PETUNJUK PRAKTIKUM BIOKIMIA

Oleh:

Tim

JURUSAN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS NEGERI SURABAYA
2018
 KATA PENGANTAR

Buku Petunjuk Praktikum Biokimia ini ditunjukan bagi mahasiswa jenjang S-1 program
studi Kimia dan Pendidikan Kimia di Jurusan Kimia FMIPA Universitas Negeri Surabaya.
Tujuan penulisan buku ini adalah sebagai penunjang dalam rangka meningkatkan pemahaman
materi perkuliahan biokimia. Dalam petunjuk praktikum ini, disamping latihan percobaan
juga diberikan latar belakang yang mendasari setiap percobaan. Petunjuk Praktikum Biokimia
ini berisi percobaan tentang protein, karbohidrat, lipida, vitamin, enzim, dan isolasi DNA.
Ucapan banyak terima kasih kami sampaikan kepada Ketua Jurusan Kimia FMIPA-
UNESA dan Dekan FMIPA-UNESA yang telah memfasilitasi terbitnya buku ini. Semoga
buku petunjuk praktikum ini bermanfaat bagi peningkatan kualitas pembelajaran Biokimia.
Kritik dan saran untuk penyempurnaan buku ini kami nantikan dengan senang hati.

Surabaya, Agustus 2018

Tim Penulis

JURUSAN KIMIA FMIPA-UNESA

2
 DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ................................................................................................................ 1

KATA PENGANTAR .............................................................................................................. 2
DAFTAR ISI ............................................................................................................................ 3
PENENTUAN KADAR PROTEIN DENGAN METODE BIURET ...................................... 4
PENENTUAN KADAR GLUKOSA DARAH DALAM DARAH ......................................... 7
ANALISIS VITAMIN C ........................................................................................................ 10
PENENTUAN JENIS ASAM AMINO DALAM SAMPEL ................................................. 13
PENGARUH pH DAN KONSENTRASI ENZIM TERHADAP AKTIVITAS ENZIM ...... 15
UJI KUANTITATIF LIPID ................................................................................................... 18
ISOLASI DNA EPHITELIAL MULUT ................................................................................ 21
CARA PEMBUATAN REAGEN ........................................................................................... 24
DAFTAR PUSTAKA .............................................................................................................. 25

JURUSAN KIMIA FMIPA-UNESA

3
 PENENTUAN KADAR PROTEIN DENGAN METODE BIURET

Tujuan
Menentukan kadar protein yang ada pada sampel dengan menggunakan cara Biuret.

Teori
Metode Biuret merupakan salah satu cara yang terbaik untuk menentukan kadar protein
dalam suatu larutan. Dalam larutan basa, Cu2+ membentuk kompleks dengan ikatan peptida
suatu protein sehingga menghasilkan warna ungu dengan absorbansi maksimal pada 540 nm.
Absorbansi ini berbanding lurus dengan konsentrasi protein dan tidak tergantung jenis protein
karena seluruh protein pada dasarnya mempunyai jumlah ikatan peptida yang sama per satuan
berat. Hal-hal yang dapat mengganggu reaksi ini adalah adanya urea (mengandung gugus –
CO-NH-) dan gula pereduksi yang bereaksi dengan Cu2+.

Alat dan Bahan

- Tabung reaksi
- Larutan standar protein
- Spektronik-20
- Reagen Biuret

Cara Kerja
Persiapan sampel
- Sampel harus berupa cairan, jika berbentuk padatan maka harus dihancurkan dahulu
dengan “waring blender” dan ditambahkan air. Hancuran yang diperoleh disaring lalu
disentrifuge. Supernatant didekantasi untuk digunakan selanjutnya. Protein yang terukur
pada supernatant adalah “soluble protein”. Faktor pengenceran yang dipergunakan
harus diperhatikan.
- Jika cairan berupa larutan protein seperti protein konsentrat, isolat yang tidak keruh,
maka persiapan sampel cukup dengan pengenceran secukupnya saja.
- Jika cairan keruh atau mengandung bahan-bahan yang mengganggu seperti glukosa,
maka harus dilakukan hal-hal seperti berikut ini:
 Alikuot/ ekstrak didistribusikan kedalam tabung reaksi seperti pada waktu
penetapan standar, kemudian tambahkan air sampai volume total masing-masing
1 mL.

JURUSAN KIMIA FMIPA-UNESA

4
  Kedalam masing-masing tabung reaksi tambahkan 1 mL TCA 10% sehingga
protein akan terdenaturasi.
 Sentrifuge pada 3500 rpm selama 10 menit sampai protein yang terdenaturasi
mengendap. Supernatant dibuang dengan cara didekantasi.
 Kedalam endapan ditambahkan 2 mL etil eter, campurkan secara merata lalu
sentrifuge lagi. Ini akan menolong menghilangkan residu TCA. Biarkan
mengering pada suhu kamar.
 Tambahkan 6 mL pereaksi Biuret, alkali dalam pereaksi ini akan melarutkan
endapan yang tersisa.

