DAT dan IAT

Dua bentuk tes antiglobulin digunakan dalam

imunohaematologi. antiglobulin fesf langsung dan tes
antiglobulin tidak langsung.
Tes antiglobulin langsung (DAT) dimaksudkan untuk
mendeteksi sensitisasi eritrosit pasien secara in vivo.
DAT digunakan untuk studi tentang anemia hemolitik
autoimun (AIHA), penyakit hemolitik pada bayi baru
lahir (HDN) dan juga untuk mendeteksi penyebab
reaksi transfusi hemolitik (HTR). Pada DAT, hanya
serum globulin anti-manusia yang ditambahkan ke
eritrosit pasien, sehingga tidak ada reagen lain,
potensiator (seperti albumin atau PEG) atau media
LISS yang ditambahkan, karena eritrosit sudah peka
dengan antibodi.
Ketika DAT positif, itu berarti eritrosit pasien peka
dengan antibodi dan ini dapat menunjukkan salah satu
kemungkinan berikut:
. autoantibodi terhadap eritrosit pasien sendiri (AIHA)
. antibodi dari ibu terhadap eritrosit anaknya yang baru
lahir (HDN)
. alloantibodi terhadap eritrosit yang terbentuk setelah
transfusi sebelumnya (HTR)
Pertama, DAT dilakukan dengan serum globulin anti-
manusia spesifik polis, yang mengandung anti-lgG dan
anti-pelengkap. Pada tes tindak lanjut (dengan DAT
positif) sel darah merah diuji secara terpisah dengan
anti-lgG dan anti-komplemen.
Tes antiglobulin tidak langsung (lAT) digunakan untuk
mengidentifikasi antibodi in vitro (allo) yang terikat
untuk menguji eritrosit (sel panel) (lihat juga gambar 5:
Vlll). Antibodi dalam serum atau sampel plasma
dideteksi karena mereka terikat dengan eritrosit uji.
IAT digunakan untuk mendeteksi keberadaan antibodi
eritrosit dalam skrining antibodi, identifikasi antibodi
silang dan dm. Dalam serum globulin anti-manusia
IAT ditambahkan setelah inkubasi dari eritrosit uji
dengan eritrosit pasien, biasanya di hadapan
potensiator reaksi, seperti albumin, poliben atau PEG,
atau sel-sel ditangguhkan dalam medium LISS. Ketika
IAT positif, itu berarti bahwa antibodi hadir dalam
sampel serum diarahkan melawan antigen pada tes
eritrosit (skrining dan identifikasi) atau donor eritrosit
(crossmatch).
5.4.2. Tes antiglobulin langsung terdiri dari tiga fase
Tes antiglobulin tidak langsung terdiri dari tiga fase:
sensitisasi, pencucian dan fase antiglobulin.
Pada fase pertama, fase sensitisasi, serum diinkubasi
dengan
eritrosit. Ketika ada antibodi dalam serum, mereka
akan berikatan dengan
eritrosit.
@ Pada fase kedua, eritrosit dicuci bersih untuk
menghilangkan semua
imunoglobulin tidak terikat. Ini penting karena
imunoglobulin non-terikat dapat berinteraksi dengan
molekul antiglobulin dan dengan demikian
menetralkan serum globulin anti-manusia dan
menyebabkan reaksi negatif palsu.
@ Pada fase ketiga, serum globulin anti-manusia
ditambahkan. AHG mengandung antibodi terhadap lgG
manusia. Antibodi ini berikatan dengan molekul lgG,
terikat pada eritrosit, sehingga membentuk jembatan
dan menggumpalkan sel darah merah.
5.4.3 Faktor-faktor yang mempengaruhi sensitivitas
lAT
Pada setiap fase IAT, ada faktor-faktor yang
memengaruhi sensitivitas tes.
