4. Setelah proses hidrolisis enzimatis selesai pada penentuan daya cerna protein
secara in vitro, apa langkah selanjutnya? Jelaskan prinsipnya secara singkat!
Metode biuret merupakan salah satu metode analisis kualitatif protein yang
digunakan untuk mengidentifikasi ada atau tidaknya ikatan peptida dalam suatu
sampel. Metode biuret merupakan uji yang paling umum digunakan untuk mendeteksi
ada tidaknya ikatan peptida yang membentuk suatu protein. Adanya ikatan peptida
mengidentifikasikan bahwa sampel tersebut mengandung protein.Prinsip dari uji
biuret ini yaitu ion Cu2+ akan bereaksi dengan ikatan peptida dalam suasana basa.
Ion Cu2+ yang bereaksi dengan ikatan peptida akan membentuk senyawa kompleks
warna ungu yang merupakan indikator hasil uji positif pada uji biuret. Reaksi biuret
hanya akan menunjukkan hasil pisitif pada sampel yang terdiri dari dua ikatan
peptide atau lebih. Reaksi ini positif terhadap dua buah ikatan peptide atau lebih,
tetapi negative untuk asam amino bebas atau ikatan peptida. Intensitas warna ungu
menunjukkan jumlah ikatan peptide yang ada pada protein. Protein melarutkan
hidroksida tembaga untuk membentuk kompleks warna.Reaksi pembentukan warna
ini dapat terjadi pada senyawa yang mengandung dua gugus karbonil yangberikatan
dengan nitrogen atau atom karbon (Arisman, 2013).
TINJAUAN PUSTAKA
- Macam – macam metode penentuan daya cerna protein
Uji Biuret
Uji biuret digunakan untuk menunjukkan adanya ikatan peptida
dalam suatu zat yang diuji. Adanya ikatan peptida mengindikasikan adanya
protein, karena asam amino berikatan dengan asam amino yang lain melalui
ikatan peptida membentuk protein. Uji biuret dilakukan pada komponen
yang memiliki 2 atau lebih ikatan peptida. CuSO4 akan bereaksi dengan
NaOH untuk membentuk Cu(OH)2 yang bereaksi dengan ikatan peptida
membentuk senyawa kompleks berwarna ungu dalam kondisi basa. Reaksi
akan menunjukan hasil positif apabila terdapat ikatan peptida 2 atau lebih.
Reaksi pembentukan warna ini dapat terjadi pada senyawa yang
mengandung 2gugus karbonil yang berikatan dengan nitrogen atau atom
karbon (Ishanda, 2014).
- TCA
Asam trikloroasetat berfungsi sebagai agen untuk presipitasi atau
memisahkan endapan protein dengan asam amino bebas (Beynon dan Bond
2010).
- BSA
Albumin serum sapi adalah protein albumin serum yang berasal dari
sapi. BSA sering digunakan sebagai standar konsentrasi protein dalam
percobaan laboratorium. BSA digunakan untuk menstabilkan beberapa
enzim selama pencernaan DNA dan untuk mencegah adhesi enzim ke
tabung reaksi, ujung pipet, dan pembuluh lainnya. BSA juga biasa
digunakan untuk menentukan jumlah protein lain, dengan membandingkan
jumlah protein yang tidak diketahui dengan jumlah BSA yang diketahui
(Majorek et. al., 2012)
- Enzim Pankreatin
Enzim pankreatin dari pancreas mampu menghidrolisa protein, pati
dan lemak. Enzim pankreatin merupakan campuran enzim lipase, protease,
dan amilase. Oleh karena itu, selain mampu menghidrolisis lemak, enzim ini
juga mampu menghidrolisis protein dan pati (Johnson dan Hillier 2011).
Enzim pankreatin memiliki aktivitas optimum pada rentang pH antara 6.0
hingga 7.0 (Uhlig, 2010).
