Isolaso Dan Identifikasi Bakteri Gram (-) Enterobactericiae. Sp Pada Sapel Urin
Disusun Oleh :
411117026
2019
Isolaso Dan Identifikasi Bakteri Gram (-) Enterobactericiae. Sp Pada Sapel Urin
2
rerumputan.Akibatnya seperti hewan sapi yang memakan rumput yang
terkontaminasi memakan dengan jumlah banyak akan menyebabkan sapi itu
terkena penyakit seperti diare akut.(Elfidasari, 2013)
3
4. Segera kirim urine ke LAB karena stabilitas urine tidakboleh lebih dari
1 jam
Uji biokimia merupakan salah uji yang digunakan untuk menentukan
spesies kuman yang tidak diketahui sebelumnya. Setiap kuman memiliki sifat
biokimia yang berbeda sehingga tahapan uji biokimia ini sangat membantu
proses identifikasi. Setelah sampel diinokulasikan pada media differensial
atau selektif, kemudian koloni kuman diinokulasikan pada media uji biokimia.
Ada beberapa jenis uji yang sering digunakan dalam uji biokimia
walaupun sebenarnya masih banyak lagi media yang dapat digunakan. Uji
biokimia yang paling sering digunakan antara lain :
1. Uji Indol
Media yang dipakai adalah pepton 1%. Uji indol digunakan untuk
mengetahui apakah kuman mempunyai enzim triptophanase sehingga
kuman tersebut mampu mengoksidasi asam amino triptophan
membentuk indol. Adanya indol dapat diketahui dengan penambahan
reagen Ehrlich/Kovacs yang berisi paradimetil amino bensaldehid.
Interpretasi Hasil :
Negatif (-) : Tidak terbentuk lapisan cincin berwarna merah pada
permukaan biakan, artinya bakteri ini tidak membentuk indol
dari triptophan sebagai sumber karbon.
Positif (+) : Terbentuk lapisan cincin berwarna merah pada
permukaan biakan, artinya bakteri ini membentuk indol dari
triptophan sebagai sumber karbon. Asam amino triptophan
merupakan komponen asam amino yang lazim terdapat pada
protein, sehingga asam amino ini dengan mudah dapat digunakan
oleh mikroorganisme.( Litha Purwanti, 2015)
2. Uji MR
Media yang digunakan adalah pepton glukosa phosphat. Uji ini
digunakan untuk mengetahui adanya fermentasi asam campuran
(metilen glikon).Interpretasi Hasil :
4
Negatif (-) : Tidak terjadi perubahan warna media menjadi merah
setelah ditambah methyl red 1%
Positif (+) : Terjadi perubahan warna media menjadi merah
setelah ditambahkan methyl red 1%. Artinya bakteri
menghasilkan asam campuran (metilen glikon) dari proses
fermentasi glukosa yang terkandung dalam media MR. (Volk
dan Wheeler, 1993).
3. Uji VP
Media yang dipakai adalah pepton glukosa phosphat. Uji ini digunakan
untuk mengetahui pembentukan asetil metil karbinol (asetoin) dari hasil
fermentasi glukosa.Interpretasi Hasil :
Negatif (-) : Tidak terjadi perubahan warna media menjadi merah
setelah ditambahkan naphtol 5% dan KOH 40%.
Positif (+) : Terjadi perubahan warna media menjadi merah
setelah ditambahkan naphtol 5% dan KOH 40%, artinya hasil
akhir fermentasi bakteri adalah asetil metil karbinol (asetoin).
4. Uji Citrat
Media yang dipakai adalah Simons citrat. Tujuan dari uji ini adalah
untuk mengetahui apakah kuman menggunakan sitrat sebagai sumber
karbon. Pada media Simons citrat berisi indikator BTB (Brom Tymol
Blue). Apabila bakteri menggunakan sitrat sebagai sumber karbon maka
media berubah menjadi basa dan berubah warna menjadi biru.
Interpretasi Hasil :
Negatif (-) : Tidak terjadinya perubahan warna media dari hijau
menjadi biru. Artinya bakteri ini tidak mempunyai enzim sitrat
permease yaitu enzim spesifik yang membawa sitrat ke dalam
sel. Sehingga kuman tidak menggunakan citrate sebagai salah
satu/satu-satunya sumber karbon
5
Positif (+) : Terjadinya perubahan warna media dari hijau
menjadi biru, artinya kuman menggunakan citrat sebagai salah
satu/satu-satunya sumber karbon. (Volk dan Wheeler, 1993).
