Metode berbasis spektrofotometri UV baru untuk menentukan konsentrasi dan

kandungan karbon larutan karbohidrat dikembangkan. Metode ini tergantung pada

potensi penyerapan UV yang melekat dari produk sampingan hidrolisis
karbohidrat yang dibentuk oleh reaksi dengan asam sulfat pekat (turunan
furfural). Metode yang diusulkan adalah perbaikan besar atas metode Phenol-
Sulfuric Acid yang banyak digunakan yang dikembangkan oleh DuBois, Gilles,
Hamilton, Rebers, dan Smith (1956). Dalam metode lama, furfural dibiarkan
mengembangkan warna melalui reaksi dengan fenol dan konsentrasinya dideteksi
oleh penyerapan cahaya tampak. Di sini kami menyajikan metode yang
menghilangkan langkah pewarnaan dan menghindari bahaya kesehatan dan
lingkungan yang terkait dengan penggunaan fenol. Selain itu, penghindaran
langkah ini terbukti meningkatkan akurasi pengukuran sambil secara signifikan
mengurangi waktu tunggu sebelum pembacaan penyerapan cahaya. Karbohidrat yang
konsentrasi dan kandungan karbonnya dapat diestimasi secara andal dengan
teknik Sulfuric Acid-UV cepat baru ini meliputi: monosakarida, disakarida dan
polisakarida dengan berat molekul sangat tinggi.

Penentuan konsentrasi karbohidrat dalam larutan air adalah komponen yang

sangat penting dari beberapa bidang penelitian lingkungan (Fukasawa, Tateno,
Hagiwara, Hirose, & Osono, 2012; Goupil et al., 2012; Raynaud, Vaxelaire,
Olivier, Dieude-Fauvel , & Baudez, 2012; Takei, Bartolo, Fujihara, Ueta, &
Donald, 2012; Yu et al., 2012; Zhang, Banks, & Heaven, 2012) serta aplikasi
industri dalam minyak bumi (Fujieda, Kitamura, Yamasaki, Furuishi, &
Motobayashi, 2012; Pilavtepe, Sargin, Celiktas, & Yesil-Celiktas, 2012;
Trzcinski, Hernandez, & Webb, 2012; Zhao et al., 2012; Zheng et al., 2012),
farmasi (Bai et al., 2012), farmasi al., 2012; Coura et al., 2012; Lee, Hsieh,
Chen, & Chiang, 2012; Pereira et al., 2012; Zha et al., 2012), dan industri
makanan (Al-Sheraji et al. , 2012; Golovchenko, Khramova, Ovodova, Shashkov, &
Ovodov, 2012; Rondan-Sanabria, Valcarcel-Yamani, & Finardi-Filho, 2012; Sheu &
Lai, 2012; Vriesmann, Teo fi le, & de Oliveira Petkowicz, 2012). Keragaman luas
karbohidrat yang terlibat dalam bidang ini telah menyebabkan pengembangan
berbagai teknik analitik untuk mengukur konsentrasi karbohidrat termasuk
kromatografi (Jahnel, Ilieva, & Frimmel, 1998; Mason & Slover, 1971;
Prodolliet et al., 1995), elektroforesis kapiler (Cortacero-Ramirez, Segura-
Carretero, Cruces-Blanco, de Castro, & Fernandez-Gutierrez, 2004; ElRassi &
Mechref, 1996; Soga & Serwe,
2000), spektroskopi inframerah (IR) (Kadet, 1999; Robert & Cadet, 1998; Wang,
Liu, Li, Chang, & Jing, 2011), deteksi hamburan cahaya (Suortti, Gorenstein, &
Roger, 1998; Zhang, Sheng, & Yu, 2008) dan spektroskopi Nuclear Magnetic
Resonance (NMR) (Copur, Kiemle, Stipanovic, Koskinen, & Makkonen, 2003;
Duquesnoy, Castola, & Casanova, 2008). Penggunaan banyak metode ini
membutuhkan investasi finansial yang besar, keterampilan analitis yang
canggih, dan waktu. Salah satu pendekatan yang paling fleksibel, relatif mudah
dan murah untuk penentuan konsentrasi karbohidrat adalah metode kolorimetri
berdasarkan reaksi antara larutan karbohidrat terhidrolisis dan pereaksi
pewarna yang mengembangkan warna yang dapat dideteksi dalam rentang yang
terlihat dari spektrum elektromagnetik. Reagen yang biasa digunakan untuk
pengembangan warna termasuk fenol (C6H5OH) (DuBois et al., 1956), alkali
ferricyanide (2K4Fe (CN) 6) (Englis & Becker, 1943), dan anthrone (C14H10O)
(Dreywood, 1946).
Di antara metode kolorimetri untuk analisis karbohidrat, metode Phenol-
Sulfuric dari DuBois et al. (1956) sejauh ini merupakan metode yang paling
dapat diandalkan dan telah banyak digunakan dalam berbagai bidang. Pada saat
penulisan makalah ini, lebih dari 23.700 artikel peer-review yang berbeda
(termasuk lebih dari 1000 artikel peer-review pada tahun 2012 saja) diindeks
oleh Web of
Science® (Thommpson Reuters) mengutip makalah metode
DuBois et al. (1956). Metode Phenol-Sulfuric Acid tergantung pada dehidrasi
sakarida terhidrolisis menjadi turunan furfural selama reaksi dengan asam
sulfat pekat (Asghari & Yoshida, 2006; Bicker, Hirth, & Vogel, 2003; DuBois et
al., 1956; Hung, Selkirk, & Taylor, 1982; Itagaki, 1994; Lima et al., 2010;
Rao & Pattabiraman, 1989). Reaksi selanjutnya dari turunan furfural