- Buffer Phospat
Buffer fosfat adalah buffer netral dengan kisaran pH 7. Buffer
fosfat dapat dibuat dengan menggunakan monosodium fosfat (NaH2PO4)
dan basa konjugatnya yaitu disodium fosfat (Na2HPO4). Meskipun buffer
fosfat juga merupakan larutan penyangga, namun kerja buffer ini tidak
lebih baik dari cairan rumen dalam mempertahankan pH. Hal ini
dikarenakan adanya proses saliviasi di dalam rumen. Saliva yang dihasilkan
kelenjar ludah berperan sebagi buffer alami bagi rumen sehingga
kemampuan mempertahankan pH rumen lebih bagus (Daintith, 2010).
- Reagen Biuret
Reagen Biuret , yang dibuat dengan cara menimbang serbuk garam
CuSO4.5H2O dan KNaC4H4O6.4H2O masing-masing sejumlah 150 mg
dengan menggunakan neraca analitik. Kemudian dilarutkan dengan air
demineral sebanyak 50 ml di dalam gelas kimia dan ditambahkan dengan 30
ml NaOH 10% serta diencerkan di dalam labu ukur 100 ml dengan
penambahan air demineral hingga tanda batas. Reaksi biuret bergantung
pada pembentukan suatu kompleks antara ion Cu2+ dan 4 atom N-peptida
pada protein dalam suasana basa (Purnama Robby Candra, Agustina
Retnaningsih 2019)
DIAGRAM ALIR
1. Persiapan sampel
Sampel Kedelai
Ditimbang 3 gr Ditimbang 3 gr
Air rendaman
Hasil
Ditiriskan
Dihaluskan
Hasil
Sampel Kedelai
Ditimbang 3 gr Ditimbang 3
gr
Direbus selama 20 menit dalam 100 ml air Disangrai selama 5 menit, suhu
100˚C
Air rebusan Dihaluska
Ditiriskan n
Hasil
Dihaluskan
Hasil
e. Kecambah Kedelai f. Tempe Kedelai
Kedelai
Tempe Kedelai
Ditimbang 3 gr
Ditimbang 3 gr
Direndam selama 12 jam dalam 50 ml air
Hasil
Dikecambahkan 2 hari
Dihaluskann
n
Kedelai
Rendam
2. Penentuan Daya Cerna Protein Menggunakan Enzim
20 mg sampel
Endapan
Filtrat Sampel
5 ml pereaksi biuret
Divortex
Hasil
4. Pembuatan Kurva Standar
BSA
Divortex
Hasil
Analisa prosedur
Fungsi perlakuan berbeda pada tiap sampel adalah untuk mendapat sampel
Enzim pankreatin adalah enzim dari gabungan beberapa enzim. Enzim pankreatin
yaitu campuran dari amilase, lipase dan protease. Pada praktikum ini dilakukan
4. Apa fungsi inkubasi 1 jam dalam shaker waterbath pada suhu 37°C dan inkubasi
15 menit pada suhu kamar?
Fungsi inkubasi pada suhu 37°C dan inkubasi 15 menit pada suhu kamar supaya
spektrofotometer.
6. Mengapa digunakan BSA (Bovine Serum Albumin) sebagai larutan standar dalam
metode biuret?
BSA adalah larutan standar karena dapat diterima secara universal. BSA
untuk pembuatan kurva standar protein dan acuan penentuan kadar protein.
