Menghitung Jumlah Mikroba

Pentingnya penentuan jumlah mikroba dalam suatu bahan atau produk pangan adalah
untuk mengetahui keberadaan mikroba yang dapat bersifat menguntungkan atau juga
merugikan bagi manusia yang mengkonsumsinya. Apabila mikroba yang ada adalah mikroba
patogen maka jumlahnya harus dikurangi.

Metode Perhitungan Jumlah Mikroba

1. Perhitungan Bakteri secara Langsung
- Perhitungan yang menghitung jumlah total sel (sel mati dan hidup) yang ada
pada sampel.
- Keuntungan : pelaksanaannya cepat dan tidak memerlukan banyak peralatan.
- Kelemahan : sel-sel mikroba yang telah mati tidak dapat dibedakan dari sel
yang hidup. Karena itu keduanya akan terhitung atau hasil yang diperoleh
ialah jumlah total sel yang ada di dalam populasi.
- Metode yang digunakan adalah
 Filter Membran
- Suspensi bahan disaring sejumlah volume tertentu kemudian
disaring dengan filter membran yang telah steril.
- Menghitung jumlah sel rata-rata tiap kesatuan luas pada filter
membran dapat dihitung pula jumlah sel dari volume suspensi
yang disaring.

 Metode Petroff-Hauser
- Alat yang digunakan adalah Petroff-Hauser Chamber atau
Haemocytometer.
- Haemocytometer adalah metode perhitungan secara mikroskopis.
Haemocytometer berupa slide kaca tebal berbentuk empat persegi
panjang.
- Ruang hitung terdiri dari 9 kotak besar dengan luas 1 mm². Satu
kotak besar di tengah, dibagi menjadi 25 kotak sedang dengan
panjang 0,05 mm. Satu kotak sedang dibagi lagi menjadi 16 kotak
kecil. Dengan demikian satu kotak besar tersebut berisi 400 kotak
kecil. Tebal dari ruang hitung ini adalah 0,1 mm.
- Sel bakteri yang tersuspensi akan memenuhi volume ruang hitung
tersebut sehingga jumlah bakteri per satuan volume dapat
diketahui.
- Haemocytometer adalah suatu alat yang dapat digunakan untuk
melakukan perhitungan sel secara cepat dan dapat digunakan untuk
konsentrasi sel yang rendah.
- Jenis – jenis Haemocytmeter :
a. Neubauer
- Luas keseluruhan dari area Neubauer adalah 9 mm2 dengan
kedalaman 0,1 mm.
 - memiliki 9 kotak utama dengan masing-masing luasan 1
mm2.
- Kotak utama berada di tengah digunakan untuk perhitungan
dibagi menjadi 16 kotak besar dan setiap kotak besar
tersebut dibagi lagi menjadi 16 kotak kecil dengan ukuran
0,05 mm x 0,05 mm.

b. Neubauer improved
- Memiliki luas dan kedalaman yang sama seperti jenis
Neubauer.
- Perbedaannya terletak pada kotak utama yang dibagi
menjadi 25 kotak besar dan setiap kotak besar dibagi lagi
menjadi 16 kotak kecil.

c. Neubauer improved bright-line

- Memiliki spesifikasi yang sama seperti Neubauer
improved.
- Perbedaannya terletak pada saat Haemocytometeri ini
diamati dengan menggunakan mikroskop. Pada jenis
bright-line akan tampak area perhitungan yang gelap,
sangat tipis dan semi transparan (terlapisi oleh rhodium)
sedangkan garis pembatas akan tampak menyala.
- Kelebihan : kontras yang mencolok akan mempermudah
dalam hal penghitungan jumlah mikroba sehingga akan
meningkatkan keakuratan.
- Kekurangan : sensitif dalam hal pembersihan dan
perawatan alat. Lapisan rhodium mudah terhapus pada saat
pembersihan sehingga perlu kehati-hatian dalam
penggunaan.
d. Buerker
- Luas area 9,3 mm2 dengan kedalaman 0,1 mm.
- Terdiri dari 9 kotak utama dengan luasan masing-masing 1
mm2. Kotak utama terbagi menjadi 16 kotak besar dan
setiap kotak dibagi lagi menjadi 16 kotak kecil dengan
ukuran 0,05 mm x 0,05 mm.