dengan bentuk fenol kompleks berwarna yang menyerap cahaya dalam jarak
pandang, dengan serapan maksimum pada panjang gelombang 490 nm (DuBois et al.,
1956; Rao & Pattabiraman, 1989).
Meskipun lebih mudah digunakan daripada banyak metode yang tersedia, metode
Phenol-Sulfuric Acid memiliki beberapa kelemahan serius. Pertama, zat pewarna
yang digunakan dalam metode ini, fenol, memiliki banyak bahaya kesehatan.
Fenol dan uapnya bersifat korosif terhadap kulit, mata, dan sistem pernapasan.
Kontak berulang dan berkepanjangan dengan kulit dapat menyebabkan dermatitis
atau luka bakar tingkat kedua dan ketiga. Demikian pula, inhalasi uap fenol
yang lama atau berulang-ulang menyebabkan edema paru-paru. Paparan fenol
jangka panjang juga memiliki dampak serius pada sistem saraf pusat (ini adalah
neurotoksin yang kuat), ginjal, dan hati (Budavari, 1996; Lin, Lee, Lai, &
Lin, 2006; Michalowicz & Duda, 2007 ). Phenol adalah salah satu dari 126
'Polutan Prioritas' yang saat ini diatur oleh Badan Perlindungan Lingkungan
A.S. (Lampiran A hingga 40 CFR Bagian 423). Kedua, hasil dari metode Phenol-
Sulfuric Acid standar disajikan dalam hal konsentrasi setara glukosa.
Representasi ini mungkin memiliki keterbatasan potensial ketika berhadapan
dengan karbohidrat kompleks yang bukan polimer glukosa sederhana. Akhirnya,
reaktivitas kimia karbohidrat dengan pereaksi derivatisasi (asam sulfat)
sangat tergantung pada apakah karbohidrat itu netral atau anionik. Sebagai
hasilnya, koefisien penyerapan molar dapat sangat bervariasi tergantung pada
muatan karbohidrat yang dianalisis (Mecozzi, 2005).

Tujuan dari pekerjaan ini adalah untuk mengembangkan alternatif untuk

metode orimetri DuBois et al. (1956) yang mengurangi kelemahan yang tercantum
di atas dengan mengurangi waktu tunggu reaksi, meningkatkan akurasi
pengukuran, menghilangkan bahaya yang ditimbulkan oleh penggunaan fenol, dan
memungkinkan korelasi langsung penyerapan cahaya dengan konsentrasi total
karbon dalam larutan dalam air.
Motivasi untuk penelitian ini berasal dari karya Itagaki (1994), yang
menunjukkan bahwa larutan air furfural memiliki maksimum penyerapan sinar UV
pada 277 nm. Selain itu, Itagaki (1994) menunjukkan bahwa glukosa dan selulosa
menyerap sinar UV pada 323 nm setelah hidrolisis melalui reaksi dengan asam
sulfat pekat. Pergeseran bathochromic dalam penyerapan maksimum dari 277 nm ke
323 nm disebabkan oleh adanya asam sulfat dalam larutan (Hammond & Modic,
1953; Kanetake & Otomo, 1988; Premakumari et al., 2011; Srivastava & Kumar,
2007). Telah ditunjukkan bahwa pergeseran bathokromik umumnya meningkat dengan
konsentrasi asam sulfat yang digunakan sebagai pelarut (Itagaki, 1994; Layne,
Jaffe, & Zimmer, 1963; LP, 1974).
Dalam tulisan ini, kami akan memperkenalkan metode untuk menentukan
konsentrasi gula dan kandungan karbon dari larutan berair yang tergantung pada
absorbansi UV dari turunan furfural yang dihasilkan oleh reaksi dengan asam
sulfat pekat. Kami akan menyajikan perbandingan antara metode Phenol-Sulfuric
Acid standar dan metode Sulfuric Acid-UV yang diusulkan menggunakan larutan
berair netral (glukosa, fruktosa, sukrosa, pati, dekstran dan actigum) dan
anionik (asam poligalakturionat (PGA) ) dan xanthan) karbohidrat yang banyak
digunakan dalam penelitian lingkungan dan aplikasi industri.
2.1. Reagen dan aparatus

