Oleh: I N.

Sujaya

PENUNTUN PRAKTIKUM
MIKROBIOLOGI

Aspergillus niger

Oleh
I Nengah Sujaya
Untuk Kalangan Internal
Program Studi Ilmu Kesehatan Masyarakat
Universitas Udayana
2017

Petunjuk Praktikum 1
 Oleh: I N. Sujaya

KATA PENGANTAR

Puji syukur penulis panjatkan ke hadapan Tuhan Yang Maha Esa, Ida Sang Hyang Widi
Waca, karena hanya atas rachmat-Nya lah, Penuntun Praktikum Mikrobiologi ini bisa
diselesaikan. Penuntun Praktikum Mikrobiologi ini disusun dengan tujuan memberikan
bahan acuan kepada mahasiswa Program Studi Ilmu Kesehatan Masyarakat (PS IKM),
Universitas Udayana, tentang pengetahuan dasar dalam praktek mikrobiologi umum.
Disamping langkah dasar dalam mikrobiologi yang harus dikuasai oleh mahasiswa,
buku ini juga memberikan gambaran sekilas tentang teknik dasar biologi molekuler yang
menyebabkan revolusi dibidang ilmu mikrobiologi dan belakangan menjadi teknik yang
paling terpercaya dalam pengelompokan/klasifikasi organisme hidup di alam semesta ini.
Akhirnya dengan segala kerendahan hati penyusun menyampaikan ucapan
terimaksih yang sedalam dalamnya kepada pihak pimpinan PS IKM Unud, teman teman
sejawat staf pengajar di PS IKM Unud, serta mahasiswa yang banyak memberikan
bantuan dan dorongan sehingga Penuntun Praktikum initersusun dengan harapan buku
kecil ini bisa bermanfaat. Penyusun menyadari bahwa buku ini masih sangat jauh dari
sempurna dan oleh karena itu segala saran dan bimbingan dari pembaca sangat
diharapkan untuk penyempurnaan edisi berikutnya.

Denpasar, Agustus 2017

Penyusun,

Ir. I N. Sujaya, M.Agr.

Sc., Ph..D.

Petunjuk Praktikum 2
 Oleh: I N. Sujaya

PETUNJUK UMUM
PETUNJUK UMUM

1. Dalam praktikum mikrobiologi, anda akan bekerja dengan berbagai macam

mikroorganisme (Bakteri, Jamur, Yeast, dll). Walaupun sebagian besar
mikroorganisme yang dipakai tidak berbahaya, hendaknya saudara bekerja dengan
hati-hati. Taatilah petunjuk-petunjuk yang diberikan oleh pembimbing praktikum
saudara.
2. Sebelum saudara mulai bekerja, hendaknya saudara mempelajari betul pekerjaan yang
akan saudara lakukan. Buatlah rencana kerja yang baik, kalau perlu dengan membuat
skema kerja, sehingga saudara dapat bekerja dengan tepat, teliti dan cepat.
3. Dalam praktikum mikrobiologi, kondisi steril (bebas dari mikroorganisme
kontaminan) sangat penting dan merupakan faktor yang paling menentukan percobaan
saudara. Oleh karena itu, ikutilah selalu cara kerja steril yang diajarkan oleh
pembimbing praktikum saudara. Transfer material, pananaman dilakukan dalam ruang
steril (cleanbench) yang dilengkapi api burner (Bunsen), filter udara, lampu UV.
4. Jagalah selalu kebersihan dan kerapihan tempat saudara bekerja, sebelum, selama, dan
sesudah praktikum.
5. Janganlah memasukkan atau menggigit pensil, kertas dan sebagainya ke dalam mulut
selama berada di dalam ruang praktikum.
6. Kalau terjadi kecelakaan, cepat laporkan kepada asisten atau pembimbing praktikum
saudara.
7. Sesudah selesai praktikum, jangan lupa mencuci tangan dengan air dan sabun.
8. Hanya dengan memperhatikan ketelitian, kebersihan, dan kesabaran, pekerjaan
saudara akan berhasil.
9. Selama di laboratorium sangat dilarang melakukan aktivitas makan atau minum
10. Peserta praktikum diwajibkan mengenakan jas praktikum (jas lab) selama melakukan
praktikum.
11. Semua bahan yang akan diinkubasi harus diberi label yang cukup (berisi nama
kelompok, tanggal, dan informasi lain yang saudara anggap penting) agar tidak
tertukar dengan bahan lain yang tampak serupa. Inkubasi umumnya dilakukan dalam
inkubator dnegan suhu yang bisa dikontrol (atau pada kasus tertentu dilakukan dalam
suhu kamar atau waterbath).