5. Uji Motilitas
Media yang dipakai adalah media yang bersifat semi solid dengan
kandungan agar-agar 0,2-0,4%. Tujuan dari uji ini adalah untuk
mengetahui gerak kuman, bisa memakai media MO (Motilitas Ornitin)
atau SIM (Sulfida Indol Motility). Pada media SIM selain untuk melihat
motilitas bisa juga untuk test indol dan pembentukan H2S.Interpretasi
Hasil :
Negatif (-) : Terlihat adanya penyebaran yang berwarna putih
seperti akar hanya pada bekas tusukan inokulasi.
Positif (+) : Terlihat adanya penyebaran yang berwarna putih
seperti akar disekitar inokulasi. Hal ini menunjukan adanya
pergerakan dari bakteri yang diinokulasikan, yang berarti bahwa
bakteri ini memiliki flagel. (Volk dan Wheeler, 1993).
6. Uji Urease
Tujuan dari uji ini adalah untuk mengetahui apakah kuman mempunyai
enzim urease yang dapat menguraikan urea membentuk amoniak. Media
urea berisi indikator phenol red.nterpretasi Hasil :
Negatif (-) : Tidak terjadi perubahan warna media menjadi
pink/merah jambu, artinya kuman tidak memecah urea
membentuk amoniak.
6
Positif (+) : Tidak terjadi perubahan warna media menjadi
pink/merah jambu, artinya kuman memecah urea membentuk
amoniak. (Volk dan Wheeler, 1993).
7. Tes TSIA (Triple Sugar Iron Agar)
Tujuan dari tes ini adalah untuk mengetahui kemampuan kuman untuk
memfermentasikan karbohidrat. Pada media TSIA berisi 3 macam
karbohidrat yaitu glukosa, laktosa dan sukrosa. Indikatornya adalah
phenol red yang menyebabkan perubahan warna dari merah orange
menjadi kuning dalam suasana asam. Glukosa berada di dasar media
sedangkan laktosa dan sukrosa berada di bagian lereng. Selain
menggunakan media TSIA dapat pula digunakan media KIA (Kligers
Iron Agar), bedanya adalah pada media KIA hanya berisi 2 macam
karbohidrat yaitu glukosa dan laktosa.Interpretasi Hasil :
Hanya memfermentasi glukosa : Bila pada dasar (butt) media
berwarna kuning (bersifat asam) dan lereng (slant) berwarna
merah (bersifat basa) Al/Ac atau K/A
Memfermentasi semua karbohidrat : Bila pada dasar (butt) media
berwarna kuning (bersifat asam) dan lereng (slant) berwarna
kuning (bersifat asam) Ac/Ac atau A/A
Tidak memfermentasi semua karbohidrat : Bila pada dasar (butt)
media berwarna merah (bersifat basa) dan lereng (slant)
berwarna merah (bersifat basa) Al/Al atau K/K Fermentasi pada
TSIA juga disertai dengan pembentukan gas CO2 yang dapat
dilihat dari pecahnya dan terangkatnya agar.
Media TSIA juga dapat digunakan untuk mengetahui
pembentukan H2S yaitu melihat apakah kuman memfermentasi
metionin dan sistein (Asam amino yang mempunyai gugus S).
Pada media TSIA terdapat asam amino metionin dan sistein, jika
kuman memfermentasi kedua asam amino ini maka gugus S akan
keluar dan gugus S akan bergabung dengan H2O membentuk
7
H2S. Selanjutnya H2S bergabung dengan Fe2+ membentuk FeS
berwarna hitam dan mengendap.( Litha Purwanti, 2015)
8. Uji Gula-Gula (Glukosa, Laktosa, , Manitol, Sukrosa)
Uji ini digunakan untuk mengetahui apakah kuman memfermentasi
masing-masing gula diatas membentuk asam. Media gula-gula ini
terpisah dalam 5 tabung yang berbeda dan media yang digunakan adalah
masing-masing gula dengan konsentrasi 1% dalam pepton. Masing-
masing gula ditandai dengan tinta pada tutup kapas yang berbeda-beda.