DATA HASIL PRAKTIKUM
2. Buatlah kurva standar BSA dan persamaan regresi liner standar BSA (perhitungan
0.06
0.05 0.048
0.04
0.03
0.02 0.019
0.01 0.012
0 0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
Konsentrasi (ppm)
Perhitungan:
Kadar protein filtrat (mg/gram)
% Daya cerna protein = x 100%
Kadar protein sampel (mg/gram)
a) Kedelai Mentah
0,00009
% Daya cerna protein = x 100%
0,264
= 0,034 %
b) Kedelai Rendam
0,00082
% Daya cerna protein = x 100%
0,129
= 0,636 %
c) Kedelai Rebus
0,00109
% Daya cerna protein = x 100%
0,250
= 0,436 %
d) Kedelai Sangrai
0,00011
% Daya cerna protein = x 100%
0,298
= 0,037 %
e) Kecambah Kedelai
0,00015
% Daya cerna protein = x 100%
0,108
= 0,139 %
f) Tempe Kedelai
0,00029
% Daya cerna protein = x 100%
0,197
= 0,147 %
g) Susu Cair
0,00183
% Daya cerna protein = x 100%
0,022
= 8,318 %
h) Yogurt
0,00039
% Daya cerna protein = x 100%
0,013
= 3,000 %
Metode dengan in vitro lebih mudah dan simpel dengan cara penggunaan
enzim pencernaan dan membuat kondisi yang mirip dengan kondisi asli didalam
pencernaan manusia. Prinsipnya yaitu dengan membuat kondisi yang mirip dengan
kondisi asli didalam pencernaan manusia Protein lalu akan dihidrolisis oleh enzim
protease sehingga ikatan peptidanya lepas dan melepaskan ion hidrogen yang
dapat menurunkan nilai pH. Sedangkan tujuannya untuk mengenalkan metode
penentuan daya cerna protein secara in vitro, mempraktekkan prosedur
penentuan daya cerna protein secara in vitro,mengetahui pengaruh pengolahan
terhadap daya cerna protein dan mengetahui hubungan daya cerna protein
dengan kadar zat antinutrisi. Berdasarkan data hasil praktikum didapatkan
Persamaan regresi; y= 0,0906x + 0,0045. Pada sampel kedelai mentah
didapatkan kadar protein hidrolisis enzim 0,00009 mg/gram, kadar protein
sampel 0,264 mg/gram dan daya cerna protein 0,034%. Pada sampel kedelai
rendam didapatkan kadar protein hidrolisis enzim 0,00086 mg/gram, kadar
protein sampel 0,129 mg/gram dan daya cerna protein 0,636%. Pada sampel
kedelai rebus didapatkan kadar protein hidrolisis enzimatis 0,110 mg/gram,
kadar protein sampel 0,250 mg/gram dan daya cerna protein 0,436%. Pada
sampel kedelai sangrai didapatkan kadar protein hidrolisis enzimatis 0,00011
mg/gram, kadar protein sampel 0,298 mg/gram dan daya cerna protein 0,037%.
Pada sampel kecambah kedelai didapatkan kadar protein hidrolisis enzim
0,00016 mg/gram, kadar protein sampel 0,108 mg/gram dan daya cerna protein
0,139%. Pada sampel tempe kedelai didapatkan kadar protein hidrolisis
enzimatis 0,00030 mg/gram, kadar protein sampel 0,197 mg/gram dan daya
cerna protein 0,147%. Pada sampel susu cair didapatkan kadar protein hidrolisis
enzimatis 0,00187 mg/gram, kadar protein sampel 0,022 mg/gram dan daya
cerna protein 8,318%. Pada sampel yoghurt didapatkan kadar protein hidrolisis
enzimatis 0,00039 mg/gram, kadar protein sampel 0,013 mg/gram dan daya
cerna protein 3 %.
Daftar Pustaka
Arisman, Dias. 2013. Buku Ajar Pedoman Mahasiswa Ilmu Gizi . Semarang:
Grafindo
Beynon, R., Bond, Antonio. 2010. Digestion of head-damaged egg albumen by the
rat. J. Nutr. 100:873.
Ishanda, Lanang. 2014. Prinsip Kimia Organik Edisi III . Jakarta: Erlangga
Majorek KA, Porebski PJ, Dayal A, Zimmerman MD, Jablonska K, Stewart AJ,
Chruszcz M, Minor W (2012). "Karakterisasi struktural dan imunologis
dari serum albumin sapi, kuda, dan kelinci". Imunologi Molekuler . 52 (3–4):
174– 82
Zaini, Ziana Octa Faridah. 2016. Pengaruh Lama Fermentasi Terhadap Nilai PH,
Total Asam, Jumlah Mikroba, Protein Dan Kadar Alkohol Kefir Susu Kacang
Kedelai (Glycine Max (L) Merill). Skripsi. Malang : Universitas Islam Negri
Maulana Malik Ibrahim.
Daftar Pustaka tambahan
Angleimier,A.E dan Montogmery, M.W. (2010). Amino acids peptides and protein.
Diana, F. M. (2010). Fungsi dan Metabolisme Protein dalam Tubuh Manusia. Jurnal
(Damodaran, 2014)
(Zaini, 2016)
(Purnama Robby Candra, Agustina Retnaningsih 2019)
Lampiran Daftar Pustaka Tambahan