Pembuatan standar
 Ambil 5 tabung reaksi kemudian isi dengan 1 mL larutan standar protein dengan kadar
1 mg, 2 mg, 3 mg, 4 mg dan 5 mg per mL protein.
 Tambahkan 5 mL reagen Biuret kedalam masing-masing tabung dan kocoklah.
 Inkubasikan tabung reaksi tersebut pada suhu 37 ˚C selama 10 menit, atau pada suhu
kamar selama 30 menit sampai terbentuk warna ungu yang stabil/ sempurna.
 Ukur absorbansi masing-masing larutan pada tabung reaksi, pada panjang gelombang
540 nm dengan alat spektronik 20.

Penetapan Absorbansi Larutan Blanko

 Ambil 1 tabung reaksi, isi dengan 1 mL akuades
 Tambahkan 5 mL reagen Biuret kedalam tabung tersebut dan kocoklah
 Inkubasi tabung reaksi itu pada suhu 37˚C selama 10 menit, atau pada suhu kamar
selama 30 menit
 Ukur absorbansi larutan pada tabung reaksi tersebut, pada panjang gelombang 540 nm
dengan alat spektronik 20

Penetapan Absorbansi Larutan Sampel

 Ambil 1 tabung reaksi, isi dengan 1 mL sampel
 Tambahkan 5 mL reagen Biuret kedalam tabung tersebut dan kocoklah
 Inkubasi tabung reaksi itu pada suhu 37˚C selama 10 menit, atau pada suhu kamar
selama 30 menit
 Ukur absorbansi larutan pada tabung reaksi tersebut, pada panjang gelombang 540 nm
dengan alat spektronik 20
JURUSAN KIMIA FMIPA-UNESA
5
Tugas
1. Buatlah kurva standar konsentrasi vs absorbansi. Dengan bantuan kurva standar
tersebut tentukan kadar protein sampel!
2. Apakah peptida akan memberikan reaksi positif terhadap pereaksi Biuret? Jika benar
demikian, bagaimana menentukan kadar protein yang tercampur dengan peptida?

JURUSAN KIMIA FMIPA-UNESA

6
 PENENTUAN KADAR GLUKOSA DARAH

Tujuan
Menentukan kadar glukosa dalam darah

Teori
Glukosa darah akan mereduksi ion Cu2+ dalam suasana basa, yang hasil reduksinya
akan bereaksi dengan arseno molibdat menghasilkan warna biru. Larutan ini diukur
absorbansi absorbansinya pada panjang gelombang maksimum yaitu 660 nm. Dengan
menggunakan Lambert-Beer menyatakan:
A = k × c× l
Dimana :
A : absorbansi (serapan cahaya)
k : koefisien ekstinksi molar larutan
l : tebal kuvet
c : konsentrasi sampel
Berdasarkan hukum Lambert-Beer, serapan cahaya berbanding lurus dengan konsentrasi.
Konsentrasi glukosa darah merupakan faktor yang sangat penting untuk kelancaran
kerja tubuh. Kadar normal glukosa dalam darah adalah 70-0 mg/100 mL. Keadaan dimana
kadar glukosa berada dibawah 70-90 mg/ 100 mL disebut hipoglisemia, sedangkan diatas 90
mg/ 100 mL disebut hiperglisemia.

Alat dan Bahan

- Spektronik 20
- Sentrifuge
- Tabung reaksi
- Penangas air
- Larutan Cu alkalis
- Gelas ukur
- Gelas piala
- Larutan Ba(OH)2 0,3 N
- Larutan ZnSO4.7 H2O 5%
- Pereaksi arsenomolibdat

JURUSAN KIMIA FMIPA-UNESA

7
Cara Kerja
Deproteinasi Filtrat Darah
- Ambil 1 mL darah yang “oxalated”, masukkan kedalam tabung sentrifuge yang telah berisi
3 mL akuades, campurkan dengan baik (dengan pengaduk).
- Kedalam tabung tersebut tambahkan 1 mL Ba(OH)2 0,3 N, aduk baik-baik hingga merata
- Tambahkan lagi 2 mL ZnSO4.7H2O 5%, campurkan dengan baik
- Tambahkan 2 mL (NH4)2SO4 0,5 N, diaduk
- Didiamkan selama 15 menit.
- Sentrifuge selama 15 menit pada kecepatan 3500 rpm
- Lakukan dekantasi dan filtratnya merupakan filtrat darah bebas protein (berapa kali
pengenceran dalam cara ini diperhitungkan dalam perhitungan)
- Filtrat diambil sebanyak 1 mL kemudian dilakukan uji Biuret pada filtrat yang dihasilkan

Penentuan Kadar Glukosa Darah

- Pipet 1,0 mL filtrat darah bebas protein, masukkan kedalam tabung reaksi, tambahkan 3
mL pereaksi Cu alkalis
- Masukkan kedalam air mendidih selama 15 menit, kemudian masukkan kedalam air dingin
selama 10 menit
- Tambahkan beberapa tetes pereaksi arsenomolibdat, aduk dengan baik sampai merata
- Baca absorbansinya dengan alat spektronik 20 pada panjang gelombang 660 nm.

