Journal Reading

Pengaruh Simvastatin terhadap MMP dan TIMP dalam

Sel Endotel Otak Manusia dan Percobaan Stroke
Björn Reuter & Claus Rodemer & Saskia Grudzenski & Stephen Meairs
Peter Bugert & Michael G. Hennerici & Marc Fatar

Pembimbing :
dr. Nino Widjayanto, Sp.S

Disusun Oleh :
Indra Fransis Liong

KEPANITERAAN DEPARTEMEN ILMU PENYAKIT SARAF

RUMAH SAKIT UMUM DAERAH KOJA
JAKARTA UTARA, 2019
PERIODE 17 JUNI – 25 JULI 2019
Pengaruh Simvastatin terhadap MMP dan TIMP dalam Sel Endotel
Otak Manusia dan Percobaan Stroke
Björn Reuter & Claus Rodemer & Saskia Grudzenski & Stephen Meairs & Peter Bugert &
Michael G. Hennerici & Marc Fatar

Diterima: 4 September 2014 / Direvisi: 15 Oktober 2014 / Diterima: 26 November 2014 /

Diterbitkan online: 5 Desember 2014 # Springer Science + Business Media New York 2014

Abstrak Penelitian klinis menunjukkan efek statin yang menguntungkan pada stroke selain
efek penurun lipid. Pada serangan stroke akut, gangguan sawar darah-otak (BBB)yang dimediasi
oleh matrix metalloproteinases (MMP). Metabolisme MMP yang dimodifikasi dapat
menjelaskan efek yang menguntungkan dari statin.Sel-sel endotel mikrovaskuler otak manusia
(BMEC) dikultur sebelum diberikan simvastatin dan dikenai oxygen glucose depriviation
(OGD). Ekspresi gen dan sekresi protein MMP-2 dan MMP-9 dan penghambat jaringan
metalloproteinase (TIMP) -1 dan TIMP-2 diukur dengan reaksi rantai polimerase (PCR)
kuantitatif secara real-time dan enzim-linked immunosorbent assay (ELISA). Simvastatin secara
signifikan mengurangi ekspresi tetapi tidak mengeluarkan MMP-2 di bawah OGD.Tingkat
sintesis MMP-9 rendah dan tidak terpengaruh oleh pengobatan simvastatin, sedangkan ekspresi
gen dan sekresi protein TIMP-1 dan TIMP-2 keduanya sangat diinduksi. Hasil kami memberikan
bukti bahwa terdapat efek positif simvastatin terhadap metabolisme MMP pada BMEC manusia
dan percobaan stroke terutama melalui peningkatan ekspresi dan sekresi TIMP-1 dan TIMP-2.

Pengantar
Baik stroke iskemik dan hemoragik berhubungan dengan perubahan ekspresi, sekresi, dan
aktivasi matrix metalloproteinases (MMP), sehingga berkontribusi terhadap gangguan sawar
darah otak (BBB) yang kemudian menghasilkan edema vaskular dan ekstravasasi darah [1].
Khususnya, MMP-2 dan MMP-9 terlibat dalam proses ini. Inhibitor jaringan metalloproteinase
(TIMP) sebagai inhibitor MMP endogen mungkin memiliki peran protektif terhadap integritas
BBB pada stroke [2].
Penelitian klinis dan meta-analisis mengungkapkan bahwa statin mungkin mendukung
hasil fungsional yang menguntungkan setelah serangan stroke [3, 4]. Karena efek positif statin
pada metabolisme MMP dalam sistem vaskuler manusia diperlihatkan baik secara in vitro dan in
vivo, kami berhipotesis bahwa mereka juga mungkin dapat memperbaiki metabolisme MMP
selama perjalanan stroke akut [5, 6]. Untuk menjawab pertanyaan ini, kami menyelidiki profil
MMP-2, MMP-9, TIMP-1, dan TIMP-2 sel endotel mikrovaskular otak (BMEC) otak manusia
dalam model in vitro iskemia serebral.