Semua bahan kimia yang digunakan dalam penelitian ini adalah kelas reagen
analitis. Glukosa (C6H12O6) diperoleh dari Sigma-Aldrich. Frukos (C6H12O6),
sukrosa (C12H22O11), pati ((C6H10O5) n), fenol (C6H6O) dan kalium hidroksida
(KOH) diperoleh dari Fisiotific Scientific. Asam sulfat pekat (H2SO4)
diperoleh dari ACROS. Asam polygalacturonic (PGA) ((C6H8O6) n), xanthan
((C35H49O25) n) dan dextran ((C6H12O6) n) diperoleh dari MP Biomedis. Actigum
((C24H40O19) n) diperoleh dari Cargill
perusahaan. Pengukuran penyerapan dilakukan pada Thermo Sci fi cific Evolution
300 UV-vis Spectrophotometer.
Larutan stok masing-masing karbohidrat disiapkan dengan menghilangkan 0,1 g
karbohidrat kering dalam 1 L air double milipore (DDI). Karena PGA tidak larut
dalam air, itu dibuat larut dengan penambahan kalium hidroksida (KOH). Telah
dilaporkan sebelumnya bahwa 0,46 mL KOH diperlukan untuk melarutkan 100 mg PGA
(Czarnes, Hallett, Bengough, & Young, 2000). Namun, percobaan pendahuluan kami
menunjukkan bahwa pH larutan yang disiapkan adalah indikator kelarutan PGA
yang lebih baik. Kami menemukan bahwa pH larutan harus dinaikkan menjadi 12,4
untuk pelarutan lengkap dan prosedur ini digunakan selama penelitian ini.
Berbagai pengenceran larutan stok karbohidrat dibuat dengan memipet volume
larutan stok yang diketahui dan melengkapi volume dengan air DDI. Konsentrasi
yang disiapkan untuk penelitian ini adalah: 0, 0,01, 0,03, 0,05, dan 0,07 g /
L.

2.2. metode analitis

Dalam paragraf di bawah ini kami menjelaskan dua metode yang didasarkan pada
penyerapan cahaya dalam rentang yang terlihat dan UV: Metode Asam Fenol-Sulfat
(DuBois et al., 1956) dan metode Asam Sulfat-UV yang diusulkan, masing-masing.

2.2.1. Metode Asam Fenol-Sulfat

Ini adalah metode kolorimetri yang paling banyak digunakan hingga saat ini
untuk penentuan konsentrasi karbohidrat dalam larutan air (DuBois et al.,
1956). Prinsip dasar dari metode ini adalah bahwa karbohidrat, ketika
didehidrasi oleh reaksi dengan asam sulfat pekat, menghasilkan turunan
furfural. Reaksi lebih lanjut antara turunan furfural dan fenol mengembangkan
warna yang dapat dideteksi. Prosedur standar metode ini adalah sebagai
berikut. Alikuot 2 mL larutan karbohidrat dicampur dengan 1 mL larutan fenol
berair 5% dalam tabung reaksi. Selanjutnya, 5 mL asam sulfat pekat ditambahkan
dengan cepat ke dalam campuran. Setelah membiarkan tabung reaksi bertahan
selama 10 menit, mereka vortex selama 30 detik dan ditempatkan selama 20 menit
dalam bak air pada suhu kamar untuk pengembangan warna. Kemudian, penyerapan
cahaya pada 490 nm direkam pada spektrofotometer. Larutan referensi disiapkan
dengan cara yang sama seperti di atas, kecuali bahwa 2 mL aliquot karbohidrat
digantikan oleh air DDI. Fenol yang digunakan dalam prosedur ini diredistilasi
dan fenol 5% dalam air (b / b) disiapkan segera sebelum pengukuran.

2.2.2. Asam Sulfat - metode UV

Prosedur dari metode Sulfuric Acid-UV yang diusulkan adalah sebagai berikut.
Larutan alikuot karbohidrat 1 mL dicampur dengan cepat dengan 3 mL asam sulfat
pekat dalam tabung reaksi dan dipindahkan selama 30 detik. Suhu campuran naik
dengan cepat dalam 10-15 menit setelah penambahan asam sulfat. Kemudian,
larutan didinginkan dalam es selama 2 menit untuk membawanya ke suhu kamar.
Akhirnya, penyerapan sinar UV pada 315 nm dibaca menggunakan spektrofotometer
UV. Solusi rujukan disiapkan mengikuti prosedur yang sama seperti di atas,
kecuali bahwa karbohidrat aliquot diganti dengan air DDI.
2.2.3. Analisis total karbon
Salah satu tujuan dari pekerjaan ini adalah untuk menentukan apakah ada
hubungan linier antara penyerapan spektrofotometri larutan gula dan
konsentrasi karbon total larutan berair. Untuk tujuan ini, konsentrasi karbon
semua sinyal diukur menggunakan Shimadzu TOC-Vcsh analyzer. Namun, analisis
karbon total dari solusi xanthan dan actigum menggunakan penganalisa TOC tidak
dapat diandalkan. Karena karbohidrat ini membentuk suspensi kental, volume
sampel yang kecil diekstraksi oleh

Jarum penganalisa TOC tidak selalu mewakili. Oleh karena itu, kami
memperkirakan kadar karbon dari solusi ini sebagai:
 
konsentrasi karbohidrat (kandungan karbon). Demikian pula, persen pemulihan
(r) dihitung sebagai
 
[C] n MC p S (1)
NONA
 
[C] ∗
r = 100 [C]
 

(5)
 
di mana [C] secara teoritis dihitung total karbon (dalam massa / volume), n
adalah jumlah atom C dalam unit dasar molekul karbohidrat, MC adalah massa
molar atom karbon, MS adalah massa molar satu unit dari molekul karbohidrat, p
adalah kemurnian dari reagen karbidrat yang digunakan dinyatakan sebagai
fraksi, dan S adalah konsentrasi larutan karbohidrat yang disiapkan (dalam
massa / volume).