Pembuatan Kurva Standar

- Pipet masing-masing 1,0 mL larutan glukosa dengan konsentrasi 0,3 mg/mL; 0,5 mg/mL;
0,7 mg/mL; dan 0,9 mg/mL, masukkan kedalam tabung reaksi, tambahkan 3 mL pereaksi
Cu alkalis
- Masukkan kedalam air mendidih selama 15 menit, kemudian masukkan kedalam air dingin
selama 10 menit
- Tambahkan beberapa tetes pereaksi arsenomolibdat, aduk dengan baik sampai merata
- Baca absorbansinya dengan alat spektronik 20 pada panjang gelombang 660 nm.

Larutan Blanko
- Pipet 1,0 mL akuades, masukkan kedalam tabung reaksi, tambakan 3 mL pereaksi Cu
alkalis
- Masukkan kedalam air mendidih selama 15 menit, kemudian masukkan kedalam air dingin
selama 10 menit
JURUSAN KIMIA FMIPA-UNESA
8
- Tambahkan beberapa tetes pereaksi arsenomolibdat, aduk dengan baik sampai merata
- Baca absorbansinya dengan alat spektronik 20 pada panjang gelombang 660 nm.

Tugas
1. Tentukan kadar glukosa darah dalam mg glukosa/ 100 mL darah!
2. Apa fungsi proses pendidihan pada percobaan diatas?
3. Jelaskan peranan hormon insulin dalam proses pengaturan kadar glukosa!

JURUSAN KIMIA FMIPA-UNESA

9
 ANALISIS VITAMIN C

Tujuan

Menentukan kadar vitamin C didalam sampel

Teori

Vitamin C, salah satu vitamin yang larut dalam air,dapat berbentuk L-asam askorbat
dan asam dehidroskorbat. Keduanya mempunyai keaktivan vitaminC. Vitamin C disintesis
secara alami baik dalam tanaman ataupun hewan. Vitamin C mudah teroksidasi, yang dapat
dipercepat dengan adanya panas, sinar, alkali, enzim oksidator serta katalis tembaga dan besi.

Vitamin C dapat terserap sangat cepat dari alat pencerna, masuk kedalam saluran
darah dan dibagikan keseluruh tubuh. Jeruk sebagai salah satu sumber vitamin C dengan
kandungan yang berbeda pada buah yang mentah dan sudah tua. Semakin tua buah semakin
berkurang kandungan vitamin C-nya.

Kadar vitamin C ditentukan dengan Cara Iodometri, dimana vitamin C mereduksi I2

menjadi I-. titik akhir titrasi ditentukan dari warna biru amilum. Kadar vitamin C dapat
dihitung sebagai berikut:

 Kadar (mg)

 Kadar (%)

JURUSAN KIMIA FMIPA-UNESA

10
 Alat dan Bahan

- Mortar
- Labu ukur 25 mL mikro Buret
- Erlemeyer
- Buret
- Larutan I2 0,01 N
- Larutan amilum 1%
- Buah-buahan

Cara Kerja
 Titrasi pada Larutan Blanko
- Ambil 20 mL aquades dengan pipet dan masukkan kedalam Erlemeyer. Tambahkan
amilum 1% sebanyak 3 tetes.
- Kemudian titrasi dengan larutan standar iodium 0,01 N
 Titrasi pada Larutan Sampel
Cara 1:
- Kupaslah buah dan timbanglah sebanyak 10 gram
- Hancurkan buah dengan mortar sampai diperoleh slurry. Masukkan kedalam labu ukur
100 mL dan tambahkan aquades sampai tanda batas (jangan lupa membilas mortar)
- Tunggulah selama 15 menit sambil kadang-kadang dikocok.
- Ambil 10 mL filtrate dengan pipet dan masukkan kedalam Erlemeyer. Tambahkan
amilum 1% sebanyak 3 tetes. Tambahkan 20 mL aquades.
- Kemudian titrasi dengan larutan standar iodium 0,01 N
Keterangan; 1 mL larurutan iodium 0,01N = 0,88 mg asam askorbat