Petunjuk Praktikum 3
 Oleh: I N.

Filter udara

Burner

Alas stainless steel

Selang gas
Switch (lampu, uv,
blower)
Gambar cleanbench

Petunjuk Praktikum 4
 Oleh: I N.

1
PRAKTIKUM
PENYIAPAN DAN PEMBUATAN MEDIUM

1.1 Fungsi Media

Media merupakan substrat yang diperlukan untuk menumbuhkan dan mengembang-
biakkan mikroorganisme. Sebelum dipakai dalam percobaan, media ini perlu disterilkan
terlebih dahulu, supaya tidak ditumbuhi oleh mikroorganisme yang tidak dikehendaki
(kontaminan). Agar mikroba yang kita kultur dapat tumbuh dengan baik, maka persyarat-
an yang harus dipenuhi oleh suatu media adalah :
a. Didalamnya harus terkandung bahan-bahan yang diperlukan oleh mikroba yang akan
ditumbuhkan. Bahan-bahan ini meliputi unsur-unsur makro, unsur mikro, dan trace
elemen serta zat pengatur tumbuh.
b. Media tersebut harus mempunyai tekanan osmosis, tegangan permukaan, dan pH yang
sesuai dengan kebutuhan mikroba yang akan dikultur.
c. Media harus dalam keadaan steril sebelum dipakai untuk menumbuhkan mikroba yang
diperlukan.

1.2. Jenis Media

1.2.1. Menurut bahan yang dipakai dalam pembuatannya, media dapat
digolongkan menjadi :
a. Media alami : Media yang komponen pembentuknya terdiri dari bahan-bahan alam,
seperti kentang, tauge, daging, nasi, dan lain sebagainya.
b. Media semi sintetik : Media yang bahan pembentuknya terdiri dari campuran bahan-
bahan alami dan bahan sintetik. Contoh : Agar Tauge, Agar Kentang Dextrosa, dll.
c. Media sintetik : Media yang bahan pembentuknya secara keseluruhan terbuat dari
bahan-bahan sintetik. Contoh : Agar Sabouraud, Endo Agar, Agar Czapex Dox, dll.

1.2.2. Menurut bentuknya, media dapat digolongkan menjadi :

a. Media cair : Media yang tidak ditambahkan zat pemadat (agar), sehingga media ini
dalam keadaan encer (cair). Contoh : Lactose Broth, Nutrient Broth.
b. Media semi padat : Media yang mengandung bahan yang sama dengan media cair,
tetapi ditambah sedikit agar (setengah konsentrasi agar), sehingga menjadi agak padat.
Media ini dipakai untuk menumbuhkan mikroba yang banyak memerlukan air dan
hidup dalam lingkungan yang anaerob atau anaerob fakultatif. Media ini juga dipakai
untuk uji motilitas suatu bakteri.
c. Media padat : Media cair yang ditambahkan dengan agar-agar sehingga menjadi padat.
Contoh : Nutrient Agar (NA), Potato Dextrose Agar (PDA), dll.