2.3. Waktu interaksi

Kami menguji efek waktu interaksi pada keakuratan kedua metode. Ini dilakukan
dengan memvariasikan waktu tunggu setelah asam sulfat pekat ditambahkan ke
dalam larutan karbohidrat. Efek waktu diuji pada larutan glukosa 0,01 dan 0,07
g / L dan waktu tunggu 5, 15, 30, 45, 75, 105, 135 dan 225 menit.

2.4. Validasi metode

Validasi metode baru (metode Sulfuric Acid-UV) dilakukan sesuai dengan pedoman
Konferensi Internasional tentang Harmonisasi (ICH) (ICH Harmonized Tripartite
Guidelines., 2005). Proses validasi dilakukan dalam hal metrik berikut: batas
deteksi (LOD), batas kuantifikasi (LOQ), linieritas, presisi, dan akurasi.
Selain itu, metode baru ini diuji untuk kemungkinan gangguan dari komponen
solusi yang menyerap dalam rentang UV yang menarik, terutama protein dan
flavonoid.
Batas deteksi (LOD) adalah konsentrasi analit terendah yang dapat dideteksi
tetapi tidak harus dikuantifikasi sebagai nilai eksak, sedangkan batas
kuantifikasi (LOQ) adalah konsentrasi analitik terendah yang dapat diukur
dengan presisi yang sesuai. dan akurasi (Currie, 1999). LOD dan LOQ dihitung
untuk konsentrasi karbo- hidrat versus absorbansi dan total karbon versus
hubungan absorbansi

LOD = 3.52ab (2)

LOQ = 16.67ab (3)
di mana ab adalah standar deviasi kosong masing-masing.
Linearitas uji mengacu pada kemampuan uji untuk memperoleh nilai respons yang
terkait dengan konsentrasi analit dengan fungsi matematika yang ditentukan.
Dalam istilah kuantitatif, linearitas dinyatakan sebagai koefisien regresi
untuk menyesuaikan poin data ke garis lurus. Linieritas dievaluasi dengan
metode regresi kuadrat terkecil dengan penentuan rangkap tiga pada setiap
tingkat konsentrasi.
Keakuratan prosedur analitis menggambarkan seberapa baik konsentrasi yang
diukur sesuai dengan nilai referensi yang diterima. Akurasi dinilai dalam hal
persentase kesalahan relatif dan persentase pemulihan rata-rata. Untuk tujuan
ini, satu set sampel rangkap tiga yang terpisah disiapkan dan konsentrasinya
ditentukan menggunakan persamaan kalibrasi yang tepat. Persentase kesalahan
relatif (ı) ditentukan sebagai

Rumus

di mana [C] * menunjukkan konsentrasi karbohidrat (karbon con-

tenda) ditentukan oleh metode baru dan [C] disiapkan
konsentrasi karbohidrat (kandungan karbon). Demikian pula, persen pemulihan
(r) dihitung sebagai
konsentrasi karbohidrat (kandungan karbon). Demikian pula, persen pemulihan
(r) dihitung sebagai

RUMUS
Ketepatan prosedur analitik mengungkapkan kedekatan persetujuan (derajat
sebaran) antara serangkaian pengukuran yang diperoleh dari beberapa sampel
dari sampel homogen yang sama di bawah kondisi yang ditentukan. Ketepatan
prosedur analitis biasanya dinyatakan dalam istilah standar deviasi (SD) dalam
serangkaian pengukuran.
Untuk menguji kemungkinan gangguan dari adanya protein dan / atau flavonoid
dalam larutan sampel, kami menguji absorbansi UV dari serum albumin (BSA) dan
larutan asam sinamat yang menjadi sasaran prosedur penuh dari Sulfuric yang
diusulkan. Metode asam-UV. Tujuan dari tes ini adalah untuk memeriksa apakah
reaksi dengan asam sulfat pekat akan mengurangi atau menghilangkan absorbansi
UV dari senyawa-senyawa ini yang diketahui menyerap sinar UV dalam kisaran
target.

2.5. Analisis statistik

Semua pengukuran dalam penelitian ini dilakukan pada tiga sampel berulang.
Semua titik data yang dilaporkan dan spektrum menunjukkan cara ulangan. Bar
kesalahan tidak ditampilkan dalam plot karena kekacauan membuatnya sulit untuk
membedakan antara simbol yang mewakili karbohidrat yang berbeda. Kesalahan
rata-rata dan standar dari semua data yang dilaporkan dalam gambar disediakan
dalam data pelengkap elektronik. Analisis data dilakukan dengan menggunakan
program perangkat lunak analisis statistik R. Perbedaan yang signifikan antara
rata-rata dianalisis dengan Tukey's HSD (jujur perbedaan signifikan) tes pada
tingkat probabilitas ˛ <0,05.

