Kultur
Kultur
Sujaya
PENUNTUN PRAKTIKUM
MIKROBIOLOGI
Aspergillus niger
Oleh
I Nengah Sujaya
Untuk Kalangan Internal
Program Studi Ilmu Kesehatan Masyarakat
Universitas Udayana
2017
KATA PENGANTAR
Puji syukur penulis panjatkan ke hadapan Tuhan Yang Maha Esa, Ida Sang Hyang Widi
Waca, karena hanya atas rachmat-Nya lah, Penuntun Praktikum Mikrobiologi ini bisa
diselesaikan. Penuntun Praktikum Mikrobiologi ini disusun dengan tujuan memberikan
bahan acuan kepada mahasiswa Program Studi Ilmu Kesehatan Masyarakat (PS IKM),
Universitas Udayana, tentang pengetahuan dasar dalam praktek mikrobiologi umum.
Disamping langkah dasar dalam mikrobiologi yang harus dikuasai oleh mahasiswa,
buku ini juga memberikan gambaran sekilas tentang teknik dasar biologi molekuler yang
menyebabkan revolusi dibidang ilmu mikrobiologi dan belakangan menjadi teknik yang
paling terpercaya dalam pengelompokan/klasifikasi organisme hidup di alam semesta ini.
Akhirnya dengan segala kerendahan hati penyusun menyampaikan ucapan
terimaksih yang sedalam dalamnya kepada pihak pimpinan PS IKM Unud, teman teman
sejawat staf pengajar di PS IKM Unud, serta mahasiswa yang banyak memberikan
bantuan dan dorongan sehingga Penuntun Praktikum initersusun dengan harapan buku
kecil ini bisa bermanfaat. Penyusun menyadari bahwa buku ini masih sangat jauh dari
sempurna dan oleh karena itu segala saran dan bimbingan dari pembaca sangat
diharapkan untuk penyempurnaan edisi berikutnya.
PETUNJUK UMUM
PETUNJUK UMUM
Filter udara
Burner
PRAKTIKUM
PENYIAPAN DAN PEMBUATAN MEDIUM 1
1.1 Fungsi Media
Media merupakan substrat yang diperlukan untuk menumbuhkan dan mengembang-
biakkan mikroorganisme. Sebelum dipakai dalam percobaan, media ini perlu disterilkan
terlebih dahulu, supaya tidak ditumbuhi oleh mikroorganisme yang tidak dikehendaki
(kontaminan). Agar mikroba yang kita kultur dapat tumbuh dengan baik, maka persyarat-
an yang harus dipenuhi oleh suatu media adalah :
a. Didalamnya harus terkandung bahan-bahan yang diperlukan oleh mikroba yang akan
ditumbuhkan. Bahan-bahan ini meliputi unsur-unsur makro, unsur mikro, dan trace
elemen serta zat pengatur tumbuh.
b. Media tersebut harus mempunyai tekanan osmosis, tegangan permukaan, dan pH yang
sesuai dengan kebutuhan mikroba yang akan dikultur.
c. Media harus dalam keadaan steril sebelum dipakai untuk menumbuhkan mikroba yang
diperlukan.
a. Media umum: Media yang digunakan untuk menumbuhkan satu atau lebih kelompok
mikroba secara umum. Contoh : Nutrient Agar (media untuk menumbuhkan kelompok
bakteri, Potato Dextrose Agar (media yang dipakai untuk menumbuhkan kelompok
jamur, dll.
b. Media pengaya: Media yang dipakai untuk menyuburkan mikroba tertentu sebelum
ditumbuhkan pada media yang dipakai dalam penelitian. Contoh: Selenit Broth (untuk
menyuburkan pertumbuhan bakteri Salmonella.
c. Media selektif: Media yang dipakai untuk menumbuhkan species tertentu dari
mikroba, dengan menghambat pertumbuhan species lain yang tidak dikehendaki.