1.2.3. Menurut kegunaanya, Media digolongkan menjadi:

Petunjuk Praktikum 5
 Oleh: I N.
a. Media umum: Media yang digunakan untuk menumbuhkan satu atau lebih kelompok
mikroba secara umum. Contoh : Nutrient Agar (media untuk menumbuhkan kelompok
bakteri, Potato Dextrose Agar (media yang dipakai untuk menumbuhkan kelompok
jamur, dll.
b. Media pengaya: Media yang dipakai untuk menyuburkan mikroba tertentu sebelum
ditumbuhkan pada media yang dipakai dalam penelitian. Contoh: Selenit Broth (untuk
menyuburkan pertumbuhan bakteri Salmonella.
c. Media selektif: Media yang dipakai untuk menumbuhkan species tertentu dari
mikroba, dengan menghambat pertumbuhan species lain yang tidak dikehendaki.
Contoh: Media SS Agar(Salmonella dan Shigella Agar) untuk bakteri Salmonella dan
Shigella.
d. Media penghitungan : Media yang dipakai untuk menghitung jumlah mikroba suatu
bahan. Media ini dapat berupa media media umum dan media selektif.

1.3. Pembuatan Media

Dalam praktikum ini, saudara akan membuat beberapa macam media, yaitu media
Nutrient Agar, Malt extract, Lactose Broth, Brilliant Green 2 % Bile Broth, dan media
Endo Agar. Semua media tersebut merupakan media sintetik yang banyak dijual dalam
bentuk instant, sehingga dalam pembuatannya, saudara cukup memperhatikan petunjuk
yang tertera pada setiap media.

1.3.1. Cara pembuatan Nutrient Agar.

Untuk membuat 1 liter medium ini, lakukanlah prosedur berikut ini :
a. Timbang sebanyak 23,5 gram medium instant.
b. Suspensikan dalam akuadest dan volume akhir dibuat 1000 ml.
c. Panaskan suspensi ini sampai agar-agar menjadi matang.
d. Masukkan ke dalam tabung reaksi ( 5ml untuk media miring, dan  10 ml untuk
media tegak).
e. Sterilkan dengan autoclave pada temperatur 121 oC dan tekanan 15 lbs. Selama 15
menit.
f. Simpan pada tempat yang dingin dan kering (dalam kulkas).

1.3.2. Pembuatan Malt Extrak

Untuk membuat 1 liter medium ini, lakukan kangkah-langkah berikut :
a. Timbang sebanyak gram media instant.
b. Suspensikan dalam akuadest sampai volume akhir menjadi 1000 ml.
c. Masukkan ke dalam tabung reaksi (kurang lebih 7 ml tiap tabung)
d. sterilkan dengan autoclave pada suhu 121 oC dan tekanan 15 lbs, selama 15 menit.

1.3.3. Pembuatan medium Lactose Broth

Dalam praktikum ini akan dibuat medium lactose broth dengan dua konsentrasi (single
strength dan double strength). Untuk membuat satu liter single strength lactose broth,
lakukanlah prosedur berikut ini :
a. Timbang sebanyak 13 gram medium lactose broth instant.
b. Suspensikan dalam akuades sampai volume akhir mencapai 1000 ml.
c. Masukkan ke dalam tabung reaksi yang telah dilengkapi dengan tabung Durham.
Petunjuk Praktikum 6
 Oleh: I N.
d. Sterilkan dengan autoclave pada suhu 121 oC pada tekanan 15 lbs selama 15 menit.
e. Simpan pada tempat yang sejuk dan kering (dalam kulkas).
f. Prosedur yang sama dikerjakan untuk membuat double strength lactose broth, tapi
konsentrasinya dilipat duakan.
g.
1.3.3. Pembuatan medium BGBB (Brilliant Green Bile 2 % Broth)
Untuk membuat satu liter medium ini, lakukan prosedur berikut ini :
a. Timbang sebanyak gram medium instant.
b. Suspensikan dalam akuadest dan volume akhir dibuat menjadi 1000 ml.
c. Masukkan ke dalam tabung reaksi kecil yang telah dilengkapi dengan tabung Durham.
d. Sterilkan dengan autoclave pada temperatur 121 oC pada tekanan 15 lbs, selama 15
menit.
e. Simpan di tempat yang sejuk dan kering.