3. Hasil dan Pembahasan

Delapan karbohidrat diuji dalam penelitian ini, termasuk monosakarida (glukosa

dan fruktosa), disakarida (sukrosa), dan polisakarida (pati, actigum, dextran,
PGA dan xanthan). PGA dan xanthan pada dasarnya adalah karbohidrat anionik
sementara yang lainnya netral.
3.1. Spektrum serapan

Penyerapan cahaya di seluruh rentang spektrum elektromagnetik yang terlihat

untuk semua larutan karbohidrat yang disiapkan menurut metode Phenol-Sulfuric
Acid (DuBois et al., 1956) disajikan pada Gambar. A1 (Data tambahan). Gambar
menggambarkan fraksi cahaya yang diserap (sumbu y) sebagai fungsi dari panjang
gelombang (sumbu x). Semua karbohidrat, dengan pengecualian PGA, memiliki
penyerapan maksimum pada 490 nm, sesuai dengan metode asli (DuBois et al.,
1956; Rao & Pattabiraman, 1989). Semua konsentrasi PGA menunjukkan penyerapan
puncak pada 478 nm. Namun, dalam sisa makalah ini, standar penyerapan 490 nm
digunakan secara konsisten untuk PGA dan juga sisa karbohidrat. Demikian pula,
penyerapan sinar UV dalam spektrum sinar UV penuh untuk semua larutan
karbohidrat yang disiapkan sesuai dengan metode Sulfuric Acid-UV disajikan
pada Gambar. A2 (Data tambahan). Semua karbohidrat, kecuali PGA, menunjukkan
penyerapan maksimum pada 315 nm. Perhatikan bahwa puncak serapan ini sedikit
lebih kecil dari yang dilaporkan oleh Itagaki (1994) (322 nm). Ini sedikit
 
ı 100 [C] ∗ - [C]
[C]
 
(4)
 
pergeseran bathochromic terkait dengan perbedaan konsentrasi asam sulfat dalam
aliquot yang dianalisis. Semua konsentrasi PGA memiliki penyerapan maksimum
pada 297 nm. Namun, di sisa ini
 
di mana [C] * menunjukkan konsentrasi karbohidrat (karbon con-
tenda) ditentukan oleh metode baru dan [C] disiapkan
 
kertas, penyerapan pada 315 nm digunakan untuk PGA agar konsisten
dengan sisa karbohidrat.

GAMBAR

Gambar 1. Perbandingan efek waktu reaksi pada absorbansi untuk metode Phenol-
Sulfuric Acid (simbol penuh) dan Metode Sulfuric Acid-UV (simbol terbuka)
untuk dua konsentrasi glukosa. Perhatikan bahwa absorbansi berskala
menunjukkan absorbansi pada setiap waktu reaksi dinormalisasi dengan
absorbansi pada 225 menit, untuk masing-masing metode dan konsentrasi.

3.2. Efek waktu reaksi

Metode Phenol-Sulfuric Acid membutuhkan beberapa menit untuk pengembangan

warna yang terlihat. Sebaliknya, metode Sulfuric Acid-UV yang diusulkan
didasarkan pada penyerapan sinar UV dari karbohidrat dehidrasi, yang hanya
membutuhkan beberapa detik untuk diselesaikan. Dengan demikian, salah satu
fitur menarik dari metode yang diusulkan adalah penghematan waktu.
Pada Gambar. 1, waktu reaksi setelah penambahan asam sulfat ditambahkan ke
larutan karbohidrat dibandingkan dengan absorbansi skala untuk kedua metode.
Absorbansi berskala dihitung dengan membagi absorbansi pada setiap waktu
dengan absorbansi pada 225 menit, yang kami anggap sebagai pembacaan yang
stabil. Dari hasil ini terbukti bahwa metode Phenol-Sulfuric Acid memerlukan
> 30 menit untuk pewarnaan penuh turunan furfural melalui reaksi dengan fenol.
Rekomendasi waktu tunggu yang serupa sebelumnya dilaporkan oleh DuBois et al.
(1956) dan Rao dan Pattabiraman (1989). Sebaliknya, penyerapan UV dari
furfural dalam metode yang diusulkan mencapai tingkat stabil dengan cepat
segera setelah reaksi antara karbohidrat dan asam sulfat pekat diselesaikan.
kemungkinan besar dalam beberapa detik). Pengamatan kami konsisten dengan
Itagaki (1994) yang melaporkan bahwa absorbansi UV dari furfural tidak berubah
dari waktu ke waktu, tetap stabil hingga lima hari.
3.3. Pengukuran konsentrasi karbohidrat