Cara 2:
- Peras jeruk nipis, timbang sekitar 10 gram dan masukkan kedalam labu takar 100 mL
- Tambahkan aquades sampai tanda batas
- Tunggulah selama 15 menit sambil kadang-kadang dikocok dan saringlah
- Ambil 10 mL filtrate dengan pipet ukur, masukkan kedalam Erlemeyer. Tambahkan 3
tetes larutan amilum 1% dan 20 mL aquades
- Titrasi dengan larutan iodium 0,01 N
Keterangan: 1 mL larutan iodium 0,01 N = 0,88 mg asam askorbat

JURUSAN KIMIA FMIPA-UNESA

11
Tugas
1. Hitung kadar vitamin C yang terkandung dalam sampel !
2. Gambarkan struktur vitamin C !
3. Sebutkan penyakit atau gejala yang tampak, yang disebabkan oleh defisiensi vitamin C !
4. Sebutkan bahan makanan yang mengandung vitamin C !
5. Sebutkan peranan penting vitamin C di dalam tubuh !

JURUSAN KIMIA FMIPA-UNESA

12
 PENENTUAN JENIS ASAM AMINO DALAM SAMPEL

Tujuan

Menentukan asam amino yang terdapat dalam sampel dengan kromatografi kertas

Teori

Komponen asam amino dalam sampel dapat ditentukan dengan cara yang sederhana,
yaitu kromatografi kertas.pada kromatografi kertas, dibandingkan antara perpindahan zat yang
diselidiki dengan zat-zat standar yang diketahui. Dengan demikian zat yang diselidiki dapat
ditentukan. Oleh karena asam amino merupakan larutan yang tidak berwarna, maka
digunakan ninhidrin sebagai penampak noda.

Jika yang diselidiki adalah sampel yang mengandung protein yang merupakan polimer
asam amino, maka untuk menentukan komponennya dilakukan hidrolisis terlebih dahulu, baik
oleh asam, basa maupun enzim.

Alat dan Bahan

- Kertas kromatografi
- Labu pemisah
- Kaca kapiler
- Bejana/gelas kimia
- botol semprot
- oven
- asam asetat glacial
- n-butanol
- aquades
- larutan asam amino standar
- HCl pekat
- Larutan sampel

JURUSAN KIMIA FMIPA-UNESA

13
 Cara Kerja

Pembuatan larutan pengelusi (fasa gerak)

- Campurkan sambil dikocok 25 mL n-butanol, 6 mL asam asetat glacial dan 25 mL

aquades
- Tempatkan larutan tersebut dalam lemari kromatografi dan jenuhkan dengan
uapnya.
Menentukan komponen asam amino
- Siapkan kertas kromatografi dengan ukuran 4 x 10. Dengan pipet mikro atau
dengan suatu kapiler teteskan 4 macam larutan (A, B, C dan D) berdampingan
dengan jarak 1 cm. larutan ujung ada pada 0,5 cm dari pinggir kertas. Tiap-tiap
tetesan harus dikeringkan dahulu misalnya dengan alat pengering rambut atau
diangin-anginkan, sebelum tetesan berikut diletakkan diatasnya. Harus diusahakan
supaya cukup asam amino (sekitar 5 μg) diletakkan di kertas tersebut, sedangkan
besar noda hendaknya jangan melebihi diameter 0,4 cm. hendaknya kertas dijaga
bersih dan sedapat-dapatnya jangan disentuh jari, jadi gunakan pinset.
- Gantungkan kertas tersebut diatas dalam lemari kromatografi untuk beberapa jam
guna dijenuhkan dengan uap eluen. Setelah penjenuhan tercapai, maka barulah
dimulai dengan elusi. Disini dapat dipakai cara kromatografi menurun atau
kromatografi mendaki.
- Setelah larutan elusi berjalan cukup jauh, maka kertas kromatografi dikeluarkan.
Lalu batas larutan ditandai dengan pensil dan kertas kromatografi dikeringkan
pada 105-110 oC selama 5 menit. Kemudian disemprot dengan ninhidrin dan
kertas kromatografi dikeringkan kembali selama 1 menit. Noda-noda asam amino
yang berwarna akan terlihat.
- Hitung harga Rf tiap-tiap noda dan catat warnanya. Kemudian tetapkan
komponen-komponen asam amino dalam rarutan sampel dengan membandingkan
harga Rf-nya dengan Rf asam-asam amino standar.

Tugas

1. Apakah keuntungan dan kerugian dalam metode pemisahan dengan kromatografi

kertas ?
2. Apakah mitode kromatografi kertas dapat digunakan untuk analisis kuantitatif ?
3. Faktor apa saja yang mempengaruhi nilai Rf ?

