain primer:
Forward primer: 12 bp
Reverse primer: 11 bp
■ Maka total BP hasil PCR yaitu:

𝑏𝑝 ℎ𝑎𝑠𝑖𝑙 𝑃𝐶𝑅 = 1590 − 12 − 11 = 1567 𝑏𝑝

 References

Addgene. 2019. Choosing a Molecular Cloning Technique. [online] Available at:

https://www.addgene.org/plasmid-reference/cloning-choice/. Accessed on: 5 October 2019.

Biology Dictionary. 2019. Lyse. [ONLINE] https://biologydictionary.net/lyse/ diakses 7 Oktober 2019

Cseke, Leland et al. 2011. Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine.
USA: CRC Press

Ford, Tyler. 2016. Plasmid Cloning by Restriction Enzyme Digest (aka Subcloning). [Online]
https://www.addgene.org/protocols/subcloning/ diakses 5 Oktober 2019

Harahap, Fauziyah. 2016. Isolasi DNA Plasmid. [Online]

https://www.academia.edu/21925040/ISOLASI_DNA_PLASMID_By_Amrullah_Mukhtar diakses 13
Oktober 2019
 References
Khan Academy. 2019. Bacterial Transformation and Selection. Available at:
khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-cloning-tutorial/a/bacterial-
transformation-selection. Accessed on: 5 October 2019.

New England Biolabs. 2019. Gibson Assembly. [online] Available at:

https://international.neb.com/applications/cloning-and-synthetic-biology/dna-assembly-and-
cloning/gibson-assembly. Accessed on: 5 October 2019.