Gambar. 2 menunjukkan hubungan antara absorbansi (sumbu-x) dan konsentrasi

karbohidrat yang berbeda dalam g / L (sumbu-y) untuk metode Asam Fenol-Sulfat
(Gambar 2a) dan metode Asam Sulfat-UV ( Gambar 2b). Dalam Tabel 1 kami
menunjukkan koefisien garis regresi linier secara individual cocok untuk semua
data karbohidrat yang diplot pada Gambar. 2 untuk kedua metode.
Sebelum membahas lebih lanjut manfaat metode yang diusulkan, penting untuk
memastikan bahwa absorbansi yang diukur memang hanya bergantung pada
konsentrasi larutan. Konsep ini dirangkum secara matematis dalam Hukum Beer-
Lambert yang menghubungkan absorbansi yang terukur dengan sifat larutan dan
geometri sampel
RUMUS
di mana A adalah absorbansi, <[L2 / M] adalah absorptivitas massa, C
[M / L3] adalah konsentrasi dan l [L] adalah panjang jalur sampel. Kami
memilih untuk menggunakan absorptivitas massa (bukan absorptivitas molar)
karena massa molar dari beberapa karbohidrat yang digunakan dalam penelitian
ini (termasuk actigum, dextran, PGA, pati dan xanthan) hanya dikenal sebagai
rentang nilai. Eq. (6) cocok untuk semua sampel individu yang dianalisis.
Nilai tengah dan koefisien variasi dari nilai absorptivitas massa yang
dihitung dilaporkan pada Tabel 1 untuk masing-masing karbohidrat serta untuk
karbohidrat netral dan anionik secara kolektif. Koefisien variasi umumnya
rendah yang menunjukkan bahwa hukum Beer-Lambert dipatuhi.
Hasil pada Gambar. 2 dan pada Tabel 1 jelas menunjukkan bahwa ada korelasi
linier yang kuat antara konsentrasi karbohidrat dan absorbansi cahaya, diukur
menggunakan kedua metode. Selain itu, hasil ini menunjukkan bahwa ada
perbedaan yang jelas dalam hubungan konsentrasi-absorbansi antara karbohidrat
netral dan karbohidrat anionik, seperti yang ditunjukkan oleh kemiringan baju
regresi ke karbohidrat netral dan anionik (dilaporkan sebagai baris pada
Gambar. 2). Perbedaan serupa dalam koefisien absorpsi antara karbohidrat
netral dan anionik untuk metode Phenol-Sulfuric Acid juga dicatat sebelumnya
oleh Mecozzi (2005). Pengamatan ini menunjukkan bahwa laju konversi dari
karbohidrat ke turunan furfural, setelah dehidrasi oleh asam sulfat, tidak
sama untuk karbohidrat netral dan anionik. Jadi,
GAMBAR
Gambar. 2. Respon absorbansi terhadap konsentrasi karbohidrat yang berbeda
menggunakan metode (a) Asam Fenol-Sulfat dan (b) Metode Asam Sulfat-UV. Garis-
garis padat menunjukkan kecocokan regresi linier terhadap data dan garis
putus-putus mewakili interval kepercayaan 95% dari garis regresi. Perhatikan
bahwa simbol yang diisi mewakili gula anionik sedangkan simbol yang terbuka
mewakili gula netral. Untuk data statistik, lihat Tabel 1.
TABEL

metode Phenol-Sulfuric Acid asli (DuBois et al., 1956), yang menggunakan

larutan glukosa sebagai standar kalibrasi, mungkin tidak dapat langsung
diterapkan untuk karbohidrat anionik tanpa penyesuaian yang tepat untuk kurva
kalibrasi (Mecozzi, 2005).
Melihat lebih dekat pada Gambar. 2a dan kemiringan garis regresi metode
Phenol-Sulfuric Acid (Tabel 1) mengungkapkan bahwa ada perbedaan yang
signifikan secara statistik, meskipun kecil, di antara beberapa kurva standar
karbohidrat netral. Sebaliknya, tidak ada perbedaan yang signifikan secara
statistik antara kemiringan regresi karbohidrat netral yang diukur menggunakan
metode Sulfuric Acid-UV (Gbr. 2b). Perbedaan-perbedaan ini juga tercermin
dalam nilai koefisien determinasi (R2) dari garis regresi yang cocok untuk
semua karbohidrat netral dan anionik secara terpisah (dilaporkan sebagai garis
pada Gambar. 2). Untuk kedua metode, tidak ada perbedaan dalam lereng regresi
antara pasangan gula anionik. Selain itu, perhatikan bahwa pemisahan antara
garis regresi netral dan anionik lebih kecil dalam metode Sulfuric Acid-UV
yang diusulkan.
Pengamatan di atas konsisten dengan fakta bahwa semua karbohidrat netral
dipecah menjadi molekul gula basa yang sama ketika dihidrolisis. Variabilitas
yang signifikan secara statistik di antara karbohidrat netral, ketika diukur
menggunakan metode Phenol-Sulfuric Acid, mungkin merupakan hasil dari sedikit
inkonsistensi dalam pewarnaan turunan furfural oleh Phenol. Dengan demikian,
konsistensi yang jauh lebih baik dari metode Asam Sulfat-UV yang diusulkan
dapat dijelaskan dengan (a) ketergantungan langsung pada potensi penyerapan UV
dari turunan furfural dan (b) menghindari perlunya proses pengembangan warna
yang terpisah.
Akhirnya, interval kepercayaan 95% dari regresi regresi yang dikelompokkan
menunjukkan bahwa kesalahan maksimum metode Phenol-Sulfuric Acid (dihitung
pada titik tengah rentang absorbansi yang diukur untuk setiap kelompok dan
metode karbohidrat) adalah 6,5% dan 14,4% untuk karbohidrat netral dan
anionik, masing-masing. Tingkat kesalahan yang sesuai dari metode Sulfuric
Acid-UV yang diusulkan masing-masing adalah 2,8% dan 7,5%. Demikianlah yang
diusulkan
Metode memotong kesalahan pengukuran sebanyak setengahnya.

