Bagaimana pewarnaan histologis bekerja

pengantar

Semua metode pewarnaan histologis, dari pewarnaan asam hingga

peresapan perak, didasarkan pada prinsip fisikokimia yang sama, seperti yang
akan dijelaskan dalam bab ini. Contoh diberikan dari beberapa bidang aplikasi
yang dibahas dalam buku ini. Metode yang menggunakan zat warna ditekankan,
sehingga beberapa informasi latar belakang mengenai pewarna disediakan di akhir
bab ini. Panduan pemecahan masalah umum juga ditambahkan.
Pertanyaan-pertanyaan kunci yang perlu diingat ketika mencari untuk
memahami noda histologis adalah sebagai berikut:
Sebuah. Mengapa ada komponen jaringan yang ternoda?
b. Mengapa komponen bernoda tetap ternoda?
c. Mengapa semua komponen tidak ternoda?
              Jawabannya seringkali kompleks, mencerminkan sifat multifasa dari
proses pewarnaan, di mana sel dan jaringan padat berinteraksi dengan larutan
reagen pewarnaan. Jadi histokimia enzim bukan hanya 'biokimia', tidak juga
prosedur asam-Schiff (PAS) periodik hanya kimia organik, atau imunostaining
hanya imunokimia. Selain biokimia, kimia, dan imunokimia, metode pewarnaan
seperti itu juga dipengaruhi oleh penyerapan selektif reagen ke dalam jaringan,
dan hilangnya selektif produk dan / atau reagen dari jaringan. Penyerapan dan
kerugian seperti itu tergantung pada kedua faktor afinitas dan tingkat. Catatan
nomenklatur: pewarnaan selalu melibatkan pelabelan visual dari beberapa entitas
biologis dengan melampirkan, atau menyimpan di sekitarnya, penanda warna atau
bentuk karakteristik. Noda adalah penanda, atau reagen yang digunakan untuk
menghasilkan penanda
 
Teori umum tentang pewarnaan
Mengapa noda dimasukkan ke dalam jaringan?
 Penyerapan noda sering karena jaringan pewarna atau afinitas
reagenttissue . Dalam literatur pewarnaan histologis, untuk mengatakan
komponen jaringan memiliki afinitas yang tinggi untuk pewarna hanya dapat
berarti bahwa, di bawah kondisi penggunaan, komponen menjadi sangat ternoda.
Namun afinitas juga digunakan untuk menggambarkan kekuatan-kekuatan
menarik yang dianggap mengikat pewarna pada jaringan.
Ahli kimia fisik menggunakan istilah afinitas dalam pengertian
sebelumnya, dan penggunaannya diadopsi di sini. Jadi dalam bab ini afinitas
menggambarkan kecenderungan
noda untuk mentransfer dari solusi ke bagian.
Besarnya afinitas tergantung pada setiap faktor yang mendukung atau
menghambat gerakan ini. Interaksi noda-jaringan, noda-pelarut, dan noda-noda
semua harus dipertimbangkan, karena memang harus interaksi pelarut-pelarut.
Pendekatan ini awalnya mengasumsikan pewarnaan berlanjut sampai
keseimbangan tercapai, tetapi dalam praktiknya hal ini sering tidak tercapai.
Terlebih lagi penyerapan zat pewarna dan pereaksi seringkali multistep, baik
dalam ruang maupun waktu. Suatu reagen pada awalnya dapat memasuki jaringan
karena, katakanlah, daya tarik coulomb . Begitu masuk, ia dapat membentuk
ikatan kovalen dengan beberapa kelompok jaringan . Intensitas s taining juga
dapat dibatasi oleh kelarutan noda di lingkungan pelarut dan jaringan.
Berbagai kontribusi pada afinitas jaringan-noda diuraikan pada Tabel 9.1,
dan dibahas di bawah ini. Proses pewarnaan praktis biasanya melibatkan beberapa
faktor tersebut.
 
Interaksi jaringan reagen
Daya tarik coulomb , yang juga disebut ikatan garam atau ikatan
elektrostatik, secara luas dibahas interaksi reagen-jaringan. Ini muncul dari daya
tarik elektrostatik dari ion yang tidak sama, misalnya kation berwarna dari
pewarna dasar dan struktur jaringan yang kaya akan anion seperti DNA fosfat ,
atau mukosa yang disulfasi (Lyon 1991; Prentø 2009). Dalam prakteknya, jumlah
ion pewarna mengikat substrat jaringan tidak hanya tergantung pada tanda-tanda
muatan pewarna dan jaringan tetapi juga pada besarnya mereka, pada jumlah non-
dye elektrolit hadir dalam rendaman zat warna, dan pada kemampuan jaringan
substrat membengkak atau menyusut (Scott 1973; Bennion & Horobin 1974;
Goldstein & Horobin 1974b; Horobin & Goldstein 1974).
Fenomena seperti itu penting untuk semua pereaksi ionik, bukan hanya zat
warna, contohnya adalah anion periodik yang digunakan sebagai oksidan dalam
prosedur Schiff asam-periodik (Scott & Harbinson 1968). Bahkan substrat
jaringan yang awalnya tidak bermuatan memperoleh karakter ionik setelah
mengikat reagen ionik, misalnya pewarnaan glikogen dengan prosedur PAS dan
dengan carmine Best. Pasukan Van der Waals meliputi gaya tarik antarmolekul
seperti dipol-dipol, dipol yang diinduksi dipol dan gaya dispersi. Ini terjadi antara
semua reagen dan substrat jaringan, tetapi karena molekul dengan sistem
elektronik yang terdelokasi secara luas cenderung memiliki dipol yang lebih besar
dan lebih mudah dipolarisasi , maka Pasukan der Waals biasanya paling kritis
ketika jaringan atau noda mengandung bagian tersebut.
Akibatnya, protein yang kaya akan residu tirosin dan triptofan, serta asam
nukleat dengan basa heterosikliknya, mendukung daya tarik van der Waals,
seperti halnya sistem pewangi aromatik yang besar seperti pewarna bisazo dan
garam bistetrazolium , pewarna terhalogenasi (seperti mawar Bengal dan phloxine
) , dan substrat enzim berdasarkan naftil dan indoksil dengan konjugasi yang
diperluas ( Horobin & Bennion 1973). Misalnya, daya tarik van der Waals
berkontribusi besar terhadap afinitas jaringan-noda ketika pewarnaan serat elastis
- kaya akan desmosin aromatik dan residu isodesmosin - dengan asam
polyaromatik dan pewarna dasar seperti Kongo merah dan orcein .
Ikatan hidrogen adalah daya tarik jaringan pewarna yang timbul ketika
atom hidrogen terletak di antara dua atom elektronegatif (misalnya oksigen atau
nitrogen), meskipun ikatan kovalen hanya terikat pada satu. Air berikatan
hidrogen secara luas dengan dirinya sendiri, membentuk kluster yang penting
untuk efek hidrofobik yang dibahas di bawah, dan juga ke molekul lain dengan
gugus ikatan hidrogen, seperti banyak pewarna dan komponen jaringan. Karena
ada lebih banyak molekul air yang hadir daripada pewarna, ikatan hidrogen
biasanya tidak penting untuk afinitas jaringan-noda ketika pelarut berair
digunakan. Pengecualian muncul ketika ikatan hidrogen sangat disukai oleh
substrat, seperti halnya dengan serat jaringan ikat ( Prentø 2007). Dalam larutan
yang seluruhnya atau sebagian tidak berair, ikatan hidrogen juga dapat menjadi
signifikan, seperti halnya pewarnaan carmine Best untuk glikogen ( Horobin &
Murgatroyd 1970).
Ikatan kovalen antara jaringan dan noda juga terjadi, yang ikatannya dapat
dianggap hanya sebagai sumber lain dari afinitas jaringan-noda. Metode reaktif
praktis , misalnya nuklir Feulgen dan prosedur Schiff asam periodik, dijelaskan di
bagian lain dalam buku ini. Ikatan kovalen polar antara ion logam dan pewarna
'mordan' adalah kasus khusus. Ikatan jaringan pewarna karena ikatan tersebut
telah disebut mordanting , tetapi statusnya tidak pasti. Sifat pewarnaan yang khas
dari pewarna mordan mungkin memiliki penyebab lain, atau paling tidak
tambahan. Misalnya, tidak seperti kebanyakan pewarna kationik yang digunakan
sebagai noda biologis, pewarna logam kompleks kationik biasanya sangat
hidrofilik ( Bettinger & Zimmermann 1991) dan akibatnya menolak ekstraksi ke
dalam cairan dehidrasi alkohol (Marshall & Horobin 1973).
 