e. Tuerk
- Luas keseluruhan dari area Tuerk adalah 9 mm 2 dengan
kedalaman 0,1 mm.
- Memiliki 9 kotak utama dengan masing-masing luasan 1
mm2. Kotak utama yang berada di bagian tengah dibagi
menjadi 25 kotak besar dan setiap kotak besar dibagi
menjadi 16 kotak kecil dengan ukuran 0,05 mm x 0,05 mm.
- Jika dilihat dari pembagian kotak maka jenis ini hampir
sama dengan jenis Neubauer improved, yang membedakan
adalah adanya garis ganda yang membatasi semua kotak
besar yang berada dalam area perhitungan.

f. Thoma
- Luas keseluruhan dari area Thoma adalah 1,21 mm2 dengan
kedalaman 0,1 mm.
- Hanya terdiri dari satu kotak utama di bagian tengah. Kotak
utama ini dibagi menjadi 16 kotak kecil dengan ukuran
0,05 mm x 0,05 mm. Bagian atas, bawah, kanan dan kiri
kotak utama hanya berupa garis lanjutan kotak utama.
g. Thoma neu
- Berdasarkan spesifikasi dan ukuran dari kotak pengamatan,
sama dengan jenis Thoma.
- Perbedaannya ada pada tidak adanya garis bertumpuk tiga
yang menjadi pembatas kotak besar pada kotak utama.

h. Nagotte
- Luas keseluruhan dari area Nagotte adalah 100 mm2
dengan kedalaman 0,5 mm. Kedalamannya dapat
disesuaikan menjadi 0,25 mm atau 1 mm sesuai keinginan
pada saat lempengan akan dicetak.
- Memiliki 40 area berbentuk persegi panjang dengan
masing-masing luasan 10 mm x 0,25 mm. Pada bagian
tengah area perhitungan ditandai dengan adanya garis
ganda.

i. Fuchs-rosenthal
- Luas keseluruhan dari area Fuchs-rosenthal adalah 16 mm2
dengan kedalaman 0,2 mm.
- Memiliki 16 kotak besar dengan masing-masing luasan 1
mm2 yang dibagi lagi menjadi 16 kotak kecil dengan
ukuran 0,25 mm x 0,25 mm. Antar kotak besar dibatasi
oleh garis tebal sedangkan batas pada kotak kecil berupa
garis tipis.

-
 - Terdapat dua metode sederhana untuk menghitung jumlah sel
menggunakan Haemocytometer. Pemilihan metode ini bergantung
pada konsentrasi sel mikroba sedangkan keakuratan prosedur
bergantung pada jumlah sel yang terhitung.

A B
 Pada metode hitung A, yang dihitung jumlah selnya
pada empat kotak luar. Konsentrasi sel dihitung sebagai:
Konsentrasi sel (per mL) = total sel terhitung dalam 4
kotak x 25000 x faktor pengenceran
 Pada metode hitung B, jumlah sel diperkirakan dengan
menghitung lima kotak dalam kotak besar yang ada di
pertengahan. Konsentrasi sel dihitung sebagai:
Konsentrasi sel (per mL) = total sel terhitung dalam 5
kotak x 50000 x faktor pengenceran
- Kelebihan : data dapat diperoleh dengan cepat sehingga tidak
perlu menunggu lama dan hemat biaya, morfologi sel dapat
diamati, dapat mengevaluasi homogenitas dan dapat mendeteksi
kontaminasi.
- Kekurangan : menghitung jumlah sel yang hidup maupun yang
mati karena perhitungannya dilakukan secara keseluruhan.

2. Perhitungan secara Tidak Langsung

- Untuk menentukan jumlah mikroba keseluruhan baik yang hidup maupun yang
mati atau hanya untuk menentukan jumlah mikroba yang hidup saja tergantung
pada cara yang dipergunakan.
Metode hitungan cawan (Total Plate Count) atau Angka Lempeng
Total

- Prinsipnya adalah menumbuhkan sel mikroba yang masih hidup

pada media agar.
- Teknik pengitungan ini membutuhkan kemampuan melakukan
pengenceran dan mencawankan hasil pengenceran. Cawan-cawan
tersebut kemudian diinkubasi dan kemudian dihitung jumlah
koloni yang terbentuk.
- Ada dua metode yang umum digunakan dalam plate count, yaitu
a. Spread-Plate Method
- Volumenya biasanya 0,1 ml atau kurang dari
keseluruhan kultur yang di encerkan.
- Kelebihan : perhitungan mudah dilakukan karena
koloni yang dihitung pasti tumbuh di permukaan
(aerob).
- Kekurangan : volume yang digunakan tidak boleh
lebih dari 0,1 ml karena dapat menyebabkan spreader,
sehingga perhitungan sulit dilakukan.