Contoh: Media SS Agar(Salmonella dan Shigella Agar) untuk bakteri Salmonella dan
Shigella.
d. Media penghitungan : Media yang dipakai untuk menghitung jumlah mikroba suatu
bahan. Media ini dapat berupa media media umum dan media selektif.
d. Sterilkan dengan autoclave pada suhu 121 oC pada tekanan 15 lbs selama 15 menit.
e. Simpan pada tempat yang sejuk dan kering (dalam kulkas).
f. Prosedur yang sama dikerjakan untuk membuat double strength lactose broth, tapi
konsentrasinya dilipat duakan.
g.
1.3.3. Pembuatan medium BGBB (Brilliant Green Bile 2 % Broth)
Untuk membuat satu liter medium ini, lakukan prosedur berikut ini :
a. Timbang sebanyak gram medium instant.
b. Suspensikan dalam akuadest dan volume akhir dibuat menjadi 1000 ml.
c. Masukkan ke dalam tabung reaksi kecil yang telah dilengkapi dengan tabung Durham.
d. Sterilkan dengan autoclave pada temperatur 121 oC pada tekanan 15 lbs, selama 15
menit.
e. Simpan di tempat yang sejuk dan kering.
Media umumnya dibuat dalam bentuk media agar (agar plate) yang mana media
dituangkan dalam cawan petri, media agar miring/agar tegak yang disiapkan dalam
tabung reaksi umunya digunakan untuk menyimpan kultur. Kultur aerob biasanya
disimpan dalam agar miring, semantara kultur anaerob umumnya disimpan dalam agar
tusuk (stab) pada media tegak.
B. Agar tegak C. Agar miring
A. Media agar
Gambar 1-1. Menyiapkan media agar yang telah disterilkan di tuang ke dalam cawan petri. (A).
Perhatikan bahwa mulut erlenmeyer harus dibakar pada api bunsen terlebih dahulu. Pada media
tegak dan miring, tutup kapas harus dibuat dalam keadaan padat dan ketat sehingga tidak mudah
lepas.
PRAKTIKUM
MORFOLOGI SEL BAKTERI 2
2.1. Pendahuluan.
Walaupun ada ratusan species bakteria yang berbeda, namun suatu bakteria dalam bentuk
sel tunggal akan memiliki salah satu dari tiga bentuk yang umum dikenal, yaitu:
a. Bentuk bulat/elips/spherical shape yang lazim disebut dengan coccus.
b. Bentuk batang yang umum disebut basil.
c. Bentuk spiral.
Bakteri berbentuk bulat atau coccus, sering menunjukkan variasi bentuk. Variasi bentuk
ini sering dipakai sebagai ciri yang khas dalam proses identifikasi jenis. Beberapa variasi
bentuk tersebut antara lain:
a. Diplococcus: Dua buah sel saling bedempetan atau berpasangan.
b. Streptococcus: Untaian sel yang lebih dari 4 sel dan membentuk suatu untaian yang
menyerupai rantai.
c. Tetrad atau tetracoccus: Empat buah sel yang saling berdempetan yang membentuk
suatu bentuk yang menyerupai bujur sangkar.
d. Staphylococcus: Kumpulan sel yang saling bedempetan, sehingga menyerupai buah
anggur.
e. Sarcina: Kelompok yang terdiri atas 8 sel (4 sel pada bagian depan dan 4 sel pada
bagian belakang) yang membentuk suatu bentuk yang menyerupai kubus.
Berbeda dengan bakteri bentuk bulat, bakteri bentuk batang (basil) jarang sekali
berada dalam variasi diatas. Pada bakteri bentuk batang ini, variasi diatas (jarang)
bukan merupakan karakteristik dari bakteri ini. Bila dialam dijumpai adanya variasi
bentuk dari bakteri basil ini, maka hal tersebut cenderung disebabkan oleh tahap
pertumbuhannya atau kondisi-kondisi yang mempengaruhi kultur tersebut.
Bakteri berbentuk spiral pada umumnya dijumpai dalam bentuk soliter atau bersel
tunggal dan bukan merupakan kumpulan sel yang berdempetan.
Dalam praktikum ini saudara akan diperkenalkan beberapa species bakteri yang
mewakili bentuk bentuk diatas. Disamping itu juga akan diperkenalkan beberapa struktur
luar dan struktur dalam bakteri, seperti flagella, capsula, dan endospora, sebagai
pelengkap morfologi bakteri tersebut.