Untuk glukosa tidak berwarna, laktosa berwarna ungu, maltosa berwarna
merah, manitol berwarna hijau, dan sukrosa berwarna biru. Didalam
media gula-gula ditambahkan indikator phenol red.Interpretasi Hasil :
Negatif (-) : Tidak terjadi perubahan warna media dari merah
menjadi kuning. Artinya kuman tidak memfermentasi gula
Positif (+) : Terjadi perubahan warna media dari merah menjadi
kuning. Artinya kuman memfermentasi gula membentuk asam
Positif + gas (+g) : Terjadi perubahan warna media dari merah
menjadi kuning. Artinya kuman memfermentasi gula membentuk
asam dan gas. Gas yang diperhitungan minimal 10% dari tinggi
tabung durham(Indah Jayanti Kumalasari, 2014)
8
6. Lampu spirtus Volume 200 mL
9. Rak tabung Kecil dan besar
E. Prosedur/Cara kerja
Hari I
9
1.dilakukan penanaman di media MC dengan cara steak isolasi di inkubasi
pada suhu 37ºc selama 24 jam
Hari II
1. Dilakukan pengamatan koloni pada media MC
2. Dilakukan pewarnaan Gram
3. Dilakukan uji biokim dengan di tamam di media gula-gula
(sukrosa,laktosa,glukosa,manitol),ditanam dimedia VP,MR,urease(dengan
cara menggoreskan pada media agar mirig),simon sitrat(dengan cara
menggoreskan pada media agar mirig),SIM(‘dengan cara meunsukan ose
kedasar tabung,TSIA(dengan cara menggoreskan pada media agar
mirig,dan menusuk dari bagian lereng sampai kedasar)
4. Inkubasi pada suhu 37ºc selama 24 jam
Hari III
1. Tambahkan Alfa Naptol dan KOH pada media VP
2. Tambahkan Metil Red pada media MR
3. Tambahkan kovaks pada media SIM
4. Lalu lakukan pengamatan 10 uji biokimia
F. Hasil Pengamatan
Hari II
Pewarnaan Gram
Bentuk : Basil
Warna : Merah (Gran Negatif)
Susunan : Mono Basil
Tersangka : e.nterobacteriae
10
No Hari Media Hasil
1. Kedua MC :
Bentuk Bulat
Diameter Sedang
Warna Pink pucat
Elevasi Convex
Permukaan Basah /mukoid
Pinggiran rata
2. Ketiga Gula-gula :
Sukrosa Fermenter + gas
Manitol Fermenter + gas
Glukosa Fermenter + gas
Laktosa Fermenter + gas
SIM :
Sulfur Negatif
Indol Negatif
Motiliti Negatif
Simon sitrat Positif
Urease Positif
MR Negatif
VP Positif
TSIA Kuning/kuning,gas
(+),sulfur negatif
G. Pembahasan
1. Media MCA ( Mac Conkey Agar)
11
Pada umumnya media yang digunakan untuk membiakkan mikroba
mengandung air, sumber energi (protein dan karbohidrat), zat hara (sumber
karbon, nitrogen, sulfur, fosfat, oksigen dan hidrogen), serta faktor penunjang
pertumbuhan (seperti asam amino, vitamin). MCA ( Mac Conkey Agar)
mengandung zat warna yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri Gram
Positif, sedangkan bakteri Gram Negatif tetap tumbuh.
Suatu media yang memenuhi kebutuhan mikroba untuk bertahan hidup dan
melakukan aktivitasnya secara normal diperlukan untuk melakukan isolasi
jenis mikroba tertentu. Setiap media spesifik memiliki kandungan senyawa
tertentu yang dapat mendukung pertumbuhan mikroba tertentu tetapi
menghambat pertumbuhan jenis mikroba lainnya.
2. Uji Biokimia
Uji biokimia adalah pengujian larutan atau zat-zat kimia dari bahan-bahan
dan proses-proses yang terjadi dalam tubuh makhluk hidup, sebagai upaya
untuk memahami proses kehidupan dari sisi kimia (Lehninger, 1995).
Biokimia bertujuan untuk memahami bagaimana interaksi biomolekul satu
dengan lainnya yang membawa sifat-sifat kehidupan ini. Belum pernah dalam
pengamatan logika molekul sel hidup, kita menemukan suatu pelanggaran
terhadap hukum-hukum yang telah dikenal, seiring dengan itu pula, kita
belum pernah memerlukan pendefinisian hukum baru. Mesin organik lunak
sel hidup berfungsi di dalam kerangka hukum-hukum yang sama mengatur
mesin buatan manusia. Akan tetapi, reaksi-reaksi kimia dan proses
pengaturan sel telah maju demikian pesat, melampaui kemampuan kerja
mesin buatan manusia metode Berikut beberapa uji biokimia yang digunakan
untuk identifikasi bakteri, antara lain:
Reaksi Fermentasi Karbohidrat (Gula-gula)
Fermentasi merupakan salah satu aktivitas biokimia yang
dilakukan oleh mikroba. Fermentasi adalah proses pengunahan senyawa
makromolekul organik menjadi senyawa yang lebih sederhana oleh
aktivitas mikroba pada kondisi anaerob. Fermentasi dapat menghasilkan
12
berbagai senyawa akhir,contohnya fermentasi karbohidrat yang dapat
menghasilkan berbagai senyawa asam seperti asam laktat dan propionet,
ester-ester, keton dan gas (Pelczar, 2008).