b. Pour-Plate Method
- Volume yang biasa digunakan adalah 0,1 – 1 ml dari
kultur untuk di letakkan pada cawan Petri. Kemudian,
cawannya diinkubasikan hingga koloni muncul.
- Kelebihan : volume sampel dapat mencapai 1 ml.
- Kekurangan : organisme yang akan dihitung
jumlahnya harus kuat menghadapai suhu dari agar,
pengamatan perhitungan juga harus diamati dengan
baik-baik, sebab koloninya dapat tumbuh didalam
medium juga (aerob dan anaerob).
- Keuntungan : dapat mengetahui jumlah mikroorganisme
yang dominan dan dapat diketahui adanya mikroorganisme
jenis lain yang terdapat dalam contoh.
- Kelemahan :
 Kemungkinan terjadinya koloni yang berasal lebih
dari satu sel mikroorganisme, seperti pada
mikroorganisme yang berpasangan, rantai atau
kelompok sel. Kemungkinan ini akan memperkecil
jumlah sel mikroorganisme yang sebenarnya.
 Kemungkinan adanya jenis mikroorganisme yang
tidak dapat tumbuh karena penggunaan jenis media
agar, suhu, pH, atau kandungan oksigen selama
masa inkubasi.
 Kemungkinan ada jenis mikroorganisme tertentu
yang tumbuh menyebar di seluruh permukaan
media agar sehingga menghalangi mikroorganisme
lain. Hal ini akan mengakibatkan mikroorganisme
lain tersebut tidak terhitung.
  Penghitungan dilakukan pada media agar yang
jumlah populasi mikroorganismenya antara 30 –
300 koloni. Bila jumlah populasi kurang dari 30
koloni akan menghasilkan penghitungan yang
kurang teliti secara statistik, namun bila lebih dari
300 koloni akan menghasilkan hal yang sama
karena terjadi persaingan diantara koloni.
 Penghitungan populasi mikroorganisme dapat
dilakukan setelah masa inkubasi yang umumnya
membutuhkan waktu 24 jam atau lebih.

Most Probable Number (MPN)

- Untuk menghitung jumlah bakteri patogenik dalam jumlah sedikit
yang terdapat dalam bahan pangan.
- Metode ini berdasarkan atas pengenceran.
- Asumsi yang diterapkan dalam metode MPN adalah :
a. Bakteri terdistribusi sempurna dalam sampel
b. Sel bakteri terpisah-pisah secara individual, tidak dalam bentuk
rantai atau kumpulan (bakteri coliform termasuk E. coli
terpisah sempurna tiap selnya dan tidak membentuk rantai).
c. Media yang dipilih telah sesuai untuk pertumbuhan bakteri
target dalam suhu dan waktu inkubasi tertentu sehingga
minimal satu sel hidup mampu menghasilkan tabung positif
selama masa inkubasi tersebut.
d. Jumlah yang didapatkan menggambarkan bakteri yang hidup
(viable) saja. Sel yang terluka dan tidak mampu menghasilkan
tabung positif tidak akan terdeteksi.

 Turbidimetri
- Metode yang cepat untuk menghitung jumlah bakteri dalam suatu
larutan menggunakan spektrofotometer.
- Bakteri menyerap cahaya sebanding dengan volume total sel
(ditentukan oleh ukuran dan jumlah).
- Sel bakteri dihitung dengan panjang gelombang 600 nm dan nilai
absorbansi yang muncul kemudian dikonversi untuk mendapatkan
nilai densitas sel bakteri dalam kultur.
- Pengukuran kekeruhan metode turbidimetri dapat juga
menggunakan fotokorimetri.
- Prinsip kerja dari fotokorimeter yaitu sumber cahaya dalam alat
tersebut memancarkan seberkas cahaya putih melalui dua buah
lensa dan celah masuk kesuatu kisi difraksi yang pada gilirannya
menyebarkan cahaya menjadi berkas-berkas horizontal dengan
semua spectrum warna.