Pada fase pertama, fase sensitisasi, aspek-aspek berikut
ini penting:
al Rasio serum dan sel: Umumnya, satu volume
(setetes) 3-5 eritrosit
suspensi ditambahkan ke dua volume (tetes) serum.
Ketika reaksinya sangat
lemah, jumlah volume serum bisa meningkat.
media informasi: Dalam bab 5.2 dan 5.3 dijelaskan
bagaimana pengikatan
Antibodi terhadap eritrosit sangat meningkat ketika
mantel air dan awan ion di sekitar eritrosit berkurang,
atau ketika ikatan antigen-antibodi ditingkatkan. Media
di mana eritrosit ditangguhkan karena itu sangat
berpengaruh pada kecepatan dan kekuatan yang
dengannya antibodi berikatan dengan eritrosit.
Albumin atau polybrene (penurunan potensi zeta)
meningkatkan pengikatan antibodi terhadap eritrosit.
Ikatan antara antibodi dan antigen meningkat dalam
medium dengan kekuatan ionik rendah (LISS) atau
dengan polietilen glikol (PEG). Tes antiglobulin sering
dilakukan dalam medium LISS atau setelah
menambahkan albumin, PEG atau polybrene.
cl Acidity (pH): Sebagian besar antibodi eritrosit
bereaksi secara optimal pada pH antara 5.b dan 8.5.
Beberapa antibodi lebih mudah dideteksi pada pH yang
lebih rendah.
dl suhu inkubasi: Suhu optimal untuk reaktivitas
antibodi lgG adalah 37 "C.
waktu inkubasi: Umumnya inkubasi 15-30 menit
mencukupi untuk alt antibodi penting untuk berikatan
dengan antigen yang sesuai.
@ Pada fase kedua, penting bahwa mencuci dilakukan
dengan akurat. Setelah prosedur pencucian, semua
molekul imunoglobulin yang tidak terikat akan
dikeluarkan (sebenarnya; harus begitu banyak
diencerkan sehingga tidak akan mengganggu reaksi:
mis. LgG yang tidak terikat telah diencerkan dengan
cukup). Ketika prosedur pencucian tidak dilakukan
dengan benar, imunoglobulin gratis mungkin masih
ada dalam larutan.
Jika, dalam hal ini, serum globulin anti-manusia
ditambahkan, anti-lgG akan bereaksi dengan lgG
gratis. Penting untuk selalu memeriksa apakah
pencucian dilakukan dengan benar dengan
menambahkan apa yang disebut "sel kontrol Coombs"
setelah pencucian ketiga, jika reaksi dengan sel darah
merah negatif. Sel-sel kontrol ini peka dengan lgG
anti-tubuh yang harus diaglutinasi oleh anti-lgG dalam
serum antiglobulin. Ini hanya terjadi ketika serum
antiglobutin masih aktif, yaitu tidak dinetralkan.
Dengan demikian, reaksi negatif dalam IAT hanya
dapat diandalkan jika
sel-sel kontrol diaglutinasi. Jika tidak, aktivitas serum
antiglobulin harus diperiksa.

Karena konstanta kesetimbangan K dari sebagian besar

antibodi lgG lebih tinggi pada suhu yang lebih rendah
(kompleks AbAg tetap utuh pada suhu yang lebih
rendah, lihat bab 1), sensitivitas uji antiglobulin
meningkat dengan mencuci pada suhu 4oC. Antibodi
yang lebih sedikit kemudian dikeluarkan dari eritrosit.
@ Serum antiglobulin harus selalu mengandung anti-
lgG. Anti-lgA tidak diperlukan karena alloantibodi
yang hanya lgA tidak pernah ditemukan. Jika lgA-
aloantibodi hadir, lgG-antibodi dengan spesifisitas
yang sama selalu ada juga.