3.4. Pengukuran kandungan karbon total

Dalam banyak aplikasi, kandungan karbon total, daripada konsentrasi

karbohidrat curah, adalah ukuran yang lebih diinginkan.
Untuk tujuan ini, kami menguji apakah absorbansi yang diukur berdasarkan
metode Phenol-Sulfuric Acid dan metode Sulfuric Acid-UV yang diusulkan sangat
berkorelasi dengan kandungan karbon total dari solusi. Konsentrasi karbohidrat
yang dilaporkan pada Gambar. 2 dikonversi menjadi kandungan karbon total
menggunakan dua pendekatan:
(A) diperkirakan dari komposisi karbohidrat dan konsentrasi larutan sesuai
dengan Persamaan. (1) dan (b) pengukuran langsung kandungan karbon dari semua
solusi menggunakan penganalisa TOC. Nilai kandungan karbon total yang dihitung
dan diukur dari semua larutan karbonohidrat, kecuali yang dari actigum dan
xanthan, berada dalam perjanjian yang kuat sebagaimana ditunjukkan oleh
distribusi yang ketat dari titik data di sekitar garis 1: 1 pada Gambar 3a.
Namun, konsentrasi karbon yang diukur dari suspensi actigum dan xanthan secara
signifikan lebih rendah dari nilai yang dihitung. Pengamatan serupa juga
dicatat oleh peneliti lain (Fontes, Queiroz, Longo, & Antunes, 2005) yang
menganalisis kandungan karbon total suspensi. Kemungkinan penyebab perkiraan
kadar karbon yang terlalu rendah ini meliputi (a) karbohidrat yang
ditangguhkan mengendap sebelum diekstraksi oleh auto-sampler dari penganalisa
TOC dan / atau (b) jarum pengambilan sampel terlalu baik untuk mengekstraksi
sampel representatif dari sus-pensiun. . Oleh karena itu, nilai total
kandungan karbon dihitung dari actigum dan xanthan digunakan dalam sisa
diskusi. Pada Gambar. 3b, kandungan karbon (mg / L) dari larutan karbohidrat
dibandingkan dengan konsentrasi total karbohidrat yang sesuai. Koefisien
persamaan regresi linier cocok secara individual untuk semua karbohidrat pada
Gambar. 3b disediakan pada Tabel 2. Koefisien determinasi yang sangat tinggi
(R2 0,998) dari regresi menunjukkan indikasi presisi dengan sampel yang
digunakan dalam sampel ini. studi disiapkan dan analisis dilakukan. Penting
juga untuk dicatat bahwa ada perbedaan kecil tetapi secara statistik
signifikan antara kemiringan persamaan regresi yang diberikan pada Tabel 2.
Dengan demikian, tidak ada aturan universal untuk konversi dari konsentrasi
karbohidrat total ke kadar karbon.
(dan sebaliknya).
Dengan menggabungkan data yang dilaporkan dalam Gambar. 2 dan 3b, kami
memperoleh hubungan antara kandungan karbon total larutan karbonat dan nilai
absorbansi yang diukur menggunakan metode Phenol-Sulfuric Acid dan Sulfuric
Acid-UV (Gbr. 4). Koefisien persamaan regresi linier yang disesuaikan secara
individual dengan semua karbohidrat dilaporkan pada Tabel 3. Perbandingan
TABEL
Tabel 2 Koefisien pengukuran kadar karbon total yang diukur diperoleh untuk
konsentrasi karbohidrat yang berbeda (Gbr. 3B) (sesuai dengan total kadar
karbon dalam mg / L versus konsentrasi karbohidrat).
Nilai yang diikuti oleh huruf yang sama tidak berbeda secara signifikan pada
probability = tingkat probabilitas 0,05 menurut tes Tukey's honestly signi fi
cant difference (HSD).
* Karbon total yang dihitung.

koefisien penentuan karbohidrat individu yang dilaporkan pada Tabel 1 dengan

yang pada Tabel 3 mengungkapkan bahwa tidak ada keuntungan atau kerugian
akurasi pengukuran untuk kedua metode.
Selain itu, garis regresi linier disesuaikan dengan kelompok karbohidrat
netral dan anionik. Kesalahan maksimum metode Phenol-Sulfuric Acid pada
tingkat kepercayaan 95% (dihitung pada titik tengah dari rentang absorbansi
yang diukur untuk masing-masing
kelompok dan metode karbohidrat) adalah 6,1% dan 8,4% masing-masing untuk
karbohidrat netral dan anionik. Level kesalahan yang sesuai dari metode
Sulfuric Acid-UV yang diusulkan masing-masing adalah 2,9% dan 4,2%. Penting
untuk menyoroti fakta bahwa tingkat kesalahan dari metode Sulfuric Acid-UV
yang diusulkan adalah setengahnya
 
 metode Phenol – Sulfuric Acid. Selain itu, perhatikan bahwa kesalahan dalam
kedua metode berkurang secara signifikan ketika digunakan untuk mengukur
kandungan karbon sebagai lawan konsentrasi karbohidrat (Gbr. 2) dari solusi
anionik.