Sebagian besar mikroorganisme memperoleh energi dari substrat
berupa karbohidrat yang selanjutnya di fermentasi menghasilkan asam-
asam organik (seperti asam laktat, format, asetat), dengan disertai atau
tidak disertai pembentukan gas. Organisme-organisme yang berbeda
akan menggunakan karbohidrat/gula-gula yang berbeda tergantung dari
komponen enzim yang dimilikinya. Perbenihan gula-gula digunakan
untuk melihat adanya pembentukan asam yaitu dengan adanya
perubahan warna indikator (merah fenol atau biru bromtimol) yang
terdapat dalam perbenihan menjadi kuning yang sebelum ditanami
berwarna merah (indikator merah fenol) atau berwarna biru (indikator
biru bromtimol) serta untuk pembentukan gas, yaitu dengan terlihat nya
udara di dalam tabung peragian/fermentasi (tabung durham). Jenis
karbohidrat yang digunakan pada uji fermentasi karbohidrat antara lain:
Sukrosa, Laktosa, Maltosa, Manitol. Glukosa dapat langsung masuk
dalam jalur fermentasi tahap pertama. Sedangkan, sukrosa, laktosa
mantol, dan maltosa akan di hidrolisis terlebih dahulu menjadi
monosakarida penyusunnya. Laktosa dihidrolisis menjadi galaktosa dan
glukosa. Monosakarida jenis manosa dan galaktosa terlebih dahulu akan
diubah menjadi glukosa melalui reaksi epimerisasi. Sedangkan fruktosa
akan diubah terlebih dahulu menjadi fruktosa 6-fosfat dan kemudian
fruktosa 6-fosfat diubah menjadi glukosa 6-fosfat. Glukosa 6-fosfat dan
glukosa hasil epimerisasi galaktosa dan manosa akan masuk dalam
tahap awal proses fermentasi untuk menghasilkan asam piruvat, asam
asetat dan CO2 dan kemudian pada tahap kedua fermentasi asam piruvat
dan asam asetat di reduksi kembali oleh atom hidrogen yang dilepaskan
dalam tahap pertama, membentuk asam laktat dan etanol (Volk dan
Wheeler, 1993).
13
Pada medium glukosa,laktosa,sukrosa,manitol diperoleh hasil
positif, yaitu adanya perubahan warna ungu menjadi kuning yang
menandakan bahwa bakteri ini membentuk asam dari fermentasi
glukosa,laktosa,sukrosa,manitol. Adanya gelembung pada tabung
durham menandakan bahwa hasil fermentasi dari bakteri Klebsiella
berbentuk gas dan dikarenakan oleh bakteri Klebsiella membutuhkan
oksigen dalam proses metabolismenya.
SIM (Sulfur,Indol ,Motiliti)
Tryptophan merupakan asam amino esensial yang dapat
mengalami oksidasi dengan cara kegiatan enzimatik beberapa bakteri.
Konversi triptofan menjadi produk metabolik di mediasi oleh enzim
Tryptophanase. Media ini biasanya digunakan dalam indetifikasi yang
cepat. Perbenihan indol digunakan untuk melihat kemampuan bakteri
mendegradasi asam amino triptofan secara enzimatik.
Hasil uji indol yang diperoleh Negatif karena Tidak terbentuk
lapisan (cincin) berwarna merah muda pada permukaan biakan, artinya
bakteri ini tidak membentuk indol dari tryptopan sebagai sumber
karbon, yang dapat diketahui dengan menambahkan larutan kovaks.