JURUSAN KIMIA FMIPA-UNESA

14
PENGARUH pH DAN KONSENTRASI ENZIM TERHADAP AKTIVITAS ENZIM

Tujuan

Membuktikan bahwa pH dan konsentrasi enzim mempengaruhi aktivitas enzim

Teori

Kecepatan reaksi enzim dipengaruhi oleh beberapa hal diantaranya adalah suhu, pH,
konsentrasi enzim dan konsentrasi substrat. Pada konsentrasi substrat tertentu, penambahan
enzim dengan konsentrasi bertingkat akan meningkatkan jumlah kompleks ES sehingga
jumblah produk yang terbentuk juga meningkat.

Enzim bekerja pada kisaran pH tertentu dan menunjukkan kerja maksimum pada pH
optimum. Diluar pH optimum aktivitas enzim akan terganggu.

Alat dan Bahan

- Air liur sebagai sumber amylase

- Larutan pati 0,4 mg/mL
- Larutan pati 0,4 mg/mL dilarutkan dalam berbagai pH (1, 3, 5, 7, 9, dan 11)
- Larutan iodium
- Penangas air
- Peralatan gelas

Cara Kerja

Pengaruh pH Terhadap Aktivitas Enzim

- Sebanyak 10 mL air liur diencerkan 10 kali dengan aquades

- Siapkan 5 pasang tabung reaksi yang bersih, tiap pasang tabung diberi tanda B
untuk blanko dan U untuk uji.
- Pipetkan kedalam tiap-tiap tabung seperti pada tabel berikut:

JURUSAN KIMIA FMIPA-UNESA

15
 LARUTAN TABUNG B TABUNG U

Larutan pati dalam berbagai pH 1 mL 1 mL

Biarkan masing-masing tabung dari tiap pH minimal 2 menit

Larutan enzim Pengenceran 10 kali - 0,5 mL

Aquades 0,5 mL -

Campurkan dengan baik dan biarkan selama 5 menit pada 37 oC

Larutan iodium 2 tetes 2 tetes

Aquades 6 mL 6 mL

- Segera baca absorbansinya (A) pada panjang gelombang 680 nm. Hitung selisih
absorbansinya (ΔA) antara tabung B (A pada t = 0 menit) dengan tabung U dari
tiap pH.

Pengaruh Konsentrasi Enzim terhadap aktivitas Enzim

- Sebanyak 10 mL air liur diencerkan 10, 20, 30, 40 dan 50 kali dengan aquades.
- Siapkan 5 tabung reaksi yang bersih dan kering. Tiapa pasang tabung berikan
tanda B untuk blanko dan U untuk uji.
- Pada masing-masing tabung masukkan larutan seperti dalam tabel berikut:

LARUTAN TABUNG B TABUNG U

Larutan pati dengan pH optimum 1 mL 1 mL

Biarkan masing-masing tabung dari tiap konsentrasi minimal 2 menit

Larutan enzim Pengenceran 10 – 50 kali - 0,5 mL

Aquades 0,5 mL -

Campurkan dengan baik dan biarkan selama 15 menit pada 70 oC

Larutan iodium (untuk suhu 60 oC dan 2 tetes 2 tetes

100 oC dilakukan diluar penangas)

JURUSAN KIMIA FMIPA-UNESA

16
 Aquades 6 mL 6 mL

- Segera baca absorbansinya (A) pada panjang gelombang 680 nm. Hitung selisih
absorbansinya (ΔA) antara tabung B (A pada t = 0 menit) dengan tabung U dari
tiap suhu.

Tugas

1. Buatlah kurva yang menggambarkan hubungan antara kecepatan reaksi enzimatik

(V=ΔA/ menit) dengan pH !
2. Buatlah kurva antara konsentrasi/ pengenceran enzim dengan kecepatan enzimatik
(ΔA/ menit) !

JURUSAN KIMIA FMIPA-UNESA

17
 UJI KUANTITATIF LIPIDA

Tujuan

Menentukan angka peroksida dan asam lemak bebas

Kajian Teori

Penentuan bilangan peroksida didasarkan pada pengukuran sejumlah iod yang

dibebaskan dari kalium yodida melalui reaksi oksida oleh peroksida pada suhu ruang di dalam
medium asam asetat/kloroform. Asam lemak bebas ditentukan sebagai kandungan asam
lemak yang terdapat paling banyak dalam minyak tertentu. Untuk sumber minyak adalah
kelapa sawit (asam lemak terbanyak adalah palmitat), minyak kelapa (asam laurat), minyak
jagung/kedelai (asam linoleat), susu (asam oleat).