3.5. Validasi metode

Karakteristik analitik dari metode Sulfuric Acid-UV dievaluasi dalam hal LOD,
LOQ, linearitas, akurasi dan presisi. Tes validasi ini dilakukan dengan
menggunakan persamaan kalibrasi gabungan yang disesuaikan dengan absorbansi vs
konsentrasi gula dan absorbansi vs data kandungan karbon dari gula netral dan
anionik secara kolektif. LOD dan LOQ untuk persamaan kalibrasi konsentrasi
gula dihitung menggunakan Persamaan. (2) dan
(3) masing-masing 0,002 dan 0,01 g / L. Dari hasil ini, sangat jelas bahwa
nilai LOD adalah urutan besarnya lebih rendah dari konsentrasi terendah yang
digunakan untuk kalibrasi. LOQ di sisi lain sama dengan konsentrasi terendah
yang digunakan dalam kalibrasi. Karena itu, metode baru dan kalibrasi yang
disediakan
GAMBAR
Gambar 3. Hubungan antara karbon total yang dihitung dan diukur untuk
karbohidrat berbeda yang digunakan (a) dan korelasi antara total kadar karbon
yang diukur dengan konsentrasi karbohidrat (b). Perhatikan bahwa kandungan
karbon yang dihitung digunakan untuk actigum dan xanthan di bagian (b) karena
kandungan karbon yang diukur tidak dapat diandalkan (lihat teks untuk
penjelasan).
GAMBAR
Gambar 4. Respon absorbansi terhadap kadar karbon total untuk konsentrasi
karbohidrat yang berbeda menggunakan metode Phenol-Sulfuric Acid (a) dan
metode Sulfuric Acid-UV (b). Garis-garis padat menunjukkan kecocokan regresi
linier terhadap data dan garis putus-putus mewakili interval kepercayaan 95%
dari garis regresi. Perhatikan bahwa simbol yang diisi mewakili gula anionik
sedangkan simbol yang terbuka mewakili gula netral. Untuk data statistik,
lihat Tabel 3.
TABEL
TABEL
dianggap berlaku untuk pengukuran kuantitatif dalam kisaran konsentrasi yang
digunakan dalam penelitian ini; yaitu konsentrasi gula 0,01-0,7 g / L.
Linearitas persamaan konsentrasi gula dan kalibrasi kadar gula disediakan
masing-masing dalam Tabel 1 dan 3. Nilai R2 yang diamati (R2 0,983 dan R2
0,988, masing-masing) dianggap tinggi untuk tujuan yang dimaksudkan dari
metode ini. Keakuratan dan ketepatan metode baru dilaporkan pada Tabel 4.
Keakuratan metode ini diuji dalam hal persentase kesalahan relatif (ı) dan
pemulihan persen (r), yang dihitung menggunakan Persamaan. (4) dan (5),
masing-masing. Secara umum, metode baru dapat dianggap akurat dalam 3,6%.
Standar deviasi (presisi) dari sampel validasi ulangan dilaporkan pada Tabel
4, yang umumnya menunjukkan pengukuran presisi tinggi yang rendah. Perhatikan
bahwa semakin kecil SD, semakin baik presisi.
Tes untuk gangguan menunjukkan bahwa absorbansi UV dari BSA dan asam sinamat
berkurang tetapi tidak sepenuhnya dihilangkan setelah hidrolisis melalui
reaksi dengan asam sulfat pekat. Oleh karena itu, dapat disimpulkan bahwa
metode yang diusulkan tidak sesuai untuk sampel yang menyerap dalam rentang UV
tanpa pra-perawatan. Sebagai tindakan pencegahan, disarankan bahwa sebelum
menggunakan metode Sulfuric Acid-UV yang diusulkan, sampel harus disaring
terlebih dahulu untuk menguji apakah mereka memiliki absorbansi UV.
Pengurangan absorbansi UV pada hidrolisis menunjukkan bahwa ada kemungkinan
sejumlah kecil pengotor protein / flavonoid dapat diterima, jika absorbansi
UVnya dikurangi di bawah batas deteksi. Tingkat absorbansi UV yang diterima
yang tidak diolah
 
sampel harus ditetapkan dengan analisis sistematis berbagai protein dan
flavonoid dicampur dengan karbohidrat pada berbagai konsentrasi dan proporsi.

4. Kesimpulan

Metode Asam Sulfat-UV yang diusulkan merupakan perbaikan besar untuk

karakterisasi karbohidrat yang banyak digunakan dengan metode Asam Fenol-
Sulfat. Keuntungan dari metode yang diusulkan terkait dengan eliminasi fenol
untuk pewarnaan turunan furfural yang terlihat dan sebagai gantinya
memanfaatkan kapitalisasi UV terhadap potensi furfural. Modifikasi ini tidak
hanya menghindari bahaya kesehatan dan lingkungan dari penggunaan fenol tetapi
juga mengurangi kesalahan pengukuran sebanyak setengahnya sekaligus secara
signifikan mengurangi waktu pengukuran. Oleh karena itu, kita dapat
menyimpulkan bahwa metode Sulfuric Acid-UV yang diusulkan cocok untuk analisis
karbohidrat beragam yang lebih aman dan tinggi dalam penelitian dan aplikasi
industri. Namun, metode Sulfuric Acid-UV tidak dapat digunakan untuk sampel
yang memiliki absorbansi UV sebelum perawatan karena hal ini dapat
mengindikasikan kemungkinan interferensi oleh protein dan / atau keanehan
flavonoid.