Interaksi pelarut-pelarut
Kontribusi utama pada afinitas jaringan-noda ketika menggunakan
pereaksi atau pewarna organik dalam larutan air adalah efek hidrofobik. Ini adalah
kecenderungan pengelompokan hidrofobik (seperti leusin dan rantai sisi valin dari
protein; atau pengelompokan bifenil dan naftil dari substrat dan zat warna enzim)
untuk bergabung bersama, meskipun pada awalnya tersebar dalam lingkungan
berair. Proses ini terjadi karena air adalah cairan yang sangat terstruktur. Banyak
molekul air disatukan oleh ikatan hidrogen (lihat di atas) dalam kelompok
sementara, yang pembentukannya disukai oleh adanya gugus hidrofobik. Proses
pemecahan cluster menjadi molekul air individu terjadi secara spontan, karena
peristiwa ini meningkatkan entropi sistem. Akibatnya, menghilangkan gugus
hidrofobik klusterstabilisasi dari kontak dengan air, dengan menempatkan mereka
dalam kontak satu sama lain, secara termodinamik disukai. Untuk latar belakang
tentang efek hidrofobik lihat buku teks biokimia atau termodinamika kimia
( Tanford 2004). Efeknya menjadi lebih penting karena substrat dan reagen
menjadi lebih hidrofobik, seperti halnya pewarnaan lemak oleh pewarna Sudan.
Ketika pewarna hidrofobik ini diaplikasikan dari larutan yang pada dasarnya
berair, efek hidrofobik akan menjadi kontribusi besar bagi afinitas. Perlu dicatat
bahwa efek hidrofobik kadang-kadang disebut ikatan hidrofobik, meskipun tidak
ada ikatan khusus yang terlibat (hanya ikatan hidrogen air-air dan, kadang-
kadang, daya tarik staintissue van der Waals).
Beberapa prosedur pewarnaan melibatkan pewarna Sudan menggunakan
pelarut di mana air tidak ada, atau hanya konstituen kecil. Di sini, hukum kedua
termodinamika - kecenderungan suatu sistem untuk berubah secara spontan untuk
memaksimalkan gangguannya (yaitu, agar entropi meningkat seperti yang
dijelaskan dalam teks-teks termodinamika kimia) - dapat digunakan kembali.
Pewarna yang disebarkan melalui lemak dan pelarut merupakan sistem yang lebih
tidak teratur dibandingkan pewarna yang dibatasi untuk satu fase. Akibatnya,
pewarna menjadi tersebar dan terjadi pewarnaan. Tentu saja, peningkatan entropi
seperti itu yang melibatkan substrat dan pewarna terjadi pada semua jenis sistem
pewarnaan.
 
Interaksi noda-noda
Interaksi pewarna-pewarna juga dapat berkontribusi terhadap afinitas.
Molekul pewarna cenderung menarik satu sama lain, membentuk agregat. Bahkan
dalam larutan encer, dan terutama dalam larutan air di mana efek hidrofobik
penting, dimer atau agregat ion pewarna yang lebih besar sering hadir. mobil van
Daya tarik der Waals (lihat di atas) antara molekul pewarna akan menjadi penting
dalam larutan air dan non-air. Agregasi pewarna meningkat dengan
konsentrasi, misalnya ketika konsentrasi pewarna tinggi membangun pada bagian
jaringan. Dengan pewarna dasar (kationik), ini terjadi pada substrat dengan
densitas muatan negatif yang tinggi, misalnya polisakarida tersulfasi dalam
butiran sel mast, sebuah situs klasik untuk pewarnaan metakromatik dengan
pewarna seperti toluidine blue. Fenomena ini terjadi karena agregat pewarna
memiliki sifat spektral yang berbeda dari pewarna monomer . Interaksi pewarna-
pewarna berkontribusi terhadap afinitas dalam bagian jaringan ditunjukkan secara
kuantitatif oleh Goldstein (1962).
Contoh lain dari interaksi noda-noda yang berkontribusi pada afinitas
termasuk metallic nano - dan mikro-kristal yang dihasilkan oleh emas atau perak
bangsa impreg, sulfida logam endapan terbentuk di Gomori -jenis enzim
histokimia, dan ungu biru-eosin kompleks transfer biaya yang dihasilkan selama
Romanowsky-Giemsa pewarnaan inti sel (Horobin 2011).
 
Beberapa kemungkinan yang tidak biasa
Beberapa noda tidak diambil oleh target jaringan mereka. Dalam
pewarnaan negatif bentuk-bentuk struktur diungkapkan dengan menguraikan atau
mengisinya dengan noda . Contohnya termasuk memvisualisasikan
mikroorganisme individu menggunakan nigrosine , dan menunjukkan canaliculi
dari matriks tulang menggunakan picro-thionine .
Kadang-kadang noda diambil menjadi makhluk hidup, dengan cara yang
mencerminkan komposisi biokimia dan aktivitas fisiologis sel hidup atau
organisme. Biasanya disebut pewarnaan vital atau pewarnaan supravital , ini
sekarang biasanya digambarkan sebagai penggunaan probe fluoresens. Selama 20
tahun terakhir metodologi ini telah mengalami kebangkitan; untuk gambaran
umum terbaru lihat Celis (2006).
 
Kelarutan, properti terkait
Sifat pewarnaan yang sedikit dibahas, namun tetap penting, adalah
kelarutannya. Sebagai contoh, ketika pewarnaan lemak dengan pewarna Sudan,
batas atas intensitas pewarnaan ditentukan oleh kelarutan pewarna dalam zat
target, dan juga dipengaruhi oleh kelarutan dalam pelarut mandi pewarnaan.
Kelarutan juga terlibat dalam retensi pewarna setelah pewarnaan: lihat di bawah.
Kelarutan reagen pewarnaan memiliki penyebab kompleks. Sederhananya,
semakin kuat interaksi reagen-reagen, semakin rendah kelarutannya. Untuk
diskusi umum tentang kelarutan, lihat teks-teks fisikokimia dari Letcher (2007).
  
