TEKNIK STERILISASI, PEMBUATAN MEDIA DAN UJI POTENSIAL ANTIBAKTERI

ALFINA MARTIANA (K1A017002)

PENDAHULUAN

Sterilisasi dalam mikrobiologi merupakan proses penghilangan semua jenis organisme hidup
(dalam hal ini, organisme yang dimaksud adalah protozoa, fungi, bakteri, mycoplasma, serta virus) yang
terdapat pada suatu benda. Proses sterilisasi ini melibatkan aplikasi biocidal agent atau proses fisik
dengan tujuan untuk membunuh atau menghilangkan mikroorganisme. Metode sterilisasi dibagi menjadi
dua yaitu metode sterilisasi fisik dan metode sterilisasi kimia. Metode sterilisasi fisik dapat dilakukan
dengan cara panas kering ataupun panas basah, radiasi, dan filtrasi. Sedangkan metode sterilisasi kimia
dapat dilakukan dengan menggunakan bahan-bahan kimia. Metode sterilisasi panas kering merupakan
metode sterilisasi tanpa kelembapan (tanpa penggunaan uap air), sedangkan metode sterilisasi basah
merupakan metode sterilisasi yang menggunakan uap air. Metode sterilisasi panas kering dilakukan
pada temperature 160-180 ⁰C. Sedangkan sterilisasi panas basah dilakukan pada temperature 115-134
⁰C(Pratiwi, 2008).

Suatu media kultur diperlukan untuk memperoleh bakteri murni yang akan diteliti. Medium adalah
bahan yang digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme diatas atau didalamnya. Komponen dasar
medium biasanya telah disesuaikan dengan jenis nutrisi yang diperlukan oleh mikroba tersebut(Lestari,
2017). Dalam praktikum ini, media padat yang digunakan adalah nutrient agar (NA) dan media cair yang
digunakan adalah nutrient broth (NB).

Harga KHM ditentukan berdasarkan kadar terendah larutan uji yang menghasilkan larutan yang
jernih setelah dilakukan inkubasi. Harga KBM ditentukan dengan mengamati ada tidaknya pertumbuhan
koloni hasil goresan larutan uji pada media agar. Kadar terendah yang menunjukkan tidak adanya
pertumbuhan jamur dinyatakan sebagai KBM(kumalasari, 2011).

Untuk pengamatan dalam menentukan nilai KHM, metode yang digunakan adalah metode
turbidimetri. Metode turbidimetri adalah metode yang hanya digunakan dengan cara pengamatan secara
visual, sehingga memiliki kelemahan yaitu mata manusia pada saat pengamatan kekeruhan tidak bisa
membedakan antara sel bakteri yang masih hidup dan sel bakteri yang sudah mati dan juga kemampuan
mata bersifat subjektif dari masing-masing orang sehingga dapat menimbulkan kesalahan. Oleh sebab
itu, dengan adanya keterbatasan menggunakan metode turbidimetri, maka seharusnya perlu dilakukan
pengujian lebih lanjut dengan cara mengukur nilai absorbansi menggunakan spektrofotometer UV-
Vis(Permata, 2016).

Antibiotic cefotaxime memiliki komposisi berupa campuran serbuk putih larut dalam air. Senyawa
tersebut dinamakan sodium 7-[2-(2-amino-4-thiazolyl)-2-methoxyimino]-acetamidocephalosporanate.
Antibiotic cefotaxime mempunyai khasiat bakterisidal yang artinya dapat membunuh mikroorganisme,
yaitu bekerja dengan menghambat sintesis mukopeptida pada dinding sel bakteri. Aktivitas cefotaxime
lebih besar terhadap bakteri gram negative dibandingkan terhadap bakteri gram
positif(masuyoshi,1980).

MATERIAL DAN METODE PRAKTIKUM

Alat dan Bahan Praktikum

 Pada praktikum ini, alat-alat yang digunakan adalah autoklaf, batang pengaduk, blue tip, bunsen,
cawan petri, erlenmeyer 100 mL, hot plate, inkubator, kapas, karet gelang, Koran, mikropipet, laminar air
flow, ose, rak tabung reaksi, tabung reaksi, vortex, dan yellow tip. Sedangkan bahan-bahan yang
digunakan adalah antibiotic cefotaxime, aquades, nutrient agar (NA), nutrient broth (NB) dan suspense
bakteri.