Gambar 2-1 A. Kocok kultur cair dan ambil satu Gambar 2-1B. Sebarkan di atas glas objek dan
mata loop yang sebelumnya dipanaskan di atas lakukan pengamatan di bawah mikroskop
api
PRAKTIKUM
STERILISASI 3
3.1. Pendahuluan
Sterilisasi merupakan suatu proses membebaskan peralatan atau bahan dari
mikroorganisme yang tidak dikehendaki. Untuk mencapai tujuan ini, ada beberapa
macam sterilisasi yang dapat dipilih dan disesuaikan dengan sifat bahan yang akan
disterilkan. Cara-cara yang umum dilakukan adalah:
a. Sterilisasi secara fisik : sterilisasi dengan menggunakan pemanasan, penggunaan sinar
UV, sinar X dan sinar-sinar yang panjang gelombangnya pendek.
b. Sterilisasi secara kimia : sterilisasi dengan menggunakan bahan-bahan kimia, seperti
alkohol, desinfektan, larutan formalin, dll.
c. Sterilisasi mekanik : sterilisasi dengan menggunakan filter atau saringan.
d. Panaskan autoclave ini dan biarkan semua udara yang ada di dalamnya keluar (yang
ditandai dengan keluarnya tetes-tetes air melalui lkep udara.
e. Tutup klep udara bila semua udara dalam autoclave sudah keluar.
f. Pemanasan dilanjutkan sampai mencapai suhu 121 oC dan tekanan 15 lbs, selama 15
menit.
g. Pemanasan dihentikan, suhu dikembalikan ke suhu kamar dan tekanan pada titik 0.
h. JANGAN PERNAH MENCOBA UNTUK MEMBUKA AUTOCLAVE SEBELUM
JARUM PENUNJUK TEKANAN MENUNJUKAN PADA ANGKA 0 (NOL),
KARENA SANGAT BERBAHAYA!!!!!!!.
Klep pengunci
A. Sterilisasi dengan UV
Alat dan bahan
a. Cawan petri
b. Medium Agar tegak.
c. Lampu UV
d. Lampu Bunsen
Cara kerja
a. Cairkan 3 tabung medium Agar tegak dalam penangas air.
b. Tuangkan ke dalam 3 cawan petri steril dan biarkan membeku.
c. Sinari cawan petri pertama dengan UV selama 1 menit, cawan kedua selama 3 menit,
dan cawan ketiga tidak disinari (dalam keadaan terbuka).
d. Inkubasi cawan petri selama 24 - 48 jam pada suhu 37 oC, dalam keadaan terbalik.
e. Amati pertumbuhan mikroba pada ketiga cawan petri tersebut.
f. Pinset
Cara kerja
a. Cairkan medium NA dalam penangas air dan tuangkan kedalam cawan petri. Biarkan
membeku pada suku kamar.
b. Rendam jarum pentul atau paku dalam larutan alkohol diatas selama 10 menit.
c. Cuci jarum pentul dengan air steril dan letakkan pada permukaan medium dalam
cawan petri.
d. Inkubasi pada suhu 28 - 30 oC selama 24-48 jam.
e. Bandingkan pertumbuhan mikroba pada sekitar jarum pentul. Larutan mana yang
paling efektif.
f. Lakukan hal yang sama dengan menggunakan formalin 4 %, lisol dan karbol.
Cara kerja
a. Cairkan 2 tabung medium NA tegak dalam penangas air dan tuangkan ke dalam dua
cawan petri steril
b. Apuskan jari tangan saudara yang belum dicuci pada permukaan medium pada cawan
petri pertama.
c. Cuci jari tangan saudara dengan sabun merk tertentu sebersih mungkin dan biarkan
kering dengan sendirinya (jangan di keringkan dengan lap). Setelah kering, apuskan
jari saudara pada permukaan medium dalam cawan petri kedua.
d. Inkubasi kedua cawan petri tersebut selama 24-48 jam pada suhu 28-30 oC.
e. Bandingkan pertumbuhan mikroba pada kedua cawan petri tersebut.