Mengapa noda dipertahankan di jaringan setelah dikeluarkan dari
bak pewarnaan?
Ini terjadi karena noda memiliki afinitas yang sangat tinggi untuk elemen
jaringan dan / atau afinitas rendah untuk memproses cairan dan media pemasang,
atau setidaknya larut dalam bahan yang terakhir ini dengan sangat lambat Untuk
menggambarkan poin-poin ini, pertimbangkan beberapa noda umum.
Pigmen seperti biru Prusia yang dihasilkan dalam metode Perls untuk zat
besi, dan sulfida timbal yang diproduksi dalam histokimia enzim gaya Gomori ,
hampir tidak larut dalam pelarut standar. Ini juga berlaku untuk mikrokristal perak
dan emas yang dihasilkan oleh impregnasi logam. Beberapa pigmen organik
kurang memuaskan. Jadi, pewarna azo , formazan dan indigo tersubstitusi yang
diproduksi sebagai produk reaksi akhir dalam histokimia enzim memiliki
kelarutan yang rendah dalam air, tetapi dapat larut dalam media hidrofobik seperti
alkohol, xilena , dan polistiren. Dalam kasus seperti itu media pemasangan
hidrofilik digunakan, dan pewarnaan elemen jaringan yang kaya lipid harus
dianggap sebagai mungkin artifaktual .
Kelarutan formazans dan azodyes kadang-kadang dikurangi dengan
konversi situ untuk kompleks logam. Noda kompleks logam rutin lainnya adalah
kompleks aluminium, kromium dan besi hematein , dan kompleks kromium dari
gallocyanine . Pewarna kompleks logam ini tidak mudah dihilangkan dari jaringan
dengan cairan pemrosesan rutin atau media pemasangan (lihat di atas).
Ini kontras dengan pewarna dasar (kationik) rutin seperti kristal violet atau
biru metilen , yang secara bebas dan cepat larut dalam alkohol yang lebih rendah.
Pewarna asam rutin (anionik), seperti eosin Y atau jeruk G, sering kurang larut
dalam alkohol, karena memang pewarna basa hidrofilik dengan sistem aromatik
yang besar, seperti alcian blue. Pewarna non-ionik seperti pewarnaan lemak
Sudan larut dalam zat-zat dehidrasi dan pelarut pembersih , dan pada zat-zat
penguat resin . Catatan: struktur eksemplar pewarna basi c hidrofilik dan lipofilik
ditunjukkan pada Gambar 9.1.
 Oleh karena itu, bagian yang diwarnai dengan pewarna dasar rutin harus
didehidrasi dengan cepat melalui alkohol, atau dengan menggunakan pelarut non-
alkohol, atau dengan pengeringan udara, sedangkan dehidrasi kurang penting
dengan pewarna asam. Bagian yang diwarnai dengan asam atau pewarna basa
biasanya dipasang pada media yang tidak berair untuk mencegah ekstraksi
pewarna. Sebagai alternatif, pewarna dapat diimobilisasi, misalnya dengan
pembentukan senyawa koordinasi logam, fosfatungstat atau
Mengapa noda tidak masuk ke setiap bagian jaringan?
 
Pertanyaan selektivitas ini sangat mendasar bagi histokimia , dan bahkan
metode pengawasan rutin seperti hematoksilin dan eosin (H&E), noda
Papanicolaou dan Romanowsky-Giemsa membedakan inti dari sitoplasma. Jadi
kita harus menemukan faktor-faktor apa yang mengontrol selektivitas semacam
itu .
 
Jumlah dan kedekatan situs yang mengikat
Kedua faktor ini mempengaruhi pewarnaan. Namun, dengan tidak adanya
penyelidikan kuantitatif, mereka tidak mudah dibedakan - jadi di sini akan dibahas
sebagai efek tunggal. Afinitas jaringan-noda dan jumlah situs pengikat yang ada
dalam jaringan dapat bervariasi secara independen.
Pewarna Sudan dapat digunakan sebagai contoh. Ini memiliki afinitas
tinggi untuk lemak tetapi afinitas rendah untuk protein terhidrasi di sekitarnya.
kalau tidak
orang dapat mempertimbangkan sistem pewarnaan di mana ikatan kovalen
terbentuk. Reagen memberikan produk berwarna hanya dengan kisaran terbatas
pengelompokan bahan kimia jaringan. Jadi, urutan reagen hidrolisis asam-Schiff
dari Feulgen Teknik nukleal memberikan derivatif merah hanya dengan DNA.
Pemahaman sistem pewarnaan seringkali membutuhkan pertimbangan
pola afinitas. Dengan pasangan pewarna asam-basa asam tradisional (H&E,
Papanicolaou , dan Romanowsky ) pewarna asam bermuatan negatif memiliki
afinitas tinggi untuk struktur jaringan yang membawa muatan kationik (protein,
dalam kondisi asam). Namun mereka memiliki afinitas rendah untuk struktur yang
membawa muatan negatif (orang-orang kaya di glycosaminoglycans sulfat, atau
asam nukleat phosphated), dengan sebaliknya menjadi kasus untuk pewarna dasar.
Ini menghasilkan pola pewarnaan dua nada di mana sitoplasma kontras dengan
bahan nuklir.
Kondisi pewarnaan yang praktis memaksimalkan afinitas selektif. Pewarna
dasar diterapkan dari larutan netral atau asam, karena dalam kondisi basa protein
membawa muatan negatif keseluruhan dan karenanya juga dapat mengikat
pewarna dasar. Afinitas juga dipengaruhi oleh memvariasikan konsentrasi hadir
garam anorganik. Berbagai aluminium- hematoxylin , misalnya, berbeda secara
substansial dalam hal ini. Kritis metodologi konsentrasi elektrolit (Scott 1973) dan
beberapa prosedur empiris lain didasarkan pada kontrol konten elektrolit. Namun,
pewarnaan yang membedakan dua struktur masih mungkin terjadi bahkan ketika
afinitas jaringan-noda dan jumlah situs yang mengikat noda sama. Ini karena laju
pengambilan reagen, atau laju reaksi selanjutnya, atau tingkat kehilangan reagen
atau produk, mungkin tidak sama dalam dua struktur.
 
Tingkat penyerapan reagen
Metode pewarnaan progresif dapat dikontrol laju, misalnya pewarnaan
musin menggunakan alcian blue atau besi koloid. Selektivitas membutuhkan
periode pewarnaan yang singkat dimana hanya lendir yang pewarnaan cepat
memperoleh warna (Goldstein 1962, Goldstein & Horobin 1974a). Jika
pewarnaan berkepanjangan, bahan basofilik tambahan seperti nuklei dan
sitoplasma yang kaya RNA juga bisa ternoda. Pewarna yang digunakan dengan
cara ini seringkali berukuran besar, dan karenanya menyebar perlahan,
memaksimalkan kontrol yang dimungkinkan melalui efek laju diferensial.
 
Tingkat reaksi
Pewarnaan selektif oleh reagen reaktif, menghasilkan turunan berwarna,
dapat bergantung pada laju reaksi diferensial. Misalnya, asam periodik dapat
mengoksidasi berbagai substrat yang ada di jaringan. Namun, dalam aplikasi
histokimia dari prosedur periodik acidSchiff pendek waktu oksidasi membatasi
pewarnaan berikutnya untuk pengelompokan 1 , 2 -diol cepat polisakarida. Enzim
histokimia memberikan contoh lebih lanjut dari selektivitas mengendalikan laju
reaksi. Ketika diinkubasi pada pH rendah, hidrolisis fosfat organik cepat terjadi
pada jaringan yang mengandung asam fosfatase sedangkan pada struktur yang
mengandung alkali fosfatase , dengan pH yang lebih tinggi, laju hidrolisis lambat.
 