Metode
Kultur dan Perawatan Sel

Eksperimen kultur sel dilakukan dengan menggunakan galur BMEC manusia yang immortal
hCMEC / D3 [7]. Sel dikultur dalam media suplementasi EBM-2 (Lonza, Basel, Swiss) dan
disemai dalam enam lubang dengan 21% O2, 5% CO2, 74% N2, dan suhu 37 ° C dalam
inkubator reguler seperti yang dijelaskan sebelumnya [8 ] Dua puluh empat jam sebelum oxygen
glucose deprivation (OGD), media EBM-2 diberi simvastatin pada konsentrasi 5 μmol / l
kecuali untuk kontrol (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Monolayers sel konfluen menjadi
sasaran OGD seperti yang dijelaskan sebelumnya [8]. Secara singkat, sel-sel dicuci tiga kali
dengan 1 × fosfat buffered saline (PBS) (pH 7,4), kemudian diubah menjadi media Opti-MEM
bebas deoksigenasi dan glukosa (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ditambah tanpa simvastatin,
dan disimpan dalam ruang modular tertutup dengan atmosfer oksigen bebas pada suhu 37 ° C
(Billups-Rothenberg, Inc., CA, USA).
Sebelum OGD, kemungkinan efek sitotoksik dari 5 μmol / l simvastatin ditentukan
menggunakan Kit Deteksi Kematian Sel ELISA Plus (Roche, Basel, Swiss).Sel-sel disemai
dalam 96-lubang (sekitar 20.000 sel per well) dan disimpan dalam inkubator reguler selama 24
jam. Setelah 20 jam OGD, sel dilisiskan dan diproses sesuai dengan protokol pabrikan.
Sitotoksisitas terkait simvastatin ditentukan dalam kondisi kontrol dan OGD dan dibandingkan
dengan sel yang tidak diobati.Semua percobaan dilakukan dalam rangkap tiga.
Uji Imunosorben Terkait-Enzim
Untuk kuantifikasi MMP dan TIMP, supernatan kultur sel segera dikumpulkan setelah percobaan
OGD dan dipisahkan dengan sentrifugasi pada 10.000 rpm selama 5 menit. Sampel disimpan
pada suhu -80 ° C untuk diproses lebih lanjut.Tingkat konsentrasi MMP-2, MMP-9, TIMP-1, dan
TIMP-2 dikuantifikasi dalam pelat mikrotiter 96-baik menggunakan kit uji ELISA yang
terhubung dengan enzim yang tersedia secara komersial (Sistem R&D, MN, AS; Dynatech
Microplate Reader MR5000 diperoleh dari Dynex Technologies, DE, USA).Kit ELISA tidak
mengukur kompleks MMP / TIMP.Setiap sampel diukur dalam rangkap dua.

Reaksi Rantai Polimerase Real-Time Kuantitatif

Setelah itu, sel-sel OGD segera dicuci tiga kali dengan 1 × PBS (pH 7,4). Sel-sel dikacaukan dan
dihomogenisasi menggunakan buffer lisis sel (buffer RLT; Qiagen, Hilden, Jerman) dan
disimpan pada suhu -80 ° C untuk diproses lebih lanjut.Isolasi messenger RNA (mRNA), yang
diamplifikasi ke DNA komplementer (cDNA), dan reaksi rantai polimerase real time kuantitatif
(QRT-PCR) dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya [8].Kuantifikasi mRNA dihitung
dengan standarisasi internal dengan β-aktin dan GAPDH.Setiap sampel diukur dalam rangkap
dua.

Analisis statistik
Hasil disajikan sebagai nilai rata-rata ± standar deviasi (SD).Sitotoksisitas dianalisis dengan
ANOVA diikuti dengan uji t Dunnett. MMP dan TIMPmRNA dan kadar serum dibandingkan
dengan uji t sampel independen. Nilai p ≤0.05 dianggap signifikan. Data dianalisis menggunakan
SPSS v.19 (SPSS Inc. ”, Chicago, IL, USA).
Gbr. 1 a Analisis ekspresi gen MMP-2, TIMP-1, dan TIMP-2 setelah 12 jam OGD. Simvastatin
menekan MMP-2 (p = 0,004) dan menginduksi TIMP-1 dan TIMP-2 (p <0,001 dan p = 0,011).
bkadar supernatan kultur sel MMP-2, TIMP-1, dan TIMP-2 setelah 24 jam OGD. Tingkat
MMP-2 tidak terpengaruh oleh simvastatin (p = 0,14), sementara tingkat TIMP-1 dan TIMP-2
meningkat dibandingkan dengan sel yang tidak diobati (keduanya p <0,001). Data disajikan
sebagai nilairata-rata dan SD

Hasil

Sitotoksisitas dalam kondisi OGD dan pemberian Simvastatin

Tingkat nukleosom tidak terpengaruh oleh pengobatan dengan simvastatin saja dan hasil dari 20
jam OGD dengan dan tanpa simvastatin, menunjukkan tidak ada efek sitotoksik simvastatin baik
dalam kondisi normoksik / normoglikemik dan OGD (p = 0,61, data tidak ditampilkan).
mRNA dan Tingkat Protein dari MMP-2 / MMP-9
dan TIMP-1 / TIMP-2 di BMEC Manusia Di Bawah OGD