Alat dan Bahan

 Gelas kimia
 Pipet ukur
 Buret
 Erlenmeyer
 Minyak/lemak
 Larutan asam asetat-kloroform (3:2)
 Larutan jenuh KI jenuh
 Na2S2O3 0,1 N
 Larutan pati 1%
 Larutan NaOH 0,1 N
 Larutan baku oksalat 0,1 N
 Indikator PP 1%
 Etanol 96%

Cara Kerja

1. Penentuan Angka Peroksida

 Blanko
a. Masukkan sebanyak 5 mL aquades dalam erlenmeyer dan tambahkan 30 mL
larutan asam asetat-kloroform (3:2)
b. Goyangkan sampai bahan terlarut sempurna dan tambahkan 0,5 mL larutan KI
jenuh
c. Diamkan selama 20 menit dengan sesekali digoyang kemudian tambahkan 30
mL aquades

JURUSAN KIMIA FMIPA-UNESA

18
 d. Titrasi dengan larutan Na2S2O3 sampai warna kuning hampir hilang (kuning
muda). Tambahkan 0,5 mL larutan pati 1%. Titrasi kembali dengan Na2S2O3
0,1 N sampai jernih
e. Melalui cara yang sama buatlah penetapan untuk blanko dan catat volume yang
terpakai
f. Angka peroksida dinyatakan dalam miliekivalen peroksida dalam 1000 mg
sampel

 Sampel
a. Masukkan sebanyak 5 mL sampel (minyak/lemak) dalam erlenmeyer dan
tambahkan 30 mL larutan asam asetat-kloroform (3:2)
b. Goyangkan sampai bahan terlarut sempurna dan tambahkan 0,5 mL larutan KI
jenuh
c. Diamkan selama 20 menit dengan sesekali digoyang kemudian tambahkan 30
mL aquades
d. Titrasi dengan larutan Na2S2O3 sampai warna kuning hampir hilang (kuning
muda). Tambahkan 0,5 mL larutan pati 1%. Titrasi kembali dengan Na2S2O3
0,1 N sampai jernih
e. Melalui cara yang sama buatlah penetapan untuk blanko dan catat volume yang
terpakai
f. Angka peroksida dinyatakan dalam miliekivalen peroksida dalam 1000 mg
sampel

2. Penentuan Asam Lemak Bebas (FFA)

 Blanko
a. Masukkan sebanyak 6 mL aqaudes dalam erlenmeyer. Tambahkan 10 mL
alkohol 96% dan 5 tetes indikator phenolphthalein (PP)
b. Titrasi dengan larutan 0,1 N NaOH yang telah distandarisasi sampai warna
merah jambu tercapai dan tidak hilang selama 30 detik
c. Persen asam lemak bebas dinyatakan sebagai asam laurat untuk minyak kelapa,
asam palmitat untuk minyak kelapa sawit
d. Asam lemak bebas dinyatakan sebagai %FFA atau sebagai angka asam

 Sampel
a. Bahan diaduk merata dan berada dalam keadaan cair pada waktu diambil
sampelnya. Masukkan sebanyak 6 mL sampel dalam erlenmeyer. Tambahkan
10 mL alkohol 96% dan 5 tetes indikator phenolphthalein (PP)
b. Titrasi dengan larutan 0,1 N NaOH yang telah distandarisasi sampai warna
merah jambu tercapai dan tidak hilang selama 30 detik

JURUSAN KIMIA FMIPA-UNESA

19
 c. Persen asam lemak bebas dinyatakan sebagai asam laurat untuk minyak kelapa,
asam palmitat untuk minyak kelapa sawit
d. Asam lemak bebas dinyatakan sebagai %FFA atau sebagai angka asam

TUGAS
1. Tuliskan semua reaksi yang menyertai uji asam lemak pada percobaan ini!
2. Sebutkan yang termasuk asam lemak essensial bagi tubuh. Mengapa asam arakidot
bukan merupakan asam lemak essensial?
3. Apa perbedaan asam lemak jenuh dan tak jenuh pada proses oksidasi?
4. Apa perbedaan antara minyak dan lemak ditinjau dari struktur molekulnya?

JURUSAN KIMIA FMIPA-UNESA

20
 ISOLASI DNA EPHITELIAL MULUT

Tujuan
Mampu mengerjakan isolasi DNA sesuai prosedur, dengan sampel DNA diambil dari sel
epithelial mulut

Teori
DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk
mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan. DNA terdapat di nukleus,
mitokondria, dan kloroplas. DNA memiliki struktur helix utas ganda, yang mengandung
komponen-komponen gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat, dan pasangan basa. Satu sel
memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan akan diturunkan pada keturunannya.
DNA dapat diisolasi, baik pada manusia maupun tumbuhan. Isolasi DNA merupakan
langkah tepat untuk mempelajari DNA. Prinsipnya ada dua, yaitu :
a. Sentrifugasi
Merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya.
Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan
molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung. Teknik sentrifugasi dilakukan oleh
mesin yaitu mesin sentrifugasi dengan kecepatan yang bervariasi. Hasil sentrifugasi akan
menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan di bagian atas dan pelet di
bagian bawah.
b. Presipitasi
Merupakan langkah yang dilakukan untuk mengendapkan suatu komponen dari
campuran.
Langkah-langkah isolasi DNA:
a. Pengumpulan sel-sel
b. Pemecahan sel (lisis sel) dan pencernaan protein
c. Pengendapan DNA

