Pengaruh Simvastatin terhadap MMP

dan TIMP dalam Sel Endotel Otak

Manusia dan Percobaan Stroke
Björn Reuter, Claus Rodemer, Saskia Grudzenski,
Stephen Meairs ,Peter Bugert & Michael G,
Hennerici, Marc Fatar

Pembimbing : dr. Nino Widjayanyo, Sp.S

Indra Fransis Liong

112017039
 PENDAHULUAN
• Baik stroke iskemik dan hemoragik berhubungan dengan perubahan
ekspresi, sekresi, dan aktivasi matrix metalloproteinases (MMP)
• MMP mengganggu sawar darah otak (MMP 2 dan MMP 9)
• TIMP berfungsi sebagai inhibitor MMP  mendukung integritas BBB
• Statin memiliki efek positif pada metabolisme MMP dalam sistem
vaskuler manusia
• Penelitian klinis dan meta-analisis mengungkapkan bahwa statin
mungkin mendukung hasil fungsional yang menguntungkan setelah
serangan stroke
• Karena efek positif statin pada metabolisme MMP dalam sistem
vaskuler manusia diperlihatkan baik secara in vitro dan in vivo, kami
berhipotesis bahwa mereka juga mungkin dapat memperbaiki
metabolisme MMP selama perjalanan stroke akut
 METODE
Kultur dan Perawatan Sel
• Eksperimen kultur sel dilakukan dengan menggunakan galur BMEC
manusia yang immortal hCMEC / D3
• Sel dikultur dalam media suplementasi EBM-2 (Lonza, Basel, Swiss)
dan disemai dalam enam lubang dengan 21% O2, 5% CO2, 74% N2,
dan suhu 37 ° C dalam inkubator
• 24 jam sebelum oxygen glucose deprivation (OGD), media EBM-2
diberi simvastatin pada konsentrasi 5 μmol / l kecuali untuk kontrol
• Secara singkat, sel-sel dicuci tiga kali dengan 1 × fosfat buffered saline (PBS) (pH
7,4), kemudian diubah menjadi media Opti-MEM bebas deoksigenasi dan glukosa
ditambah tanpa simvastatin, dan disimpan dalam ruang modular tertutup dengan
atmosfer oksigen bebas pada suhu 37 ° C.
• Sebelum OGD, kemungkinan efek sitotoksik dari 5 μmol / l simvastatin ditentukan
menggunakan Kit Deteksi Kematian Sel ELISA Plus. Sel-sel disemai dalam 96-lubang
(sekitar 20.000 sel per well) dan disimpan dalam inkubator reguler selama 24 jam.
• Setelah 20 jam OGD, sel dilisiskan dan diproses sesuai dengan protokol pabrikan.
Sitotoksisitas terkait simvastatin ditentukan dalam kondisi kontrol dan OGD dan
dibandingkan dengan sel yang tidak diobati.Semua percobaan dilakukan dalam
rangkap tiga.
Uji Imunosorben Terkait-Enzim
• Kadar konsentrasi MMP-2, MMP-9, TIMP-1, dan
TIMP-2 diukur dalam dengan pelat mikrotiter 96
lubang menggunakan kit uji ELISA

Reaksi Rantai Polimerase Real-Time Kuantitatif

• Isolasi mRNA dan cDNA diukur dengan PCR real time
• sel-sel OGD segera dicuci tiga kali dengan 1 × PBS
(pH 7,4).
• Sel-sel dikacaukan dan dihomogenisasi
menggunakan buffer lisis sel (buffer RLT; Qiagen,
Hilden, Jerman) dan disimpan pada suhu -80 ° C
untuk diproses lebih lanjut
Analisa Statistik
• Hasil disajikan sebagai nilai rata-rata ± standar
deviasi
 HASIL
• Hasil dari 20 jam OGD dengan dan tanpa simvastatin,
menunjukkan tidak ada efek sitotoksik simvastatin
• Pengobatan Simvastatin secara signifikan mengurangi
ekspresi gen MMP-2 sekitar sepertiga (p <0,004), sementara
tingkat protein tetap tidak terpengaruh (p = 0,14)
• Ekspresi gen MMP-9 > 300 kali lipat lebih rendah
dibandingkan MMP-2 dan sekresi protein ke dalam media
kultur sel berkisar antara 1,79 dan 6,95 ng / ml
• TIMP-1 mRNA dan kadar protein meningkat sekitar dua kali
lipat dalam pengobatan simvastatin
 Diskusi
• Dalam penelitian ini, kami menyelidiki efek pengobatan
simvastatin pada metabolisme MMP pada BMEC manusia
yang mengalami OGD
• Temuan kami adalah sebagai berikut :
– Simvastatin tidak memiliki pengaruh pada keseluruhan
sitotoksisitas BMEC, terlepas dari apakah sel di bawah
OGD atau tidak
• Temuan kami adalah sebagai berikut :
– kami dapat menunjukkan efek yang menguntungkan
pada metabolisme MMP karena simvastatin sangat
menginduksi ekspresi dan sekresi TIMP-1 dan TIMP-2
– hasil untuk MMP-2 tidak konsisten, seperti yang kami
peroleh terdapat penurunan ekspresi gen tetapi kadar
protein tidak terpengaruh, mungkin karena rilis yang
relevan dari MMP-2 latenyang disimpan dalam
intraseluler
• Temuan kami adalah sebagai berikut :
– Ekspresi dan sekresi gen MMP-9 dalam galur sel hCMEC /
D3 dalam kondisi OGD rendah dan tidak terpengaruh
oleh pengobatan simvastatin.
• Hasil kami menunjukkan adanya mekanisme bersama yang mungkin
bertanggung jawab pada efek menguntungkan statin pada unit
neurovaskular pada stroke iskemik.
• Sejauh pengetahuan kami, belum ada penelitian sebelumnya yang
meneliti efek statin dalam model stroke iskemik in vitro sejauh ini.
• Dengan tidak adanya OGD, statin menghambat MMP 2 dan MMP-9
tetapi tidak TIMP-1 atau TIMP-2 dalam sel endotel dan sel otot polos
vaskular.
• Hanya satu penelitian klinis yang meneliti efek pemberian simvastatin
pada stroke iskemik akut.
• Tingkat serum MMP-9 dan TIMP-1 dilaporkan tidak terpengaruh oleh
pengobatan.
 KESIMPULAN
• Hasil kami menunjukkan efek yang menguntungkan
dari pra-perlakukan statin terhadap metabolisme
MMP dalam model stroke in vitro dari galur sel
endotel mikrovaskular otak manusia, terutama oleh
pelepasan TIMP-1 dan TIMP-2 yang diinduksi.
• Penelitian lebih lanjut masih diperlukan