Anti-lgM juga tidak perlu. Pada umumnya, antibodi
lgM adalah antibodi dingin dan tidak relevan secara
klinis. Dalam kasus apa pun, antibodi lgM dapat
menggumpalkan eritrosit secara langsung, dan dengan
demikian anti-lgM tidak diperlukan. Untuk
pendeteksiannya, beberapa antibodi lgG dan lgM dapat
dideteksi dengan lebih baik dengan anti-komplemen,
terutama antibodi lgG yang mengikat dan antibodi lgM
yang tidak lengkap. Fiksasi satu (lgM atau lgG)
molekul antibodi pengikat komplemen pada sel merah
mengarah pada fiksasi banyak molekul komplemen.
Sensitivitas tes kemudian dapat sangat ditingkatkan
dengan menggunakan anti-pelengkap.
Untuk sebagian besar tujuan, serum globulin anti-
manusia harus mengandung anti-komplemen, selain
anti-lgG. Penting bahwa anti-C3d (atau anti-C3g) ada
dalam serum globulin anti-manusia. Selain itu, anti-
C3c juga mungkin ada. Ada dua alasan mengapa anti-
C3d (atau anti-C3g) penting. Pertama, karena pada sel
peka in vivo dengan komplemen, C3d (dan C3g) ada,
tetapi tidak C3c. Kedua, karena C3c dipisahkan dari sel
selama waktu inkubasi yang lama (lebih dari 1,5 jam).
Baik C3c, C3d dan C3g adalah penentu antigenik pada
molekul C3b. C3b terikat ke eritrosit ketika
komplemen diaktifkan (lihat bab 1).
Serum globulin anti-manusia yang mengandung anti-
lgG dan anti-komplemen disebut serum globulin anti-
manusia polispesifik. Ini terutama digunakan dalam tes
antiglobulin dalam saline, albumin atau LISS. Dalam
teknik PEG dan polybrene hanya anti-lgG yang
digunakan (serum anti-manusia globulin
monospesifik), karena dalam teknik ini anti-pelengkap
hampir selalu memberikan hasil positif palsu. Dan
selain itu, teknik PEG sangat sensitif sehingga antibodi
lgG yang dapat dideteksi dalam teknik lain hanya
karena kapasitas aktivasi komplemen mereka (seperti
anti-Jk "dan anti-Jkb) dapat diidentifikasi dalam PEG-
lAT tanpa anti- melengkapi.
Tes untuk mendeteksi antibodi celi merah: dari tabung
ke kolom
Pada hari-hari awal, teknik aglutinasi dilakukan pada
slide, tetapi kemudian tes aglutinasi dilakukan dalam
tabung gelas, disebut sebagai "metode tabung ,,.
Selama beberapa tahun terakhir, ada banyak
perkembangan baru dalam optimasi tes antiglobulin,
antara lain, dengan meningkatkan media reaksi dan
potensiator.
Selain metode tabung, tes kolom telah dikembangkan,
generasi pertama dari mereka di akhir tahun delapan
puluhan. Tes kolom pertama ini semua didasarkan pada
tes antiglobulin (tidak langsung). Mereka juga disebut
sebagai teknik aglutinasi kolom (atau gel). Pada teknik
ini, aglutinasi eritrosit peka yang ditangguhkan dalam
LISS, diperoleh dalam kolom gel dengan serum
globulin anti-manusia. Eritrosit dan serum diinkubasi
di kompartemen inkubasi di atas gel (gambar b-lx).
Setelah inkubasi, kolom disentrifugasi, menyebabkan
eritrosit naik 1 "melalui gel. Eritrosit peka
menggumpal setelah bereaksi dengan serum globulin
manusia-manusia yang ada dalam gel. Setelah
sentrifugasi, aglutinat tertinggal dalam bahan kolom,
yang berfungsi sebagai semacam saringan.