Alat dan Bahan

- Batang kayu
- Timbangan digital
- Tabung mikrosentrifus
- Beaker glass
- Waterbath Tris

JURUSAN KIMIA FMIPA-UNESA

21
 - pH meter
- Kertas absorben Akuades
- Tabung reaksi
- Vortex
- Mikrosentrifus
- Pipet Mohr
- Minuman isotonik
- Proteinase K (100 μg/ml)
- Buffer Tris-EDTA
- NaCl 2,5 M
- Etanol dingin

Cara Kerja
Pengumpulan sel-sel
- Ambil larutan sampel isotonik ±10 mL dan digunakan untuk berkumur selama 1
menit. Hasil berkumur ini jangan ditelan, tetapi ditampung di dalam beaker, yang
selanjutnya larutan tersebut akan digunakan sebagai sel epitel untuk diisolasi DNA
nya. Lakukan pengulangan dengan menggunakan larutan sampel air mineral dan
aquades.
Pemecahan sel (lisis sel) dan pencernaan protein
- Ambil 1,5 ml larutan sel epitelial menggunakan pipet mikro, masukkan ke dalam
tabung mikrosentrifus.
- Selanjutnya larutan disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 1 menit.
- Supernatant dibuang, kemudian endapan (pelet) ditambahkan larutan sel lagi sesuai
dengan prosedur sebelumnya hingga 2 kali pengulangan.
- Endapan (pelet) ditambahkan 1 mL buffer Tris-EDTA ke dalam tabung
mikrosentrifus.
- Tabung mikrosentrifus di vortex selama 1 menit 1500 (sampai endapan hancur).
- Diambahkan 50μL Proteinase K (enzim untuk mencerna protein)
- Dimasukkan dalam waterbath (56 ºC) selama 10 menit.
Pengendapan DNA
- Masukkan 100μL NaCl, 2,5M ke dalam tabung mikrosentrifus yang terdapat larutan
sampel (aduk isi tabung agar tercampur baik, dengan cara membolak-balikkan
tabungnya).

JURUSAN KIMIA FMIPA-UNESA

22
 - Pindahkan semua isi tabung mikrosentrifus ke tabung lain yang bersih dan kering
(hati-hati, agar tidak banyak muncul busa).
- Pelan-pelan tambahkan 1 mL etanol dingin (untuk mengendapkan atau
menggumpalkan DNA)
- Biarkan selama 5 menit untuk mengahsilkan batas yang jelas.
- DNA akan menggumpal di antara batas buffer dan etanol (terlihat ada yang melayang
seperti benang putih)
- Ambil DNA menggunakan batang kaca atau besi dan taruh di tabung sentrifugasi
kecil yang bersih. (Gunakan tisu bersih untuk menghisap sisa etanol).
- Simpan tabung mikrosentrifus kecil di lemari pendingin, pada suhu di bawah 0ºC.

Tugas
1. Gambarkan struktur DNA!
2. Bagaimanakan cara menentukan jumlah DNA hasil isolasi tersebut menggunakan
spektrofotometer!

JURUSAN KIMIA FMIPA-UNESA

23
Cara Pembuatan Reagen

Pembuatan Pereaksi Biuret

Larutkan 1,5 mg CuSO4. 5H2O dan 6 gram natrium kalium tartrat dengan sedikit air
kemudian tambahkan 300 mL NaOH 10% kocok dan larutan diencerkan sampai 1 L.

Pembuatan Larutan Standar Protein

Larutan serum albumin murni/ kasein yang dibuat kadar 10 mg/mL. agar mudah alrut
ditambahkan beberapatetes larutan NaOH 3%

Pembuatana Pereakasi Arsenomolibdat

Larutkan 500 mg Kristal ammonium molibdat dalam 90 mL aquades lalu tambahkan

4,2 ,L H2SO4 pekat (Larutan A). Sebanyak 0,6 kristal Na2HAsO4. 7H2O dilarutkan kedalam
50 mL air, Selanjutnya Larutan Ini dicampur dengan larutan A. larutan yang dihasilkan
berwarna kuning bening dan disimpan dalam botol coklat serta dipanaskan pada suhu 37 oC
selama 1-2 hari. Setelah itu larutan disimpan pada lemari es.