Tingkat kehilangan reagen
Diferensiasi atau pewarnaan regresif melibatkan hilangnya noda secara selektif
dari jaringan. Banyak metode pewarnaan mengeksploitasi fenomena ini, misalnya
pewarnaan lecet otot dengan iron- hematoxylin , dan selubung mielin dengan
luxol fast blue. Dalam prosedur tersebut, pewarnaan non selektif awal diikuti
dengan ekstraksi dalam pelarut. Pewarna pertama kali hilang dari struktur
permeabel seperti serat kolagen. Struktur yang relatif tidak tembus cahaya seperti
pita otot A dan Z, dan selubung mielin, mempertahankan noda paling lama.
Kontrol laju kehilangan reagen sangat penting dalam metodologi yang
sangat berbeda, yaitu pewarnaan perak dari serabut saraf. Selama langkah
impregnasi, silverion mengikat secara non-selektif ke banyak kelompok jaringan.
Selanjutnya, jaringan diperlakukan dengan pengembang yang mampu mengurangi
kation perak menjadi logam perak. Laju reaksi dengan zat pereduksi ini sangat
penting. Jika laju terlalu cepat, karena konsentrasi tinggi atau reaktivitas tinggi
reagen, butir perak disimpan secara non-selektif di seluruh jaringan. Jika reduksi
terlalu lambat, pewarnaan tidak terjadi karena sebagian besar ion perak berdifusi
ke dalam pelarut sebelum berkurang. Pewarnaan selektif terjadi ketika ion perak
berdifusi dari latar belakang dengan cepat, ditahan dalam entitas yang kurang
permeabel (misalnya, serabut saraf, nukleolus, sel darah merah) di mana mereka
kemudian berkurang (Peters 1955a, 1955b).
Metode yang dikontrol laju seperti itu dipenuhi oleh berbagai artefak
teknis. Memang, faktor apa pun yang mempengaruhi laju kehilangan reagen
(misalnya, variasi ketebalan bagian, suhu, pengadukan larutan reagen, adanya
rongga di jaringan) dapat mengubah hasil pewarnaan.
 
Metakromasia dan fenomena terkait
Bahkan ketika baik afinitas maupun laju tidak mengontrol pola pewarnaan,
pewarnaan selektif masih dapat diperoleh. Misalnya pewarna dasar seperti metilen
biru dan toluidin biru diserap oleh berbagai substrat basofilik dalam jaringan.
Noda kromatin berwarna biru ortokromatik , tetapi matriks tulang rawan, butiran
sel mast, dan noda lendir berwarna metakromatik kemerahan ungu (ditinjau oleh
Pearse 1968) karena pembentukan agregat pewarna di situs yang kaya polianion
ini .
 
Apa efeknya terhadap pewarnaan modifikasi jaringan sebelumnya?
Modifikasi termasuk fiksasi, yang efeknya pada pewarnaan bersifat
adventif, serta teknik pemblokiran dan ekstraksi yang dimaksudkan untuk
mengubah pola pewarnaan. Modifikasi karena embedding resin dibahas secara
terpisah di bawah ini .
 
Efek fiksasi
Fiksasi dilakukan untuk mencegah hilangnya konstituen jaringan ke dalam
pemrosesan dan larutan pewarnaan, dan untuk mengurangi perubahan morfologis
jaringan postmortem. Fiksasi mengubah komponen jaringan larut menjadi turunan
yang tidak larut, tahan terhadap autolisis atau serangan oleh bakteri dan jamur.
Untuk akun umum fiksasi, lihat Bab 4; di sini hanya pengaruh pewarnaan yang
dibahas.
Zat yang diberikan sering disimpan pada batas yang berbeda oleh agen
fiksatif yang berbeda, dan tidak ada yang bisa ternoda yang tidak ditahan. Sebagai
contoh, banyak lipid yang diawetkan dengan baik setelah fiksasi dalam osmium
tetroxide atau dichromate , diawetkan dengan buruk setelah formalin, dan secara
aktif diekstraksi selama fiksasi alkohol atau aseton. Karenanya, pewarnaan lemak
setelah fiksasi alkohol tidak efektif.
Namun, sementara retensi suatu zat yang diperlukan, retensi hanya mungkin tidak
cukup untuk demonstrasi histokimia berikutnya . Sebagai contoh, walaupun
glutaraldehid sering mempertahankan lebih banyak protein daripada agen fiksatif
lainnya, penggunaannya dalam imunostaining dan histokimia enzim (dan sebagian
besar antigen dan semua enzim adalah protein) terbatas. Reaksi kimia yang sama
yang melarutkan protein juga memodifikasi aktivitas haptenic dan enzimatik .
Alkohol dan aseton, di sisi lain, meskipun miskin dalam mempertahankan protein
dalam jaringan, juga buruk dalam menghancurkan aktivitas antigen atau enzim
apa pun yang dipertahankan. Dengan demikian retensi dan reaktivitas zat
mempengaruhi pewarnaan, dan keduanya mungkin tergantung fiksatif.                
Fiksasi memiliki pengaruh yang lebih halus pada pola pewarnaan, yang, pewarna
asam dan basa memberikan contoh instruktif. Seperti yang ditunjukkan oleh
Singer (1952), pewarnaan seperti itu umumnya ditingkatkan oleh denaturasi
protein yang dihasilkan oleh fiksatif. Selain itu keseimbangan acidophilia-
basophilia dari suatu jaringan juga dipengaruhi. Jadi formalin dan osmium
tetroxide biasanya mengurangi acidophilia jaringan , sedangkan larutan acidic
dichromate biasanya meningkatkan acidophilia jaringan (Baker 1958).
 
Efek pemblokiran dan ekstraksi histokimia
Proses semacam itu mendasari prosedur kontrol tertentu. Komponen jaringan
dimodifikasi dengan cara yang seharusnya menghilangkan pewarnaan. Akibatnya
setiap pewarnaan selanjutnya menunjukkan kurangnya kekhususan pewarnaan .
Namun kenyataan mungkin lebih kompleks daripada harapan, dalam berbagai
cara.
Jadi, blokade mungkin tidak lengkap, seperti yang terjadi dengan pereaksi
asam nitrat van Slyke yang digunakan untuk mengubah gugus amino jaringan
yang menyebabkan asidofilia menjadi gugus hidroksil nonionisasi . Namun,
kemanjuran reagen ini bergantung pada jaringan dan fiksatif, dan dapat
membingungkan pekerja bangku yang tidak kritis. Efek analog terjadi dengan
prosedur ekstraksi histokimia . Dengan demikian, penghapusan RNA dari ribosom
oleh RNase juga tergantung fiksatif, dan tidak terjadi dengan mudah setelah
fiksasi formalin.
Modifikasi jaringan yang tidak terduga karena prosedur blokade dan
ekstraktif juga terjadi, menghilangkan zat tambahan yang dimaksudkan. Saat
menggunakan asam trikloroasetat atau asam perklorat untuk mengekstraksi asam
nukleat, kehilangan polisakarida dan beberapa protein juga dapat terjadi. Masalah
analog timbul selama ekstraksi enzimatik ketika jejak kotoran enzim yang hadir.
Polisakarida juga dapat hilang oleh solvolisis kimia selama ' metilasi ' asam
jaringan oleh metanol-HCl , dan DNA dan RNA diekstraksi oleh asetat anhidrida-
piridin yang digunakan untuk memblokir histones nuklir . Memang bahan dapat
diekstraksi dengan larutan pewarnaan, terutama jika asam atau basa atau ketika
jaringan tidak diperbaiki dengan baik.
Selain efek kimia yang sempit ini, semua prosedur tersebut mengubah sifat
fisik bagian jaringan, seperti permeabilitasnya. Setelah terpapar pada agen
pembengkakan atau protease, jaringan dapat menodai lebih cepat: misalnya,
nuklei dapat ternoda oleh alcian blue dan sitoplasma oleh pewarna 'kolagen' dari
pewarnaan trikodrom .
 