Erythiocytes non-sensitized tidak bereaksi dengan
serum globulin anti-manusia dalam gel dan akan
melewati gel ke
bagian bawah kolom (gambar 5-X). Pemisahan fisik
agtutinit didasarkan pada ukuran dan filtrasinya
melalui gel. Dengan sentrifugasi eritrosit dipisahkan
dari serum dan, oleh karena itu, dari immunoglobutin
yang tidak terikat, yang tetap berada di kompartemen
inkubasi kolom. Jadi, tidak sulit untuk mencuci
eritrosit setelah diinkubasi dengan serum dalam kolom.
Ada beberapa keuntungan dari teknik kolom daripada
"metode tabung" tradisional. Metode ini cepat, bisa
otomatis dan eritrosit yang peka tidak perlu dicuci.
Selain itu, hasil (reaksi) diatur, dapat ditafsirkan
dengan baik ("pendapat kedua") nanti dan dapat
dibaca, jika diinginkan, oleh pembaca.
Sejak akhir tahun sembilan puluhan, jenis tes kolom
kedua ada di pasaran. Tes kolom generasi kedua ini
tidak didasarkan pada aglutinasi eritrosit peka, tetapi
pada pengikatan langsung eritrosit peka terhadap
matriks gel di dalam kolom. Sistem pengujian ini
didasarkan pada "teknologi fase padat" dan disebut
sebagai teknik afinitas kolom (atau gel).
Kolom immuno-afinitas mengandung fase aktif,
imunoreaktif dalam medium dengan kepadatan tinggi.
Pada tes afinitas kolom ini, eritrosit peka secara
langsung dipasang pada fase aktif dalam kolom (lihat
gambar s-Xll). Fase imunoreaktif ini mengandung
protein G (atau protein A dan protein G), faktor anti-
lgM dan anti-komplemen C3d yang melekat pada
matriks gel (gel afinitas). Protein G adalah protein dari
dinding sel Streptococci dan berikatan dengan afinitas
tinggi terhadap bagian Fc dari keempat subkelas lgG
manusia.
Dengan demikian, eritrosit peka akan tetap berada di
bagian atas kolom, sementara semua yang tidak, atau
tidak cukup, eritrosit peka akan bermigrasi ke bawah
selama sentrifugasi. Pada reaksi 4 + yang sangat
positif, semua eritrosit akan melekat di bagian atas
kolom, sedangkan pada reaksi negatif (-), semua
eritrosit akan menuju ke bagian bawah kolom gel. Pada
reaksi yang kurang kuat dari 4+, beberapa eritrosit
akan mencapai bagian bawah kolom. Semakin lemah
reaksinya, semakin banyak sel yang terkumpul di
bagian bawah kolom setelah sentrifugasi. Rasio antara
sel-sel merah di bagian atas dan di bagian bawah
menentukan kekuatan reaksi, yang dapat bervariasi dari
0,5+ hingga 3+ (gambar b-Xlll).
Pembuat sistem afinitas kolom adalah Sanquin (sistem
Cellbind)
6.7 Identifikasi antibodi eritrosit
Jika, dalam skrining serum pasien atau dalam
crossmatch, reaksi positif telah ditetapkan, spesifisitas
antibodi harus ditentukan sebelum transfusi darah
dapat diberikan. Untuk melakukan uji spesifisitas
seperti itu, diperlukan panel sel yang lebih luas. Panel
identifikasi ini terdiri dari berbagai eritrosit
yang positif atau negatif untuk antigen golongan darah
yang paling penting. Panel identifikasi terdiri dari I
hingga 2O suspensi eritrosit yang berbeda. Antigen
golongan darah berikut selalu ada pada satu atau lebih
sel panel identifikasi: antigen Rhesus-C, D, E, c, e, C
*; antigen Kell K, k, Kpb, J "b, dan kadang-kadang Kp
', Js"; Fuffy Duffy-antigen, dan Fyb; antigen Kied-Jk ^
dan Jkb, antigen-Lewis Le "dan Leb; pl; antigen-
antigen MNS, M, N, s, dan antigen Lutheran-antigen
Lu" dan Lub. Contoh panel identifikasi diwakili dalam
gambar 6-2.