Metode

Praktikum pertama yaitu teknik sterilisasi dan pembuatan media. Pertama, yaitu teknik sterilisasi.
Dilakukan sterilisasi terhadap 8 cawan petri menggunakan alcohol, kemudian tabung reaksi dan
erlenmeyer dibersihkan menggunakan air yang mengalir. Setelah itu, cawan petri steril yang telah
disusun, dibungkus menggunakan Koran. Kedua yaitu pembuatan media. Media yang dibuat ada dua
yaitu media NA dan media NB. Pertama yaitu pembuatan medi NA. bubuk NA yang dibutuhkan dalam
praktikum ini adalah sebanyak 4 gram. Langkah pertama yang dilakukan yaitu menimbang masing-
masing 2 gram NA pada timbangan analitik. Kemudian, dimasukkan masing-masing 2 gram NA kedalam
2 erlenmeyer yang berisi 100 mL. Diaduk menggunakan batang pengaduk dan dipanaskan di hot plate
hingga larut dan terbentuk gelembung (dalam proses pemanasan, larutan tersebut tetap diaduk). Setelah
itu, mulut Erlenmeyer ditutup dengan kapas dan kemudian ditutup dengan Koran dan diikat dengan
karet. Kedua, yaitu pembuatan media NB. Bubuk NB yang dibutuhkan dalam praktikum ini adalah
sebanyak 1 gram. Langkah pertama yang dilakukan adalah menimbang 1 gram bubuk NB menggunakan
timbangan analitik. Kemudian dilarutkan dengan 100 ml aquades pada erlenmeyer. Selanjutnya,
campuran tersebut diaduk menggunakan batang pengaduk dan dipanaskan di atas hot plate hingga
terlarut dan terbentuk gelembung (dalam proses pemanasan, larutan tersebut tetap diaduk). Larutan NB
yang telah dipanaskan dimasukkan kedalam 10 tabung reaksi yang masing-masing berisi 10 mL.
kemudian ditutup tabung reaksi tersebut mengguanakn kapas. Setelah itu, diikat masing-masing 5
tabung reaksi, kemudian dibungkus dengan koran dan diikat dengan karet gelang. Semua alat dan
bahan yang telah dibungkus dimasukkan ke dalam autoklaf untuk disterilisasi dengan suhu 121⁰C
selama kurang lebih 2 jam. Setelah itu, semua alat dan bahan tersebut dimasukkan kedalam kulkas.

Praktikum kedua yaitu uji potensial antibakteri. Langkah pertama yang dilakukan adalah
mengambil media NB yang telah dibuat dari kulkas dan diletakkan di ruang steril (lamina air flow)..
Kemudian diambil 1 mL cairan NB dari masing-masing tabung (ada 5 tabung yang digunakan).
Selanjutnya, pada tabung 1, dimasukkan 1 mL biakan bakteri, kemudian diletakkan diatas vortex agar
homogen dan dibandingkan dengan standar McFarland. Tabung 1 ini dijadikan sebagai standar.
Selanjutnya, ditambahkan 1 mL antibiotic kedalam tabung 1 dan dihomogenkan di atas vortex, di ambil 1
mL campuran. Kemudian, 1 mL campuran dari tabung 2 tersebut dimasukkan ke dalam tabung 3,
dihomogenkan dan di ambil 1 mL campuran. Satu mL campuran dari tabung 3, dimasukkan kedalam
tabung 4, dihomogenkan dan diambil 1 mL campuran. Selanjutnya, 1 mL campuran pada tabung 4 tadi,
dimasukkan ke dalam tabung 5, dihomogenkan dan diambil 1 mL campuran, kemudian 1 mL campuran
tersebut di buang ke wadah yang sudah disediakan. Setelah itu, tabung 2, 3, 4, dan 5 ditambahkan 0,2
mL campuran pada tabung 1. Kemudian diinkubasi tabung reaksi selama 24 jam pada suhu 37⁰C.