Cara kerja
a. Cairkan medium NA dalam penangas air dan biarkan pada temperatur 40 oC.
b. Saringlah sejulah air yang sudah tercemar (air kali) dengan menggunakan membran
polisulfon.
c. Pipet sebanyak 1 ml. Air hasil saringan ini dan tempatkan ke dalam cawan petri
d. Sebagai kontrol, pipet 1 ml air yang belum disaring dan tempatkan pada cawan petri
kedua.
e. Tuangkan masing-masing satu tabung medium NA (suhu 40 oC) ke dalam masing-
masing cawan petri yang sudah berisi sampel air.
f. Goyang kedua cawan sedemikian rupa sehingga sampel menjadi homogen dengan
medium, dan biarkan membeku.
g. Inkubasi kedua cawan petri tersebut pada suhu 20-30 oC selama 24-48 jam.
h. Amati kedua cawan petri !!. Kesimpulan apa yang dapat anda ambil dari percobaan ini
?
PRAKTIKUM
ENUMERASI DAN ISOLASI 4
Perhitungan jumlah mikroba (enumerasi) yang terkandung di dalam sampel dapat
dilakukan dengan berbagai cara, antara lain: metode pengenceran, metoda perhitungan
langsung dalam ruang hitung (hemasitometer), Metode membran filter, metode berat
kering dan volume sel, metode MPN, dll. Pada praktikum ini, saudara akan belajar
menentukan jumlah sel yang terdapat dalam suatu sample dengan menggunakan metoda
pengenceran dan metoda penghitungan langsung dengan menggunakan alat
haemasitometer (Improved New Bauwer).
Cara kerja
a. Ambil sampel air secara aseptik dengan menggunakan botol steril.
b. Cairkan medium NA dalam penangas air dan dinginkan sampai suhu 45oC.
Kalau menggunakan cara sebar, Media Agar siap pakai sudah disiapkan di dalam
cawan petri.
c. Tandai 6 cawan petri dengan 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 ,10-6.
d. Kocok sampel air sampai homogen dan ambil secara aseptik sebanyak 1 ml, kemudian
dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang telah berisi 9 ml air steril untuk mendapatkan
faktor pengenceran sebesar 10 kali (10-1).
e. Kocok tabung reaksi ini dengan baik, dan ambil air di dalamnya secara aseptik
sebanyak 1 ml, dan masukkan ke dalam cawan petri yang bertanda 10-1. Dari tabung
ini juga, ambil sebanyak 1 ml sampel dan masukkan ke dalam tabung reaksi kedua
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi
17
Oleh: I N. Sujaya
yang telah berisi 9 ml air steril untuk memperoleh faktor pengenceran sebesar 100 kali
(10-2).
f. Masukkan sebanyak 0,1 ml bertanda 10-2 ke dalam media agar, lalu sebar dipermukaan
Media Agar dengan mempergunakan gelas kaca bengkok. Celupkan gelas kaca
bengkok ke dalam alkohol 70%, bakar di atas api, dan dinginkan sebelum dilakukan
penyebaran.
g. Lakukan lamgkah (f) pada pengenceran yang lainnya.
h. Untuk menghitung total mikroba dalam sampel lainnya, prosedur yang dipakai persis
sama dengan diatas, tetapi banyaknya sample yang harus ditimbang adalah 1 gram
sample padat atau 1 ml sample cair (Perhatikan lampiran !!!!).
i. Inkubasi semua cawan yang telah ditanami dengan sample yang berisi mikroba pada
temperature 37 oC selama 24 jam.
j. Lakukan penghitungan koloni yang tumbuh pada semua cawan Petri yang jumlah
koloninya berkisar antara 30 – 300 koloni.
k. Jumlah sel mikroba yang terdapat pada sample dihitung dengan cara mengalikan
jumlah koloni yang tumbuh pada medium dengan factor pengenceran.