Pembuatan Larutan Nelson A

Sebanyak 1,5 gram garam Rochelle, 3 gram Na2CO anhidrat, 2 gram NaHCO3 dan 18
gram Na2SO4 anhidrat dilarutkan dengan aquades sampai volumenya 100 mL.

Pembuatan Larutan Nelson B

Sebanyak 2 gram CuSO4. 5H2O dilarutkan dengan sedikit air dan ditambahkan 18
gram Na2SO4 , diaduk sampai semuanya larut. Tambahkan 2 tetes H2SO4 pekat, lalu encerkan
hingga volumenya 100 mL.

Pembuatan Larutan Cu Alkalis

Campurkan 4 volume Nelson A dengan 1 volume Nelson B.

JURUSAN KIMIA FMIPA-UNESA

24
 DAFTAR PUSTAKA

Agustini, Rudiana dkk.. 1993. Petunjuk Praktikum Biokimia. Surabaya: Unipress IKIP.
Hafiz Soewoto, dkk.. 2000. Penuntun Praktikum Biokimia. Widya Med.
Harrow, B., et. al.. 1960. Laboratory Manual of Biochemistry, 5th ed., New York: W. B.
Saunders Comp.
Iskandar, Yul. 1974. Biokimia Bagian I. Edisi 8. Jakarta: Yayasan Dharmagraha.
Koswara, Sutrisno. 1991. Penentuan Praktikum Dasar-Dasar Biokimia Pangan. Bogor: PAU
Pangan dan Gizi IPB.
Lehninger, Albert L.. 1990. Dasar-Dasar Biokimia Jilid I. Terjemahan. Jakarta: Erlangga
Maryami, Tri, dkk.. 1994. Buku Petunjuk Praktikum Biokimia. Malang: Kimia FMIPA IKIP.
Setiadi, Rachmat. 1991. Petunjuk Percobaan Biokimia. Bandung: Kimia FMIPA IKIP
Sindumarta, M., dkk.. 1999. Petunjuk Praktikum Biokimia Dasar. Bandung: Kimia FMIPA
ITB.
Soedigdo, P.. 1980. Penuntun Praktikum Biokimia Dasar. Bandung: Kimia FMIPA ITB.
Staf Pengajar Biokimia. 1997. Penuntun Praktikum Biokimia. Malang: FMIPA Universitas
Brawijaya
Sudarmaji, Slamet, dkk.. 1989. Analisis Bahan Makanan dan Pertanian. Yogyakarta: Liberty.
Warsito. 1985. Petunjuk Praktikum Biokimia. Surabaya: Depdikbud IKIP.

Bagian Biokimia FMIPA ITS. 2008. Praktikum Biokimia. Surabaya: Jurusan Kimia, FMIPA,
ITS.

Bagian Biokimia Fakultas Teknik UBAYA. 2008. Petunjuk Praktikum Biokimia. Surabaya:
UBAYA.

Dawiesah I, S. 1989. Penentuan Nutrient Dalam Jaringan dan Plasma Tubuh. Yokyakarta :
Proyek Peengembangan Pusat Fasilitas Bersama Antar Universitas (Bank Dunia XVII)-
PAU Pangan dan Gizi.

Harrow, B., et, al., 1960. Laboratory Manual of Biochemistri, 5th ed., New York : W. B.
Saunders Comp.

James , Ceirwyn S. 1995. Analytical Chemistry of Foods. London : The Alden Press.

Koswara, Sutrisno. 1991. Penuntun Praktikum Dasar-Dasar Biokimia Pangan. Bogor. IPB
press.

JURUSAN KIMIA FMIPA-UNESA

25
Muchtadi, D. 1989. Evaluasi Nilai Gizi Pangan. IPB: Departemen Pendidikan dan
Kebudayaan Dirjendikti PAU Pangan dan Gizi.

Staf Biokimia. 2008. Petunjuk Praktikum Biokimia. Surabaya: Jurusan Kimia, FMIPA,
Universitas Airlangga.

Soewoto, Hafiz dkk., 2001. Biokimia: Eksperimen Laboratorium. Jakarta : Widya Medika.

Sudarmadji, Slamet, dkk.. 1989. Analisis Bahan Makanan dan Pertanian. Yokyakarta :
Liberty.

Tranggono dan Bambang Seetiaji 1989. Biokimia Pangan. Yokyakarta : UGM Press.

Yazid, Estien dan Nursanti L. 2006. Penuntun Praktikum Biokimia untuk Mahasiswa Analis.
Yokyakarta : ANDI

Yuanita L dan Agustuni R. 1997. Petunjuk Praktikum Biokimia. Surabaya: Universitas Press
IKIP Surabaya.

JURUSAN KIMIA FMIPA-UNESA

26