Uji potensial antibakteri langkah kedua. Pada langkah ini, tabung reaksi yang telah di inkubasi
pada langkah pertama dikeluarkan dari incubator, kemudian ditentukan KHMnya. Diambil media agar
yang telah dibuat sebelumnya. Tabung reaksi yang menjadi KHM dan media agar dibawa ke ruang steril
(lamina air flow). Dibersihkan media agar dengan tissue dan di sterilisasi dengan dipanaskan
menggunakan bunsen. Dilakukan juga sterilisasi ose menggunakan bunsen. Setelah itu, diambil larutan
KHM dari tabung 2 dan di oleskan ke media agar pertama pada keempat sisi yang berbeda. Dilakukan
perlakuan yang sama untuk larutan KHM pada tabung 3 di media agar yang berbeda. Setelah itu, kedua
cawan petri di masukkan kedalam incubator.

Uji potensial antibakteri ketiga. Cawan petri pada langkah kedua dikeluarkan dari incubator.
Kemudian diamati pertumbuhan bakteri di dalam cawan petri. Setelah itu ditentukan KBM.

PEMBAHASAN HASIL PRAKTIKUM

Hasil Praktikum

Tabel hasil praktikum

No. Gambar Keterangan Hasil

Larutan NA yang  Volume NA 200 mL

1. siap dimasukkan  Warna larutan NA
ke autoklaf orange

Larutan NB yang  Volume awal NB 100

2. siap dimasukkan mL
ke autoklaf  Volume akhir NB 90
mL
 Warna larutan NB
kuning

Proses penuangan Sebanyak 10 cawan petri

3. NA ke cawan petri media NA

Media NA yang Steril ( tidak

4. sudah di sterilisasi terkontaminasi
mikroorganisme)

Uji potensial  Ada pertumbuhan

5. antibakteri mikroorganisme

 Tidak ada KBM

Perhitungan konsentrasi antibiotik cefotaxime

 Konsentrasi pada tabung 2 : M1 𝑥 𝑉1 = 𝑀2 𝑥 𝑉2

1 𝑥 1 = 𝑀2 𝑥 10
1
M2 = 10
M2 = 0,1 mg/mL

 Konsentrasi pada tabung 3 : M2 𝑥 𝑉2 = 𝑀3 𝑥 𝑉3

0,1 𝑥 1 = 𝑀3 𝑥 10
0,1
M3 =
10
M3 = 0,01 mg/mL

 Konsentrasi pada tabung 4 : M3 𝑥 𝑉3 = 𝑀4 𝑥 𝑉4

0,01 𝑥 1 = 𝑀4 𝑥 10
0,01
M4 = 10
M4 = 0,001 mg/mL

 Konsentrasi pada tabung 5 : M4 𝑥 𝑉4 = 𝑀5 𝑥 𝑉5

0,001 𝑥 1 = 𝑀5 𝑥 10
0,001
M5 = 10
M5 = 0,0001 mg/mL

PEMBAHASAN

Pada praktikum ini, membahas tentang sterilisasi, pembuatan media dan uji potensial antibakteri.
Dimana tujuan dari praktikum ini adalah agar mahasiswa dapat mempersiapkan media dan peralatan
untuk pengerjaan mikrobiologi serta dapat menentukan potensi antibiotic dari nilai KHM dan KBM dari
suatu sampel dengan metode dilusi cair. Alat dan bahan utama yang digunakan dalam praktikum ini
adalah lamina air flow, incubator, autoklaf, NA dan NB. Proses sterilisasi pada praktikum ini
menggunakan sterilisasi cara fisik. Sterilisasi fisik yang digunakan adalah panas-basah. Dimana pada
sterilisasi panas-basah ini menggunakan alat yang disebut autoklaf. Menurut (Setyowati, dkk,) Tujuan
sterilisasi adalah untuk menjamin bahwa alat dan bahan yang digunakan terbebas dari kontaminasi
mikroba. Proses sterilisasi menggunakan autoklaf yang mencerminkan metode panas basah dimana uap
air akan menembus alat dan media yang disterilkan. Suhu pada autoklaf adalah 121⁰C. Uap air ini akan
mengkoagulasi protein penyusun dinding sel mikroba seperti bakteri sehingga bakteri dalam alat dan
media yang disterilkan tersebut akan mati.