Metode pengencera
1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
Contoh 9 ml 9 ml 9 ml 9 ml
bahan cair (10-1) (10-2) (10-3) (10-4)
PRAKTIKUM
BIAKAN MURNI 5
5.1. Pendahuluan
Untuk memepelajari karakteristik mikrooragnisme, langkah awal yang harus dilakukan
adalah mengisolasi mikrooragnisme dari sumbernya. Salah satu cara mengisolasi
mikroorganisme dari campuran mikroorganisme adalahd neagn teknik penggoresan
(streak plate techniques) (Gamba 4.1.). Atau mikrooragnisme bisa pula diisolasi dari
media agar yang sudah disebar setelah melakukan penghitungan jumlah mikroorganisme
menggunakan agar tuang. Dalam melakukan isolasi, diperlukan suatu teknik aseptik
sehingga mikrooragnisme yang kita dapatkna tidak tercemar (kontaminsa) olehg
mikroorganisme lainnya. Dan untuk langkah ini dfalam teknik dasar mikroobiologi
biasanya dilakukan dnegan pemurnian isolat dengan beberapa kali penggoresan yang
berulang (re-streaking) dengan cara yang sama seperti di bawah ini.
Cara kerja
a. Cairkan media NA tegak dalam penangas air dan tuangkan ke dalam cawan petri steril.
b. Setelah beku, pilihlah koloni-koloni yang tumbuh pada cawan hitung dalam
enumerasi, yang menurut saudara menarik. Lakukan “streak for single colony” pada
media steril dalam cawan petri yang telah beku.
c. Inkubasi selama 24 jam.
d. Isolasi koloni yang tumbuh dan tanam pada medium agar miring. Biakan ini akan
dipakai pada praktikum selanjutnya.
PRAKTIKUM
PEWARNAAN SEL BAKTERI 6
6.1. Pendahuluan
Pengenalan bentuk mikroba (morfologi), kecuali mikroalgae harus dilakukan pewarnaan
terlebih dahulu agar dapat diamati dengan jelas. Tujuan pewarnaan adalah:
1. Mempermudah pengamatan bentuk sel mikroorganisme (khususnya bakteri).
2. Memperjelas ukuran jasad
3. Dapat mengamati struktur luar dan struktur dalam dari sel mikroba.
4. Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan, sehingga sifat fisik, kimia dari
jasad dapat diketahui. Dengan demikian, kita dapat menggunakan pewarnaan sebagai
salah satu cara untuk klasifikasi bakteria. Berhasil atau tidaknya pewarnaan sangat
ditentukan oleh waktu pemberian warna dan umur biakan yang diwarnai (Umur biakan
yang baik adalah 24 jam).
Cara kerja.
a. Letakkan sebuah kaca objek yang bebas lemak diatas meja kerja.
b. Teteskan setetes air ditengah-tengah kaca objek tersebut.
c. Dengan menggunakan jarum Ose yang telah dipijarkan, ambil sedikit biakan bakteri
yang saudara isolasi pada praktikum sebelumnya atau dari biakan murni bakteri yang
disediakan oleh asisten saudara.
d. Buat apusan bakteri pada air yang diletakkan pada kaca objek dengan cara menggesek-
gesekan jarum ose yang berisi biakan bakteri, sehingga didapatkan suatu campuran
yang tipis dan merata.
e. Fiksasi diatas api bunsen dengan jarak sekitar 30 Cm. Dari nyala api. Dalam
memfiksasi ini jangan terlalu panas karena dapat merusak bentuk sel.
f. Teteskan salah satu larutan pewarna yang disediakan oleh asisten pada sediaan yang
telah difiksasi. Pewarna Metilene blu akan mewarnai sel dalam 30 - 60 detik, Kristak
violet dalam 10 detik, dan Karbol fuhsin dalam 5 detik.
g. Cuci dengan air mengalir.
h. Keringkan sediaan dengan meletakkannya diantara kertas saring.
i. Amati dengan mikroskop dengan menggunakan lensa objektive dengan perbesaran 100
kali, dan minyak imersi.
j. Catat dan gambar bentuk sel dan warna sel mikroorganisme yang saudara lihat.