Identifikasi antibodi dilakukan sebanyak mungkin
sesuai dengan protokol tetap. Seperti dalam skrining
antibodi, tes antiglobulin tidak langsung adalah metode
tradisional untuk identifikasi antibodi. Tes dilakukan
dengan menambahkan albumin atau PEG. Sel-sel panel
juga dapat ditangguhkan dalam LISS atau diperlakukan
dengan enzim. Teknik-teknik baru, seperti sistem
kolom dan metode pelat mikrotiter fase padat, menjadi
semakin populer (lihat bab S).
Pola reaksi yang diperoleh dengan panel identifikasi ini
menentukan spesifisitas antibodi (lihat bab 6.7.1).
Hasil yang diperoleh dengan panel identifikasi hanya
dapat diandalkan secara statistik jika mereka
memenuhi kriteria metode eksak Fisher. Jika
spesifisitas suatu antibodi tidak dapat ditentukan
dengan cara yang dapat diandalkan secara statistik,
serum tersebut harus diuji dengan sel-sel dari sejumlah
donor yang homozigot atau negatif untuk antigen yang
dengannya antibodi mungkin diarahkan. Ketika
spesifisitas antibodi telah ditentukan, perlu ditentukan
apakah antibodi tersebut merupakan autoantibodi atau
alloantibodi. diselidiki apakah antigen hadir pada sel
darah merah pasien (pengetikan antigen, lihat bab
6.7.3). Pada tabel 6-l dijelaskan bagaimana perbedaan
dapat dibuat antara aloantibodi dan autoantibodi
dengan melakukan DAT, dan kemudian eluate dari sel
jika DAT positif (lihat
bab 8).
Harus ditentukan apakah antibodi spesifik yang
terdeteksi dalam serum adalah alloantibodi atau
autoantibodi. Jika antibodi adalah antibodi hangat lgG,
ini dapat dilakukan sebagai berikut:
1) Tes antiglobulin langsung pada sel darah merah
dilakukan. Jika DAT negatif,
antibodi dalam serum hampir pasti alloantibodi.
2)] jika DAT positif, itu bisa berarti bahwa antibodi
dalam serum adalah autoantibodi, tetapi bisa juga
berarti bahwa ada kombinasi alloantibodi dalam serum
dan autoantibodi pada sel darah merah. Mengetik sel
darah merah pasien untuk antigen yang menjadi
sasaran antibodi dalam serum, akan membantu
menyelesaikan masalah ini. Namun, typing hanya
dimungkinkan dengan pereaksi lgM monoklonal,
karena jika tidak tes akan positif, terlepas dari
keberadaan antigen. Jika pengetikan tidak
memungkinkan, eluat harus disiapkan dari sel darah
merah pasien. Jika dalam eluat, hanya antibodi yang
dapat dideteksi dengan spesifisitas yang sama dengan
yang ada dalam serum, dapat disimpulkan bahwa
antibodi tersebut merupakan autoantibodi (kecuali
pasien baru saja ditransfusikan). Jika pola reaksi eluat
berbeda dari serum, maka
investigasi menjadi lebih efektif: lihat bab 8.6.4
Jika antibodi dalam serum adalah aglutinin dingin dan
tidak ada autoaglutinasi sel darah merah pasien sendiri,
antibodi tersebut kemungkinan adalah alloantibodi. Ini
dapat dikonfirmasi dengan menguji serum dengan sel
darah merah pasien sendiri dan / atau, dengan
mengetikkan sel darah merah pasien untuk antigen
yang sesuai pada 370 C. Jika ada autoaglutinasi
sel darah merah pasien harus dicuci terlebih dahulu
pada 370 C untuk menghilangkan autoaglutinasi.
Setelah mencuci serum pasien dapat diuji dengan sel
darah merah pasien sendiri dan / atau diketik untuk
antigen yang sesuai.