Apa efek dari geometri spesimen pada pewarnaan
Di sini 'spesimen' berarti bahan biologis yang benar-benar bersentuhan dengan
larutan pewarnaan seperti bagian dewaxed , apusan serviks, atau oleskan kelenjar
getah bening . Saat melihat layar atau ke bawah mikroskop, mudah untuk
melupakan bahwa spesimen memiliki ketebalan, bukan hanya lebar dan lebar.
Banyak orang merasa sulit untuk percaya bahwa perbedaan ketebalan beberapa
μm atau kurang mempengaruhi pola pewarnaan. Namun, bubar sel-sel yang dibuat
dengan cara mengolesi sering menodai sel yang berbeda dengan sel-sel dengan
tipe yang sama yang dipotong dari blok jaringan, dan bagian-bagian tipis menodai
berbeda dari yang tebal. Memang, bagian dengan profil permukaan yang tidak
teratur akan menodai secara berbeda dengan potongan bahan biologis yang sama
pada bagian dengan permukaan yang halus .
 
Pengaruh geometris sederhana
Semua benda sama, spesimen tipis lebih cepat kotor daripada tebal; spesimen-
spesimen dengan permukaan tidak teratur lebih cepat bernoda daripada halus; dan
spesimen terdispersi lebih cepat daripada noda seragam. Oleh karena itu, dalam
prosedur pewarnaan yang diberikan, spesimen yang terdispersi seperti apusan atau
oleskan memerlukan waktu pewarnaan yang lebih pendek daripada potongan sel
serupa yang dipotong dari jaringan padat. Selain itu, cryosections (yang biasanya
memiliki permukaan tidak teratur) biasanya akan lebih cepat ternoda daripada
bagian parafin yang lebih halus. Perlu dicatat bahwa bagian resin biasanya
memiliki profil yang lebih halus (lihat di bawah).
 Dalam sistem dengan mekanisme pewarnaan yang dikendalikan laju, efek
seperti itu dapat mengganggu selektivitas. Beberapa pewarnaan trichrome
memerlukan waktu pewarnaan yang lebih pendek dengan cryosections daripada
dengan bagian parafin, jika tidak, cryosections menjadi berlebihan oleh pewarna
dengan berat ion yang lebih tinggi.
 
Efek yang lebih kompleks dari spesimen geometr y
Geometri yang lebih kompleks dapat berasal dari struktur biologis, atau mungkin
timbul selama persiapan spesimen. Yang terakhir, artifaktual , geometri dianggap
pertama.
Modifikasi geometri bagian terkenal yang disebabkan oleh mikrotomi
adalah obrolan. Ini menghasilkan bagian-bagian yang mengandung strip tebal dan
tipis bergantian. Konsekuensi yang mungkin untuk pewarnaan termasuk
terjadinya strip-strip alternatif pewarnaan yang kuat dan lemah atau, dengan
beberapa trikoma , strip-strip alternatif dengan warna yang bervariasi.
Geometri kompleks juga muncul pada sediaan apus. Misalnya, apusan dari
epitel sering mengandung gumpalan sel multisel dan juga dispersi monoseluler .
Sel di pusat rumpun seperti itu kurang dapat diakses oleh noda daripada sel
perifer. Akibatnya, dalam metode yang dikontrol-laju seperti Papanicolaou dan
Romanowskystains , sel-sel yang terletak di pusat dapat ditinggikan oleh zat
pewarna terkecil, seperti yang diilustrasikan oleh Boon dan Drijver (Pelat 6.4 dan
24.4; 1986).
              Profil bagian juga dipengaruhi oleh fiksasi. Fiksatif koagulan seperti   
Cairan Carnoy cenderung menghancurkan sel dan jaringan, sehingga
menimbulkan lebih banyak spesimen yang tersebar, sementara fiksatif seperti
formalin memberikan bentuk yang lebih integral. Untuk ilustrasi langsung tentang
ini, lihat Horobin (Gbr. 14, 1982). Akibatnya, jika pewarnaan trichrome yang
dikendalikan laju menimbulkan keseimbangan warna yang benar ketika
diterapkan pada jaringan formalin , itu akan cenderung menunjukkan overstaining
oleh pewarnaan serat kolagen (biasanya
pewarna yang lebih besar) jika diterapkan tanpa modifikasi bahan tetap dalam
cairan Carnoy ini.
                            Ukuran struktur biologis relatif terhadap ketebalan bagian juga
bisa signifikan. Pertimbangkan butiran sekresi dengan diameter jauh lebih besar
atau lebih kecil dari ketebalan bagian. Semua butiran besar akan diiris, dengan
isinya terbuka pada permukaan bagian, sedangkan sebagian kecil
butiran akan utuh, terlampir di dalam bagian. Ini akan sangat mempengaruhi
aksesibilitas untuk noda yang lebih besar: misalnya, immunostaining di mana
noda adalah makromolekul. 'Dua jenis granula sekresi' yang dilaporkan dalam
sejumlah studi imunostaining dapat mewakili granula utuh dan irisan.
Efek seperti itu dapat lebih jelas di bagian resin: lihat di bawah.     
                            Kompleksitas geometris juga muncul dari pembengkakan
komponen sel dan jaringan dalam pewarnaan pelarut. Bahan yang kaya
glikosaminoglikan (misalnya lendir dan matriks tulang rawan) membengkak nyata
dalam larutan air; dan serat kolagen membengkak secara ekstrem pada pH
ekstrem . Pembengkakan dapat meningkatkan tingkat pewarnaan struktur ini,
dibandingkan dengan material yang tidak membengkak . Ini mungkin
berkontribusi pada selektivitas tinggi dari biru alcian berair untuk lendir ,
pewarnaan nuklir biasanya tidak ada setelah pewarnaan singkat; dan pada
selektivitas tinggi dari pewarnaan picro-trichrome yang sangat asam untuk serat-
serat kolagen. Karena alkohol tidak menyebabkan pembengkakan seperti itu ,
efek-efek ini sebagian dapat menjelaskan perubahan pewarnaan ketika pewarna
digunakan dalam larutan alkohol daripada larutan encer . Luxol cepat biru,
misalnya, pewarnaan myelin secara selektif dari larutan air, tetapi dari larutan
alkohol memberikan pewarnaan serat kolagen selektif. Efek seperti itu sering
lebih ditandai pada bagian resin, seperti yang disebutkan kemudian.
 
Apa efek embedding resin pada pewarnaan?
Biasanya, penanaman resin melibatkan infiltrasi bahan biologis dengan monomer
reaktif, paling sering suatu akrilat atau epoksida . Polimerisasi selanjutnya
menghasilkan blok resin yang melampirkan spesimen. Bagian yang dipotong dari
blok tersebut disebut bagian resin, atau plastik. Kehadiran resin, di samping bahan
biologis, selama proses pewarnaan memunculkan perubahan dalam pola
pewarnaan. Jika resin dihilangkan sebelum pewarnaan, seperti yang biasanya
dilakukan dengan bagian metilmetakrilat , pola pewarnaan sangat mirip dengan
bagian parafin, jadi tidak dibahas di sini. Spesimen juga dapat tertanam dalam
polimer yang terbentuk sebelumnya, biasanya nitroselulosa (yaitu celloidin ).
Bagian-bagian ini secara rutin diwarnai dengan kehadiran polimer, dan
berperilaku seperti bagian resin.
 