Pada praktikum ini, media yang dibuat adalah media NA dan media NB. Larutan NA berwarna
orange dengan volume yang dibuat sebanyak 200 mL. sedangkan larutan NB berwarna kuning dengan
volume awal 100 mL dan volume akhir 90 mL. Volume pada larutan NB berkurang karena adanya proses
penguapan yang dilakukan selama pemanasan pada hot plate. Media NA termasuk kedalam media
padat, sedangkan media NB termasuk kedalam media cair. Menurut (Rakhmawati, 2012) berdasarkan
konsistensinya, medium dapat dibedakan menjadi 3 yaitu medium cair, semipadat, dan padat. Medium
cair hanya mengandung nutrient-nutrient yang dilarutkan dalam aquades Contoh medium cair adalah
Nutrient Broth (NB), glukosa broth, dan lain-lain. Medium ini dapat digunakan untuk perbanyakan
(propagasi) mikroorganisme dalam jumlah besar, uji fermentasi, dan berbgai uji lain. Medium padat
(solid) mengandung nutrient-nutrient yang dilarutkan dalam aquades ditambah bahan pemadat yaitu
agar. Medium padat sering digunakan untuk isolasi mikroorganisme, uji aktivitas biokimiawi perhitungan
jumlah mikroorganisme dan lain-lain. Salah satu contoh media padat adalah nutrient agar (NA).

Uji potensial antibakteri pada praktikum ini menggunakan antibiotic cifoxasime karena antibiotic
ini mempunyai khasiat bakterisidal yang artinya dapat membunuh mikroorganisme, yaitu bekerja dengan
menghambat sintesis mukopeptida pada dinding sel bakteri. Aktivitas cefotaxime lebih besar terhadap
bakteri gram negative dibandingkan terhadap bakteri gram positif(masuyoshi,1980). Dari perhitungan
konsentrasi antibiotic cefotaxime yang telah dilakukan, dapat dilihat bahwa tabung 5 mempunyai
konsentrasi yang paling kecil yaitu 0,0001 mg/mL. Namun, KHM tidak terdapat pada tabung 5 karena
tabung 5 terlihat keruh. Berdasarkan pengamatan yang telah dilakukan terhadap 4 tabung tersebut,
Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) terdapat pada tabung 3 dengan konsentrasi antibiotic sebesar 0,01
mg/mL. Hal ini terlihat dari tabung 3 yang terlihat jernih. Kemudian untuk menentukan nilai KBM, tabung
3 yang merupakan tempat KHM dari antibiotic di inokulasi ke media NA yang steril dengan cara di swab
spiral. Kemudian di inkubasi selama 24 jam. Setelah di inkubasi, terdapat pertumbuhan mikroorganisme
pada media NA tersebut (bakteri tidak dapat dibunuh oleh antibiotic). Hal ini berarti nilai KBM yang dicari
tidak ada. Karena nilai KBM dapat terlihat dengan tidak adanya pertumbuhan mikroorganisme pada
media NA. Adanya pertumbuhan bakteri pada media NA ini menunjukkan bahwa pada proses praktikum
terdapat kesalahan sehingga menyebabkan terjadinya kontaminasi terhadap media agar. Menurut
(Pratiwi, 2008) efisiensi mtode sterilisasi dan efektivitas agen antimikroba dipengaruhi oleh beberpa hal
seperti ukuran populasi, komposisi populasi, konsentrasi atau intensitas agen antimikroba, lama
paparan, temperature dan lingkungan sekitar. Dari factor-faktor diatas, factor yang lebih dominan
menyebabkan nilai KBM tidak ada adalah ukuran populasi dari mikroorganisme. Semakin besar jumlah
populasi mikroorganisme yang ada, maka waktu yang diperlukan untuk membunuh mikroorganisme
tersebut akan lebih lama. Banyaknya populasi ini terlihat dari jumlah sampel bakteri yang dimasukkan ke
media NB yaitu sebanyak 1 mL. Faktor lain yang dapat berpengaruh terhadap tidak adanya nilai KBM
yang didapatkan pada praktikum ini adalah tidak sesuainya larutan standar dengan standar McFarland,
uap air masih ada pada media NA ketika media NB di inokulasikan, ketika proses swab, swab yang
dilakukan terlalu ditekan sehingga mengakibatkan media NA sedikit terbuka (rusak) dan hal ini dapat
mengakibatkan mikroorganisme mudah tumbuh. Selain itu juga karena kurang bersih saat pengerjaan
sehingga menyebabkan media tidak steril (terkontaminasi). Selain factor-faktor diatas, hal lain yang
dapat menyebabkan adanya pertumbuhan bakteri adalah karena adanya kesalahan saat penentuan nilai
KHM. Hal ini dapat terjadi karena pada pengamatan media NB pada tabung untuk menentukan nilai
KHM, metode yang digunakan adalah turbidimetri. Menurut (Permata, 2016) metode turbidimetri adalah
metode yang hanya digunakan dengan cara pengamatan secara visual, sehingga memiliki kelemahan
yaitu mata manusia pada saat pengamatan kekeruhan tidak bisa membedakan antara sel bakteri yang
masih hidup dan sel bakteri yang sudah mati dan juga kemampuan mata bersifat subjektif dari masing-
masing orang sehingga dapat menimbulkan kesalahan. Oleh sebab itu, dengan adanya keterbatasan
menggunakan metode turbidimetri, maka seharusnya perlu dilakukan pengujian lebih lanjut dengan cara
mengukur nilai absorbansi menggunakan spektrofotometer UV-Vis.