Asam amino triptofan merupakan komponen asam amino yang lazim
terdapat pada protein, sehingga asam amino ini dengan mudah dapat
digunakan oleh mikroorganisme akibat penguraian protein .sulfur
negatif,motiliti negatif
MR
Uji MR Perbenihan ini digunakan untuk mendeteksi bakteri yang
memiliki kemampuan untuk mengoksidasi glukosa menghasilkan
produk asam berkonsentrasi tinggi yang stabil sehingga menyebabkan
pH media turun hingga dibawah 4,4 yang ditandai dengan hasil positif,
terjadi perubahan warna menjadi merah setelah ditambahkan Methyl
Red. Artinya, bakteri ini mengahasilkan asam campuran (metilen
14
glikon) dari proses fermentasi glukosa yang terkandung dalam medium
MR-VP (Lehninger, 1995).
Pada medium MR diperoleh hasil negatif, yaitu tidak adanya
perubahan warna kuning keemasan menjadi merah, hal ini menandakan
bahwa bakteri Klebsiella tidak membentuk asam dari fermentasi MR.
Komposisi dari medium MR adalah media kaldu yang mengandung
pepton, buffer, dan glukosa. Dari kandungan inilah Klebsiella tidak
mengurai MR untuk proses metabolismenya.
Uji VP
Dengan hasil negatif tidak terbentuk warna merah pada medium
setelah ditambahkan α-napthol dan KOH, artinya hasil akhir fermentasi
bakteri inibukan asetil metil karbinol (asetolin) (Volk dan Wheeler,
1993).
Pada medium VP diperoleh hasil positiftif, yaitu adanya
perubahan warna yang terjadi. Hal ini dikarenakan oleh bakteri
Klebsiella membentuk basa dari fermentasi VP. Komposisi dari medium
VP adalah media kaldu yang mengandung pepton, buffer, dan glukosa.
Dari kandungan inilah mengapa Klebsiella dapat mengurai VP untuk
proses metabolismenya.
Simmon’s Citrat
Perbenihan ini digunakan untuk melihat kemampuan organisme
enterik berdasarkan kemampuan memfermentasi sitrat sebagai sumber
karbon. Perbenihan Simmon’s Citrate ini mengandung indikator biru
bromtimol yang akan berubah menjadi biru pada reaksi positif dan tetap
hijau jika reaksi negatif (Volk dan Wheeler, 1993).
Pada medium Simon Sitrat hasil positif yang berarti bakteri ini
memiliki kemampuan organisme enterik berdasarkan kemampuan
memfermentasi sitrat sebagai sumber karbon. Perbenihan Simmon’s
Citrate ini mengandung indikator biru bromtimol yang akan berubah
menjadi biru pada reaksi positif dan tetap hijau jika reaksi negatif
15
Urease
Tujuan dari uji ini adalah untuk mengetahui apakah kuman
mempunyai enzim urease yang dapat menguraikan urea membentuk
amoniak. Media urea berisi indikator phenol red.
Pada medium urea diperoleh hasil positif, yaitu terjadinya perubahan
warna dari kuning menjadi pink. Hal ini dikarenakan oleh, bakteri
Klebsiella membutuhkan urea untuk proses metabolismenya. Komposisi
dari urea, yaitu: buffer, urea, sedikit nutrient, indicator phenol red. Dari
kandungan inilah mengapa Klebsiella dapat mengurai urea untuk proses
metabolismenya.
TSIA didapat hasil : kuning/ kuning,gas (+),sulfur(-)
H. Kesimpulan
Dari hasil praktikum didapat derajat kemiripan 13/14 x 100 % = 93%
merujuk ke bakteri Klebsiella . dengan sub spesies oxytoka,karena pada uji
Indo (+).Bakteri Klebsiella oxytoka adalah bakteri gram-negatif berbentuk
batang yang terkait erat dengan Klebsiella pneumoniae, yang darinya
dibedakan dengan indol-positif; itu juga memiliki karakteristik pertumbuhan
yang sedikit berbeda dalam hal ia mampu tumbuh pada melezitose, tetapi
tidak 3-hydroxybutyrate.
16
I. Daftar Pustaka
https://hidesideofme.wordpress.com/laporan-praktikum-agent-penyakit/laporan-
praktikum-uji-biokimia
http://digilib.unila.ac.id/18788/17/BAB%20II.pdf
https://hadisutawijaya.wordpress.com/tag/identifikasi-klebsiella-pneumonia/
https://agroteknologi.web.id/sains/ciri-dan-klarifikasi-enterobacter-aerogenes/
17
J. Lampiran
Dokumentasi hasil praktikum
Sebelum ditanam Sesudah ditanam
Media MC
18
Uji Vp Uji Vp(+)
Uji MR MR(-)
TSIA
Lereng : Kuning
(asam)
Dasar : Kuning
(asam)
Gas : Positif
Sulfur : Negatif
19