Pertanyaan :
1. Apakah kultur yang saudara isolasi merupakan kultur murni, mengapa ?
2. Apa maksud memfiksasi sediaan ?.
Cara kerja
a. Teteskan sati tetes cairan nigosin atau tinta cina pada pinggir ujung kaca objek.
b. Dengan menggunakan jarum Ose yang telah dipijarkan, ambil sedikit biakan bakteri
dan suspensikan pada tetesan nigrosin pada permukaan kaca objek.
c. Ratakan suspensi bakteri dalam nigrosin pada permukaan kaca objek ini dengan
menggunakan kaca objek lain.
d. Biarkan kering pada suhu kamar, dan amati dengan mikroskop (perbesaran lensa
objektif 100 x), dan pakai minyak imersi.
e. Gambar bentuk bakteri yang saudara lihat.
Bakeri yang setelah diwarnai dengan pewarna dasar warnanya tidak terhapus oleh
alkohol akan berwarna violet karena terwarnai oleh kristal violet, dan tidak lagi menyerap
pewarna kontras. Kelompok bakteri yang mempunyai sifat ini dikelompokkan menjadi
bakteri Gram positif. Sedangkan, kelompok bakteri yang telah diwarnai dengan pewarna
dasar dan warnanya terhapus setelah diperlakukan dengan alkohol, akan menyerap
pewarna safranin atau karbol fuhsin yang dipakai sebagai pewarna kontras, sehingga
dalam preparat akan terlihat warna merah(warna safranin atau karbol fuhsin). Kelompok
bakteri yang demikian disebut dengan bakteri Gram negatif.
Cara kerja
a. Buat apusabn bakteri pada kaca objek kering dan bersih.
b. Fiksasi diatas nyala api bunsen atau di udara.
c. Warnai dengan larutan kristal violet selama 1 - 1,5 menit.
d. Cuci dengan air suling.
e. Tetesi dengan larutan garam iodin, dan biarkan selama 1 menit.
f. Cuci dengan larutan alkohol 95 % sampai warnanya terhapus, biasanya selama 0,5
menit (30 detik).
g. Cuci dengan air.
h. Warnai dengan safranin atau karbol fuhsin selama 2 menit.
i. Cuci dengan air, dan buang kelebihan air dengan menggunakan kertas hisap, tanpa
menggosok sediaan.
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi
24
Oleh: I N. Sujaya
Gambar 6-1. Zat warna umum yang digunakan dalam pewarnaan Gram
Langkah kerja
C
N-asetil muramat
N-asetil muramat
B
Gambar 6-A: Komponen dinding sel bakteri Gram positif;
(6-B): Gram negatif; 6-C: lapisan peptidoglikan
DAFTAR PUSTAKA
1. Madigan, M.T., Martinko, J.M., Parker, J. Brock Biology of Microorganisms. 10 th
Ed. Perason Education Inc. Upper Saddle River, New Jersey (2003).
2. Lay, D.W. Analisis Mikroba di Laboratorium. Penerbit Raja Grafindo Persada,
Jakarta (1994).
3. Seely, H.W.Jr., dan VanDemark, P.J. Microbes in cation. A Laboratory Manual of
Microbiology. 3rd Ed. W.H. Freeman and Company. San Francisco (1981).
4. Hairy, J.B. Clinical Diagnostic and Management by Laboratory Method, 9ed, WB
Saunders, Co. (1989).
5. Colome, J.S., Kubinski, A.M., Cano, R.J., Grady, D.V. Laboratory Exercise in
Microbiology. West Pub. Comp., USA. (1986).
6. White, T.J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J. Amplification and Direct Sequencing of
Fungal Ribosomal RNA Genes for Phylogenetics. In PCR Protocols. A Guide to
Methods and Applications, ed. Innis, M.A., Gelfand, D.H., Sninsky, J.J. & White,
T.J. pp.315-322. San Diego: Academic Press, Inc. ISBN 0-12-372181-4 (1990).
7. Ausbel F., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A.,
Struhl, K., Albright, L.M., Coen, D.M., Varki, A. Current Protocols in Molecular
Biology. Jhon Wiley & Son, Inc., USA (1997)
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi
26