KESIMPULAN

Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan, dapat disimpulkan bahwa :

Ada tiga macam teknik sterilisasi yang dapat digunakan untuk mensterilkan suatu alat praktikum,
diantaranya adalah sterilisasi fisik (panas), sterilisasi kimia, dan sterilisasi mekanik. Dalam praktikum ini
teknik sterilisasi yang digunakan adalah sterilisasi fisik (panas). Sterilisasi cara fisik (panas) ada dua
macam yaitu panas kering dan panas basah. Praktikum ini menggunakan sterilisasi panas basah yaitu
menggunakan alat yang disebut autoklaf dengan temperature 121⁰C.

Ada 2 media yang dibuat, yaitu media NA (media padat) dan media NB (media cair). Media NA
digunakan untuk isolasi mikroorganisme. Sedangkan media NB digunakan untuk perbanyakan
(propagasi) mikroorganisme dalam jumlah besar.

Untuk menentukan uji potensial antibakteri dapat dilihat dari nilai KHM dan KBM dari antibiotic.
Nilai KHM pada praktkum ini terdapat pada tabung 3 yaitu sebesar 0,01 mg/mL sedangkan nilai KBM nya
tidak ada.
DAFTAR PUSTAKA

Komalasari, E., dan Nanik S. 2011. Aktivitas Antifungsi Ekstrak Etanol Batang Binahong (Anredera
cordifolia (Tenore) Steen) Terhadap Candida albicans SERTA Skrining Fitokimia. Jurnal ilmiah
kefarmasian. 1(2). Hal 55.

Lestari, P. B. dan T. W. Hartati. 2017. Mikrobiologi Berbasis Inkuiry. Malang: Penerbit Gunung Samudra.

Masuyoshi, S., dkk. 1980. In Vitro Antimicrobial Activity of Cefotaxime, a New Cephalosporin.
Antimicrobial Agents and Chemoterapy. 18(1). Hal 1-8.

Permata, D. A. T., Olivia A.W., dan Christy M. 2016. Uji Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) Ekstrak
Bawang Bombay Allium cepa L Terhadap Pertumbuhan Staphylococcus aureus. Jurnal Ilmiah
Farmasi. 5(4). Hal 57-58.

Pratiwi, Silvia T. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Jakarta: Erlangga.