1.3.4. Pembuatan medium Endo Agar

Untuk membuat 1 liter medium ini, lakukanlah prosedur berikut:
a. Timbang sebanyak gram medium instant.
b. Suspensikan dalam akuades dan buat volume akhir menjadi 1000 ml.
c. Panaskan sampai semua komponen larut.
d. Sterilkan dengan autoclave pada suhu 121 oC pada tekanan 15 lbs, selama 15 menit.
e. Simpan ditempat yang sejuk dan kering (dalam kulkas).

1.3.5. Pembuatan medium Palte Count Agar

Untuk membuat 1 liter medium ini, lakukanlah prosedur berikut:

a. Timbang sebanyak 23,5 gram medium instant PCA,
Pronadisa). Catatan :
Merk yang berbeda mempunyai kompisisi yang berbeda sehingga berat gram / lt
mungkin berbeda. Sehingga, perhatikan panduan yang tertulis pada kemasan/botol
media yang diupergunakan.
b. Suspensikan dalam akuades dan buat volume akhir menjadi 1000 ml.
c. Panaskan sampai semua komponen larut (langkah ini bisa tdak dilakukan apabila tidak
mempersiapkan agar tega/agar mirin dalam tabung reaksi).
d. Sterilkan dengan autoclave pada suhu 121 oC pada tekanan 15 lbs, selama 15 menit.
e. Media bisa dituang ke dalam cawan petri yang sudah di autovlave (lihat gambar di
bawah).
Untuk satu cawanpetri diameter 9,9mm, ketebalan 1,5 cm, maka volume agar yang
diperkukan sebanyak 17,5-20 ml untuk ketebalan media agar yang baik.
Agar di tulang ke dalam cawan petri pada kondisi suhu media + 65-75oC. Pada suhu di
bawah itu agar akan memberku.
f. Biarkan agar dalam cawan petri membeku, tutup cawan di buka sampai agar
memebrku (20-30 menit dalam laminar flow).
g. Simpan ditempat yang sejuk dan kering (dalam kulkas) dalam keadaan dibungkus
kantong plastik dan agar diletakkan terbalik (bagian tutup cawan petri di bawah dan
agar di atas).

Petunjuk Praktikum 7
 Oleh: I N.

Media umumnya dibuat dalam bentuk media agar (agar plate) yang mana media
dituangkan dalam cawan petri, media agar miring/agar tegak yang disiapkan dalam
tabung reaksi umunya digunakan untuk menyimpan kultur. Kultur aerob biasanya
disimpan dalam agar miring, semantara kultur anaerob umumnya disimpan dalam agar
tusuk (stab) pada media tegak.
B. Agar tegak C. Agar miring

A. Media agar

Gambar 1-1. Menyiapkan media agar yang telah disterilkan di tuang ke dalam cawan petri. (A).
Perhatikan bahwa mulut erlenmeyer harus dibakar pada api bunsen terlebih dahulu. Pada media
tegak dan miring, tutup kapas harus dibuat dalam keadaan padat dan ketat sehingga tidak mudah
lepas.

Petunjuk Praktikum 8
 Oleh: I N.

2
PRAKTIKUM
MORFOLOGI SEL BAKTERI

2.1. Pendahuluan.
Walaupun ada ratusan species bakteria yang berbeda, namun suatu bakteria dalam bentuk
sel tunggal akan memiliki salah satu dari tiga bentuk yang umum dikenal, yaitu:
a. Bentuk bulat/elips/spherical shape yang lazim disebut dengan coccus.
b. Bentuk batang yang umum disebut basil.
c. Bentuk spiral.

Bakteri berbentuk bulat atau coccus, sering menunjukkan variasi bentuk. Variasi bentuk
ini sering dipakai sebagai ciri yang khas dalam proses identifikasi jenis. Beberapa variasi
bentuk tersebut antara lain:
a. Diplococcus: Dua buah sel saling bedempetan atau berpasangan.
b. Streptococcus: Untaian sel yang lebih dari 4 sel dan membentuk suatu untaian yang
menyerupai rantai.
c. Tetrad atau tetracoccus: Empat buah sel yang saling berdempetan yang membentuk
suatu bentuk yang menyerupai bujur sangkar.
d. Staphylococcus: Kumpulan sel yang saling bedempetan, sehingga menyerupai buah
anggur.
e. Sarcina: Kelompok yang terdiri atas 8 sel (4 sel pada bagian depan dan 4 sel pada
bagian belakang) yang membentuk suatu bentuk yang menyerupai kubus.