Resin sebagai pewarna noda
Karena bagian resin mengandung bahan biologis dan resin, penetrasi reagen
pewarnaan biasanya lebih lambat daripada ke parafin atau cryosections . Jika
ikatan silang resin ditingkatkan, laju penetrasi noda akan turun lebih jauh.
                            Penanaman resin sering kali memiliki efek yang lebih rumit
daripada sekadar penurunan tingkat pewarnaan. Resin biasanya menginfiltrasi
spesimen biologis secara tidak merata, dengan struktur padat atau hidrofilik yang
kurang terinfiltrasi. Ini karena bahkan sistem resin 'larut dalam air' atau 'viskositas
rendah' menggunakan monomer yang sedikit lipofilik dan cukup kental.
Konsekuensi dari infiltrasi resin yang tidak merata adalah kompleks. Sebagai
contoh, dalam spesimen yang melekat pada glikol metakrilat , struktur seperti
butiran sekresi padat sering disusupi dengan buruk, sehingga mereka dapat bebas
resin dan mudah ternoda. Jika sitoplasma di sekitarnya lebih baik diinfiltrasi
dengan resin, akibatnya butiran dapat menonjol lebih jelas dan renyah daripada di
bagian parafin.
 
Resin sebagai pengikat noda
Resin sendiri dapat mengikat noda. Sebagai contoh, monomer glikol metakrilat
terkadang terkontaminasi dengan asam metakrilat , menghasilkan pembentukan
resin glikol metakrilat yang dikarboksilasi . Resin anionik seperti itu dapat
memberikan latar belakang basofilia yang kuat , yang tidak terjadi ketika
monomer murni digunakan. Namun, pewarnaan latar belakang karena pengikatan
pewarna lipofilik , seperti aldehyde fuchsin atau Janus green, ke glikol metakrilat
tidak dapat dihindari karena resin itu sendiri agak lipofilik , meskipun monomer
resin mengandung air ( Horobin) et al. 1992). Selain artefak latar belakang,
pengikatan stain-resin dapat memberikan artefak pewarnaan negatif karena jumlah
pereaksi yang mencapai target pewarnaan biologis dapat dikurangi dengan
mengikat ke resin. Contohnya adalah lemah enzim histokimia pewarnaan terlihat
dengan certai n lipofilik substrat enzim.
                            Glikol metakrilat , unsur utama dari banyak kit penyematan resin
mikroskopis cahaya, menunjukkan artefak pengikat zat warna lain, yaitu
pengikatan 'tidak dapat dipulihkan' dari pewarna tertentu. Ini muncul dengan
pewarna berukuran sedang, misalnya aluminium hematoxylin atau eosin. Ini dapat
memasuki resin dan memodifikasi struktur polimer, membuatnya lebih permeabel.
Efek antiplastik ini menjebak pewarna, meskipun terkadang dapat dihilangkan
dengan membedakan pelarut dengan aksi plastisisasi, seperti etanol.
 
Bagaimana pewarnaan kimia mempengaruhi pola pewarnaan
Dengan reagen kecil, yang berdifusi dengan cepat melalui resin, metode
pewarnaan yang dikembangkan untuk bagian parafin atau cryostat dapat
digunakan tanpa modifikasi. Ketika bekerja dengan media tanam glikol metakrilat
rutin , 'kecil' berarti <550 dalton ( Da ), dan termasuk zat umum seperti metilen
biru, naftil fosfat, dan pereaksi Schiff.
Sebaliknya, pereaksi besar dapat sepenuhnya dikeluarkan dari resin, membatasi
pewarnaan menjadi bebas resin
struktur . Ketika menggunakan glikol metakrilat , reagen 'besar' resin adalah yang
berukuran> 1000 Da , dan termasuk alcian blue, Sirius red, dan antibodi berlabel.
                            Kemungkinan pengikatan noda pada media embedding lipofilik ,
menghasilkan artefak pewarnaan positif dan negatif, telah dicatat di atas. Masalah
seperti itu hanya terjadi dengan reagen lipofilik ( Horobin et al. 1992). Ketika
resin glikol metakrilat sedang digunakan, ' lipofilik ' menyiratkan reagen yang log
P> 1 (lihat di bawah untuk penjelasan parameter ini). Exa mples termasuk eosin,
yang memiliki untuk dibedakan dengan alkohol, dan Gomori ini
aldehyde fuchsin , yang tidak dapat dibedakan secara memuaskan. Dengan
mempertimbangkan ukuran dan hidrofilisitas glofilisitas , pedoman dapat
ditentukan untuk pewarnaan spesimen dalam resin yang larut dalam air seperti
glikol metakrilat :
• Noda hidrofilik kecil, mis. Pereaksi metilen biru dan Schiff, berperilaku sama
seperti pada parafin atau cryosections , meskipun pewarnaan sedikit lebih lambat.
• Noda dengan ukuran sedang dan / atau lipofilisitas , misalnya eosin Y dan
aluminium hematoxylin , sering menodai resin lebih lambat. Mereka juga
mewarnai resin, dan menghapus latar belakang ini membutuhkan diferensiasi
dengan pelarut pelembut seperti etanol.
• Noda lipofilik , misalnya aldehida fuchsin Gomori , memberikan warna resin
yang kuat , yang mungkin terbukti sulit dihilangkan tanpa menghilangkan noda
secara umum pada jaringan.
• Pewarnaan jaringan oleh noda hidrofilik yang besar (misalnya alcian blue, Sirius
red, atau antibody berlabel) terbatas pada struktur yang disusupi dengan resin
yang buruk.
 
Bagaimana kimia resin mempengaruhi pola pewarnaan
Terjadinya suhu tinggi dalam blok jaringan selama embedding dianggap
menyebabkan hilangnya antigenisitas dan aktivitas enzim . Akibatnya embedding
suhu rendah digunakan untuk meningkatkan sensitivitas metode imunohistokimia
dan enzim histokimia dengan jaringan resin-tertanam. Kemungkinan pelarut
organik dan reagen yang digunakan untuk dehidrasi, infiltrasi, dan polimerisasi
menyebabkan peningkatan denaturasi protein . Oleh karena itu, dehidrasi parsial
dan waktu infiltrasi pendek telah diadopsi untuk meningkatkan sensitivitas
pewarnaan. Namun, variasi-variasi ini juga dapat menurunkan jumlah resin dalam
suatu bagian, dan dengan demikian mengurangi pengecualian noda.
                            Sifat-sifat resin itu sendiri juga mempengaruhi proses
pewarnaan, dengan karakter ionik, ikatan silang , dan lipofilisitas telah
disebutkan. Carry-over dari plasticizer dan katalis polimerisasi ke dalam blok
resin adalah faktor lain. Variasi dalam jumlah dan jenis plasticizer mempengaruhi
permeabilitas resin terhadap noda. Kehadiran katalis polimerisasi dasar
menghasilkan pengikatan pereaksi pewarnaan anionik (misalnya pewarna asam)
ke resin pada pH rendah, ketika basa terprotonasi dan kationik .
 