Pengobatan Simvastatin secara signifikan mengurangi ekspresi gen MMP-2 sekitar sepertiga (p
<0,004), sementara tingkat protein tetap tidak terpengaruh (p = 0,14) (Gbr. 1). Ekspresi gen
MMP-9> 300 kali lipat lebih rendah dibandingkan MMP-2 dan sekresi protein ke dalam media
kultur sel berkisar antara 1,79 dan 6,95 ng / ml tanpa perbedaan antara kelompok. TIMP-1
mRNA dan kadar protein meningkat sekitar dua kali lipat dalam pengobatan simvastatin
(keduanya p <0,001). Tingkat mRNA TIMP-2 menunjukkan peningkatan 40% (p = 0,011),
sementara tingkat protein tiga kali lipat dibandingkan dengan kontrol (p <0,001).

Diskusi
Dalam penelitian ini, kami menyelidiki efek pengobatan simvastatin pada metabolisme MMP
pada BMEC manusia yang mengalami OGD.Saat ini, ada peningkatan bukti bahwa statin secara
menguntungkan mempengaruhi stroke iskemik akut [3, 4, 9].
Temuan kami adalah sebagai berikut: (i) simvastatin tidak memiliki pengaruh pada
keseluruhan sitotoksisitas BMEC, terlepas dari apakah sel di bawah OGD atau tidak; (ii) kami
dapat menunjukkan efek yang menguntungkan pada metabolisme MMP karena simvastatin
sangat menginduksi ekspresi dan sekresi TIMP-1 dan TIMP-2; (iii) hasil untuk MMP-2 tidak
konsisten, seperti yang kami peroleh terdapat penurunan ekspresi gen tetapi kadar protein tidak
terpengaruh, mungkin karena rilis yang relevan dari MMP-2 latenyang disimpan dalam
intraseluler; dan (iv) ekspresi dan sekresi gen MMP-9 dalam galur sel hCMEC / D3 dalam
kondisi OGD rendah dan tidak terpengaruh oleh pengobatan simvastatin.
Hasil kami menunjukkan adanyamekanisme bersama yang mungkin bertanggung jawab
pada efek menguntungkan statin pada unit neurovaskular pada stroke iskemik. Ini mungkin
berkontribusi pada kemungkinan hipotesis yang lebih tinggi untuk hasil klinis yang
menguntungkan [3, 4].Sejauh pengetahuan kami, belum ada penelitian sebelumnya yang meneliti
efek statin dalam model stroke iskemik in vitro sejauh ini. Dengan tidak adanya OGD, statin
menghambat MMP 2 dan MMP-9 tetapi tidak TIMP-1 atau TIMP-2 dalam sel endotel dan sel
otot polos vaskular [6, 10, 11]. Hanya satu penelitian klinis yang meneliti efek pemberian
simvastatin pada stroke iskemik akut [12].Tingkat serum MMP-9 dan TIMP-1 dilaporkan tidak
terpengaruh oleh pengobatan.Namun, serum bukan jenis sampel terbaik karena pembekuan darah
dapat melepaskan beberapa biomarker inflamasi termasuk MMP-9.
Sebagai kesimpulan, hasil kami menunjukkan efek yang menguntungkan dari pra-
perlakukan statin terhadap metabolisme MMP dalam model stroke in vitro dari galur sel endotel
mikrovaskular otak manusia, terutama oleh pelepasan TIMP-1 dan TIMP-2 yang diinduksi.
Penelitian dengan tikus eksperimental dengan fokus pada rilis MMP dan TIMP lokal di otak dan
uji klinis acak diperlukan untuk lebih jauh guna menjelaskan efek pleiotropik statin dalam stroke
iskemikfase akut.

Ucapan Terima Kasih

Peneltiian ini menerima hibah (nomor hibah kontrak FP7 / 2007-2013) dari Program Kerangka
Ketujuh Uni Eropa berdasarkan perjanjian hibah 201024 dan 202213 (Jaringan Stroke Eropa).

Konflik kepentingan
Björn Reuter, Claus Rodemer, Saskia Grudzenski, Stephen Meairs, Michael G. Hennerici, dan
Marc Fatar menyatakan bahwa mereka tidak memiliki konflik kepentingan apapun.