Berbeda dengan bakteri bentuk bulat, bakteri bentuk batang (basil) jarang sekali
berada dalam variasi diatas. Pada bakteri bentuk batang ini, variasi diatas (jarang)
bukan merupakan karakteristik dari bakteri ini. Bila dialam dijumpai adanya variasi
bentuk dari bakteri basil ini, maka hal tersebut cenderung disebabkan oleh tahap
pertumbuhannya atau kondisi-kondisi yang mempengaruhi kultur tersebut.
Bakteri berbentuk spiral pada umumnya dijumpai dalam bentuk soliter atau bersel
tunggal dan bukan merupakan kumpulan sel yang berdempetan.
Dalam praktikum ini saudara akan diperkenalkan beberapa species bakteri yang
mewakili bentuk bentuk diatas. Disamping itu juga akan diperkenalkan beberapa struktur
luar dan struktur dalam bakteri, seperti flagella, capsula, dan endospora, sebagai
pelengkap morfologi bakteri tersebut.

2.2 Alat dan Bahan yang diperlukan

a. Mikroskop cahaya.
b. Minyak emersi
c. Objek glass dan alat fiksasi
d. Kultur bakteri (sebaiknya yang masih muda).

Petunjuk Praktikum 9
 Oleh: I N.
e. Jarum ose (loop)
f. Burner (bunsen)

2.3. Cara Kerja

a. Amatilah bentuk-bentuk sel bakteri yang disediakan oleh asisten dan pembimbing
praktikum saudara, dengan menggunakan mikroskop cahaya dan mulai dengan
perbesaran lemah.
b. Bila pengamatan kurang jelas, lakukan pengamatan dengan lensa objektive yang
berkekuatan 100 x. (Ingat : pakailah minyak emersi pada perbesaran 100 x ini).
c. Gambarlah bentuk-bentuk bakteri beserta variasinya pada buku journal saudara.
d. Bersihkan minyak emersi pada lensa yang saudara pakai dengan menggunakan larutan
xylol (Ingat : hati-hati bekerja dengan xylol ini, karena bersifat karsinogenik/penyebab
terjadinya kanker).

Gambar 2-1 A. Kocok kultur cair dan ambil satu Gambar 2-1B. Sebarkan di atas glas objek dan
mata loop yang sebelumnya dipanaskan di atas lakukan pengamatan di bawah mikroskop
api

Gambar 2-1 C. Bentuk sel bakteri

Petunjuk Praktikum 1
 Oleh: I N.

3
PRAKTIKUM
STERILISASI

3.1. Pendahuluan
Sterilisasi merupakan suatu proses membebaskan peralatan atau bahan dari
mikroorganisme yang tidak dikehendaki. Untuk mencapai tujuan ini, ada beberapa
macam sterilisasi yang dapat dipilih dan disesuaikan dengan sifat bahan yang akan
disterilkan. Cara-cara yang umum dilakukan adalah:
a. Sterilisasi secara fisik : sterilisasi dengan menggunakan pemanasan, penggunaan sinar
UV, sinar X dan sinar-sinar yang panjang gelombangnya pendek.
b. Sterilisasi secara kimia : sterilisasi dengan menggunakan bahan-bahan kimia, seperti
alkohol, desinfektan, larutan formalin, dll.
c. Sterilisasi mekanik : sterilisasi dengan menggunakan filter atau saringan.