Beberapa sifat zat warna
Beberapa pengaruh umum kimia pewarna pada pewarnaan
Ketika fitur-fitur fisikokimia pewarna yang mempengaruhi afinitas jaringan
pewarna dan tingkat pewarnaan dijelaskan menggunakan parameter numerik,
korelasi sistematis dapat ditunjukkan antara kimia pewarna dan hasil pewarnaan.
Parameter fisikokimia termasuk muatan listrik; ukuran keseluruhan (seperti yang
diwakili oleh berat ionik atau molekul); dan karakter hidrofilik / lipofilik
(dimodelkan dengan nilai log P, yaitu logaritma dari koefisien partisi oktanol-
air). Untuk menghargai keunggulan parameter numerik, periksa Gambar 9.1, di
mana informasi kimia mengenai dua pewarna dasar yang banyak digunakan
disajikan dalam dua mode, grafis dan numerik.
                            Ketika mempertimbangkan ukuran relatif dari pewarna,
informasi yang diberikan secara grafis oleh formula struktural memuaskan. Orang
dapat melihat bahwa alcian blue adalah pewarna yang jauh lebih besar daripada
kristal violet. Fakta bahwa pola pewarnaan alcian blue sangat tergantung pada
pewarnaan waktu (Goldstein & Horobin 1974a) dengan demikian tidak
mengejutkan. Karakter hidrofilik / lipofilik relatif dari kedua pewarna tidak dapat
dengan mudah dinilai dengan inspeksi visual formula, sedangkan nilai log P dari
kedua pewarna jelas sangat berbeda. Nilai negatif menyiratkan hidrofilisitas , dan
nilai positif menyiratkan lipofilisitas . Sesuai dengan konsep ini, bagian yang
diwarnai dengan biru alcian mengalami dehidrasi melalui alkohol tanpa
menghilangkan pewarna, tetapi kristal violet mudah hilang ke dalam alkohol.
                            Beberapa sifat pewarna biasanya diperlukan untuk memprediksi
kinerja pewarnaan. Karena diskusi terperinci tidak sesuai, hanya perlu dicatat
bahwa korelasi pewarnaan struktur kuantitatif berdasarkan parameter struktur
tersebut dapat menerangi beragam masalah dalam histoteknologi , dari efek fiksasi
dalam pewarnaan fosfolipid ( Horobin 1989), melalui mekanisme pewarnaan
trikoma ( Horobin & Flemming 1988) untuk menilai efek embedding resin pada
prosedur pewarnaan histokimia ( Horobin et al. 1992). Untuk tinjauan umum, lihat
Horobin (2004, 2010a). Bahkan korelasi seperti itu juga terbukti berlaku untuk
pewarnaan vital oleh probe fluoresens; untuk rangkumannya lihat Horobin (2001,
2010b).
Efek kotoran pewarna pada pewarnaan
Hampir semua pewarna yang digunakan sebagai noda tidak murni
telah memprovokasi banyak penyelidikan eksperimental dan editorial polemik.
Tapi apa yang dimaksud dengan pewarna 'tidak murni'?
                            Sejumlah pewarna dianggap tidak murni jika tidak mengandung
senyawa yang disebutkan pada label, atau jika mengandung sejumlah besar zat
berwarna lain yang ditambahkan ke pewarna tersebut. Sebagai alternatif,
kumpulan tidak murni dapat mengandung sedikit pewarna, dengan sebagian besar
isinya adalah garam anorganik. Pewarna
yang murni saat dibeli dapat terurai pada penyimpanan, atau setelah dibuat
menjadi larutan pewarnaan, atau bahkan selama pewarnaan itu sendiri. Kotoran
mempengaruhi pewarnaan dalam dua cara. Pertama, mereka dapat mengubah
intensitas pewarnaan. Biasanya pewarnaan berkurang, tetapi sangat jarang kotoran
menghasilkan warna yang lebih pekat. Kedua, pengotor dapat mengubah pola
pewarnaan, sifat dan mekanisme efek tersebut tergantung pada jenis pengotor,
prosedur pewarnaan tertentu, dan substrat jaringan. Sayangnya tidak ada cara
sederhana untuk mengidentifikasi, dan karenanya menghindari, produk yang tidak
murni tersebut. Kiat praktis adalah membeli lot pewarna yang disertifikasi oleh
Komisi Noda Biologis. Ini telah diuji di laboratorium Komisi, dan memenuhi
kriteria kemurnian dan pewarnaan kemanjuran. Yang mengejutkan, pewarna
bersertifikat Komisi rata-rata tidak lebih mahal daripada pewarna tidak
bersertifikasi. (Sebagai contoh manfaat pewarna bersertifikat, lihat Henwood
2003.) Tip praktis lainnya adalah untuk memeriksa apakah masalah pewarnaan
disebabkan oleh noda yang tidak murni dengan mempertahankan sampel lot
pewarna yang efektif. Dihadapkan dengan pola pewarnaan yang tidak terduga,
spesimen kemudian dapat diwarnai dengan pewarna yang efektif. Jika ini
memberikan warna yang memuaskan, mungkin ada masalah karena
ketidakmurnian pewarna.
                            Apa yang dapat Anda lakukan tentang batch pewarna yang tidak
murni? Hanya sedikit yang memiliki sumber daya, atau kecenderungan, untuk
terlibat dalam analisis atau pemurnian. Saran yang paling berguna adalah membeli
batch pewarna lain, lebih disukai yang bersertifikat Komisi Noda Biologis. Jika
analisis atau pemurnian memang terbukti perlu, ada literatur yang luas, yang dapat
diakses untuk pewarna individu melalui monograf dari edisi ke 10 Conn's
Biological Stains ( Horobin & Kiernan 2002), atau lebih umum melalui artikel
ulasan sebelumnya pada saat ini penulis ( Horobin 1969).
Nomenklatur pewarna
Nama-nama pewarna individu, dan istilah yang digunakan untuk menggambarkan
sifat pewarna, kadang-kadang tidak konsisten dan sering membingungkan. Karena
pewarna adalah molekul yang kompleks, hampir semua memiliki nama sepele
yang tidak secara eksplisit menggambarkan strukturnya. Sebagian besar noda
biologis pertama kali diproduksi sebagai pewarna tekstil, ketika masing-masing
produsen memberikan pewarna nama dagang mereka sendiri. Oleh karena itu,
seorang ahli biologi dapat mengatakan 'Gunakan warna biru Kongo', yang dijawab
oleh rekan-rekannya 'Tetapi kita belum mendapatkan semua itu'. Namun mereka
memiliki, tetapi di rak-rak mereka diberi label trypan blue. Lebih buruk lagi
adalah kejenuhan sufiks. Kadang-kadang ini hanyalah berkembang pena
copywriter, sehingga pyronine s G dan Y adalah sinonim. Terkadang sufiks
mengindikasikan kandungan pewarna, dan produk standar dapat diberi label 'A
100' sementara grade yang mengandung kandungan pewarna lebih tinggi disebut
'A 150' atau hanya ' A ekstra'. Namun, terkadang sufiks menunjukkan perbedaan
kimiawi yang substansial : misalnya rhodamin B dan 6G, masing-masing,
menggambarkan pewarna zwitterionik dan kationik.
                            Untuk mengurangi kebingungan, pengguna zat pewarna industri
membentuk Indeks Warna (Society of Dyers and Colourists 1999). Pewarna diberi
nomor kode unik - Indeks Warna, atau CI, angka - dan nama kode. Jadi eosins G,
WG, dan Y diidentifikasi sebagai pewarna tunggal, CI 45380, Asam Merah 87,
sedangkan eosin B adalah pewarna yang berbeda secara kimia, CI 45400, Asam
Merah 91.
                            Pewarna yang disintesis untuk pewarnaan biologis diberi nama
sama istimewa. Contoh tradisional adalah aldehyde fuchsin dari Gomori , dan
yang terbaru YOYO-1. Karena produk-produk ini tidak memiliki makna industri,
sebagian besar tidak memiliki entri Indeks Warna. Dalam kasus-kasus seperti itu,
orang yang bingung harus membaca Biologi Noda Conn (lihat Lillie 1977 dan
Horobin & Kiernan 2002 untuk edisi ke-9 dan ke-10).
                            Berbagai istilah yang digunakan untuk mengklasifikasikan zat
warna diberikan pada Tabel 9.2, dan komentar tentang poin-poin terkadang
membingungkan dalam literatur histokimia berikut ini. Pewarna asam dan basa
bukan asam dan basa tetapi garam, yang spesies warnanya anionik dan kationik.
Pewarna netral bukan non-ionik, tetapi garam di mana anion dan kation adalah
pewarna. Noda vital, digunakan untuk menodai sel-sel hidup, saat ini sering
disebut probe fluorescent atau biosensor. Catat akhirnya bahwa semua pewarna
dapat diberikan beberapa deskriptor. Dengan demikian alcian blue 8G adalah
pewarna dasar sintetis, secara struktural kompleks logam, meskipun tidak
mengandung pewarna pedas, dari tembaga dengan phthalocyanine , digantikan
oleh kelompok thioguanidinium , dan secara rutin digunakan sebagai pewarna
musin .
Penghindaran masalah dan pemecahan masalah
Menghindari masalah dan mengenali dan memperbaiki kesalahan adalah masalah
laboratorium yang abadi. Strategi khas digambarkan di bawah ini, dan informasi
terperinci untuk beberapa lusin pewarnaan histopatologi rutin dan khusus telah
dikumpulkan dalam bentuk monograf ( Horobin & Bancroft 1998).
Strategi untuk menghindari masalah - untuk meminimalkan kebutuhan
untuk pemecahan masalah
Masalah tentang prosedur pewarnaan
 Noda yang digunakan harus kompatibel dengan media fiksatif dan
sematan. Contoh kasus: bagian resin yang larut dalam air tidak
memungkinkan pewarnaan serat elastis selektif dengan fuchsin aldehida .
  Gunakan protokol pewarnaan yang rutin, lebih disukai yang
terstandarisasi. Tip: lihat daftar protokol tersebut di belakang Horobin dan
Bancroft (1998).
 Gunakan kontrol untuk mendeteksi masalah secara proaktif, bukan hanya
untuk menyelidiki kesalahan secara retrospektif. Kiat: simpan sampel
kumpulan noda yang efektif untuk digunakan saat Anda mencurigai
kemurnian noda yang tidak memadai.
 Pertimbangkan apakah Anda memiliki keterampilan dan pengetahuan
yang diperlukan atau, jika tidak, apakah seorang mentor tersedia? Tip:
banyak noda perak yang rumit; mengharapkan masalah dengan
penggunaannya .
 Dan selalu ada masalah lain! Contoh kasus: hilangnya bagian-bagian dari
slide dalam metode perak Grocott hexamine untuk jamur, karena terlalu
panas; dan endapan hitam pada slide dan bagian dalam prosedur Von Kossa ,
karena peralatan gelas yang terkontaminasi.
              Setelah kesalahan telah diketahui, dan penyebab yang masuk akal
diidentifikasi, solusi dapat dicari. Ini terkadang sederhana. Mungkin situasi paling
sulit muncul ketika pewarnaan spesimen disiapkan di laboratorium lain. Sekali
lagi berbagai saran pemecahan masalah praktis , untuk berbagai noda
histopatologi rutin dan khusus, diberikan dalam Horobin dan Bancroft (1998).
Masalah tentang pewarnaan reagen
 Dapatkan pewarna dan pereaksi yang andal. Kiat: gunakan pewarna
bersertifikat Komisi Biologis, karena pewarna tersebut rata-rata lebih tidak
murni sementara tidak lebih mahal.
 Pastikan noda tetap andal. Tip: simpan reagen Schiff dalam wadah kedap
gas; simpan larutan pewarna dalam wadah kedap cahaya.
Isyarat untuk mengenali kesalahan - sebelum kesalahan dapat diperbaiki,
mereka harus diperhatikan
• Solusi pewarnaan atau pewarnaan tidak seperti yang diharapkan dalam hal
warna, kelarutan, atau stabilitas. Contoh kasus: beberapa sampel biru alcian larut,
tetapi kemudian mengendap dari larutan dalam waktu satu jam atau kurang.
• Struktur yang diharapkan ternoda, tetapi hanya lemah. Contoh kasus: pewarnaan
kalsium yang tak terduga oleh alizarin red S hasil dari ekstraksi ion kalsium
jaringan menjadi fiksatif berair.
• Warna pewarnaan tidak terduga. Contoh kasus: pewarnaan berlebihan merah
terlihat dengan Gomori ini trichrome mungkin timbul dari solusi pewarnaan
kurang asam.
• Noda struktur yang tidak terduga. Contoh kasus: bahan granular yang diwarnai
oleh prosedur inti Feulgen mungkin merupakan endapan karbonat.
• Sifat pewarnaan tidak biasa. Contoh kasus: jika pewarnaan diferensial dari
organisme Gram positif dan negatif buruk, sediaan mungkin terlalu tebal.
Referensi
              Baker, JR, 1958. Prinsip-prinsip teknik mikro biologis . Methuen,
London.
 