3.2. Sterilisasi dengan pemanasan

a. Pemanasan dengan udara kering atau udara basah
Cara ini sangat cocok untuk mensterilkan alat-alat atau bahan-bahan yang tahan panas.
Dalam cara ini, temperatur yang dipakai adalah 170 oC dan dilakukan selama 1 jam.
b. Tindalisasi
Cara ini dipakai untuk mensterilkan bahan-bahan yang tidak tahan suhu tinggi.
Dalam cara ini, bahan dan alat dipanaskan selama 30 menit pada suhu 100 oC, dan
diulang sebanyak 3 kali berturut-turut, dengan selang waktu 1 hari. Bahan dan alat
disimpan pada suhu kamar pada saat tidak dipanaskan.
c. Pasteurisasi
Cara ini dipakai untuk mensterilkan bahan makanan yang akan mengalami denaturasi
pada suhu tinggi. Dengan cara ini, alat dan bahan dipanaskan pada suhu 60 - 80 oC
selama satu jam sebanyak 3 kali berturut-turut, dengan selang waktu 1 hari.
d. Sterilisasi dengan nyala api langsung.
Cara ini sangat cocok untuk mensterilkan jarum inokulasi.
e. Sterilisasi dengan uap panas yang bertekanan
Cara ini umum dipakai untuk mensterilkan alat dan bahan yang tahan panas tinggi dan
tekanan. Alat yang dipakai adalah autoclave yang dapat mencapai suhu 121 oC dan
tekanan 15 lbs.

Cara memakai AUTOCLAVE.

a. Isi autoclave dengan air sebanyak 3-5 liter.
b. Siapkan alat atau bahan yang akan disterilkan pada bagian rak autoclave.
c. Masukkan alat dan bahan yang ada di dalam rak tersebut ke dalam bejana autoclave,
dan tutup dengan rapat (kecuali klep udara).

Petunjuk Praktikum 1
 Oleh: I N.
d. Panaskan autoclave ini dan biarkan semua udara yang ada di dalamnya keluar (yang
ditandai dengan keluarnya tetes-tetes air melalui lkep udara.
e. Tutup klep udara bila semua udara dalam autoclave sudah keluar.
f. Pemanasan dilanjutkan sampai mencapai suhu 121 oC dan tekanan 15 lbs, selama 15
menit.
g. Pemanasan dihentikan, suhu dikembalikan ke suhu kamar dan tekanan pada titik 0.
h. JANGAN PERNAH MENCOBA UNTUK MEMBUKA AUTOCLAVE SEBELUM
JARUM PENUNJUK TEKANAN MENUNJUKAN PADA ANGKA 0 (NOL),
KARENA SANGAT BERBAHAYA!!!!!!!.

Meter tekanan Tempat

uap dan suhu pembuangan uap

Klep pengunci

Gambar 3-1. Autoclave manual

Catatan : Bila di dalam autoclave terdapat :

a. 100 % uap air murni, maka suhu yang dicapai adalah 121 oC dan tekanan 15 lbs.
b. 2/3 bagian uap air dan 1/3 udara, maka suhu dan tekanan yang dicapai adalah 115 oC
dan 15 lbs.
c. 1/3 bagian uap air dan 2/3 udara, maka suhu dan tekanan yang dicapai adalah 109 oC
dan 15 lbs.
d. 100 % udara, maka suhu dan tekanan yang dicapai adalah 100 oC dan 15 lbs.

3.2. Sterilisasi dnegan radiasi

Dilakukan dengan menggunakan cahaya gelombang pendek, seperti UV atau sinar
Co 60 atau Cs 69. Dalam praktikum ini akan dilakukan sterilisasi medium padat dengan
menggunakan sinar UV.

Petunjuk Praktikum 1
 Oleh: I N.