              Bennion , PJ, Horobin , RW, 1974. Beberapa efek garam terhadap
pewarnaan: penggunaan keseimbangan Donnan untuk menggambarkan
pewarnaan bagian jaringan dengan asam dan pewarna dasar. Histokimia 39, 71-
82.
 
              Bettinger , CH, Zimmermann, HW, 1991. Investigasi baru pada
kompleks hematoxylin , hematein , dan hematein-aluminium . 2. Kompleks
hemateinaluminium dan pewarnaan hemalum . Histokimia 96, 215-228.
 
Boon, ME, Drijver , JA, 1986. Teknik pewarnaan sitologi rutin: latar belakang
teoritis dan praktik . Macmillan, London.
 
Celis , JF (Ed.), 2006. Biologi sel: buku pegangan laboratorium, vol 1, ed ketiga.
Elsevier, Amsterdam.
 
Chayen , J., Bitensky , L., 1991. Histokimia praktis , edisi kedua. Wiley,
Chichester . Goldstein, DJ, 1962. Korelasi ukuran partikel pewarna dan kerapatan
substrat, dengan referensi khusus untuk pewarnaan musin . Teknologi Noda 37,
79–93. Goldstein, DJ, Horobin , RW, 1974a. Nilai faktor pewarnaan dengan biru
alcian . Histokimia Journal 6, 157-174
 
Bacaan lebih lanjut
                            Beberapa catatan pewarnaan histologi mempertimbangkan
kesatuan fisikokimia yang mendasari keanekaragaman teknis dari berbagai
teknologi pewarnaan. Ada banyak protokol yang diterbitkan tetapi kekurangan
tinjauan kritis dan penjumlahan. Jadi teks ensiklopedis seperti yang ada sekarang
dan contoh sebelumnya seperti itu
dari Lillie (1965), Pearse (1968), dan Sheehan dan Hrapchak (1987) merangkum
sejumlah besar informasi dan menyediakan bibliografi yang luas. Beberapa
manual pewarnaan juga ditetapkan untuk mengintegrasikan latar belakang teoritis
dengan informasi prosedural, misalnya Chayen dan Bitensky (1991) dan Kiernan
(2007). Beberapa penulis telah berupaya memberikan akun fisikokimia modern
tentang metode pewarnaan secara keseluruhan; misalnya Horobin (1982, 1988),
Horobin dan Bancroft (1998), Lyon (1991), dan Prentø (2009). Beberapa karya
klasik juga dapat direkomendasikan: baca Baker (1958) untuk akun integratif
awalnya dan bahasa Inggrisnya yang elegan; bacalah Lillie (1965) untuk
pengalaman pribadinya yang sulit dimenangkan dan pandangan sejarah yang
panjang; dan kemudian membaca Mann (1902) menjadi heran mengapa kami
membutuhkan waktu lama untuk menindaklanjuti penyelidikan eksperimentalnya.
Akhirnya, mereka yang ingin belajar lebih banyak tentang zat warna memiliki
beberapa teks modern yang tersedia. Buku yang ditulis oleh Zollinger (2003),
secara tidak biasa, memasukkan bagian yang secara eksplisit mempertimbangkan
pewarnaan dan pewarnaan biologis.
 

Original English text:

In addition to biochemistry, chemistry and immunochemistry, such staining
methods are also influenced by selective uptake of reagents into tissues, and
selective losses of products and/or reagents from the tissues.
Contribute a better translation