Gambar 3-2. autoclave elektrik

Dalam melakukan autoclaving menggunakan autoclave ini lakukan sebarai berikut :

1. Isi chamber dengan air sampai permukaan atas air sedikit di atas permukaan
kerajang.
2. Masukkan bahan dan alat ke dalam kerajang di dalam autoalve dnegan memutar
(full) handle 1.
3. Hidupkan mesin dnegan menekan power on.
4. Tutup rapat autoclave
5. Atur meter suhu (4) untuk menetukan susu autoclave (panel 4)
Petunjuk Praktikum 1
 Oleh: I N.
6. Atur lama waktu aucocklave (panel 5)
7. Tutup rapat pengeluaran uap panel 2)
8. Tekan star (panel 8)
Auclaving akan berjalan secara otomati, dan lampu pada panel lama waktu
autoclaving akan menyala menunjukkan proses autoclaving (panel 7).
Apabila proses autoclaving telah selesai, maka akan mterdengar bunyi
“Ti..Ti.....Ti. . .”.

Setelah selesai proses autoclaving maka lakukan sebagai berikut:

1. Tekan stop (panel 9)

2. Buka keran pengeluaran uap (panel 2) sampai uap semuanya keluar
3. Pastikan tekanan di dalam mesin ‘NOL” (lihat panel 3).
4. Setelah tenaklan NOL baru mesin autoclave bisa di buka dan bahan/alat yang
diosterilkan dikeluarkan dan di aruh ditempat yang berseih.
5. Matikan power mesin autoclave.

A. Sterilisasi dengan UV
Alat dan bahan
a. Cawan petri
b. Medium Agar tegak.
c. Lampu UV
d. Lampu Bunsen

Cara kerja
a. Cairkan 3 tabung medium Agar tegak dalam penangas air.
b. Tuangkan ke dalam 3 cawan petri steril dan biarkan membeku.
c. Sinari cawan petri pertama dengan UV selama 1 menit, cawan kedua selama 3 menit,
dan cawan ketiga tidak disinari (dalam keadaan terbuka).
d. Inkubasi cawan petri selama 24 - 48 jam pada suhu 37 oC, dalam keadaan terbalik.
e. Amati pertumbuhan mikroba pada ketiga cawan petri tersebut.

3.3. Sterilisasi dengan zat kimia

Zat-zat kimia seperti alkohol, formalin, karbol, lisol, sabun, dan lain-lain dapat dipakai
untuk mensterilkan alat-alat. Pada praktikum ini akan dilakukan sterilisasi dengan
menggunakan beberapa zat kimia.
A. Sterilisasi dengan
alkohol Alat dan bahan
a. Cawan petri steril
b. Medium NA tegak
c. Jarum pentul/Paku kecil.
d. Alkohol dengan konsentrasi 40 %, 70 %, dan 96 %
e. Air steril
Petunjuk Praktikum 1
 Oleh: I N.
f. Pinset

Cara kerja
a. Cairkan medium NA dalam penangas air dan tuangkan kedalam cawan petri. Biarkan
membeku pada suku kamar.
b. Rendam jarum pentul atau paku dalam larutan alkohol diatas selama 10 menit.
c. Cuci jarum pentul dengan air steril dan letakkan pada permukaan medium dalam
cawan petri.
d. Inkubasi pada suhu 28 - 30 oC selama 24-48 jam.
e. Bandingkan pertumbuhan mikroba pada sekitar jarum pentul. Larutan mana yang
paling efektif.
f. Lakukan hal yang sama dengan menggunakan formalin 4 %, lisol dan karbol.

B. Sterilisasi dengan
sabun Alat dan bahan
a. Cawan petri steril
b. Medium NA tegak
c. Sabun dengan berbagai Merek dagang.

Cara kerja
a. Cairkan 2 tabung medium NA tegak dalam penangas air dan tuangkan ke dalam dua
cawan petri steril
b. Apuskan jari tangan saudara yang belum dicuci pada permukaan medium pada cawan
petri pertama.
c. Cuci jari tangan saudara dengan sabun merk tertentu sebersih mungkin dan biarkan
kering dengan sendirinya (jangan di keringkan dengan lap). Setelah kering, apuskan
jari saudara pada permukaan medium dalam cawan petri kedua.
d. Inkubasi kedua cawan petri tersebut selama 24-48 jam pada suhu 28-30 oC.
e. Bandingkan pertumbuhan mikroba pada kedua cawan petri tersebut.

3.4. Sterilisasi dengan membrane filter

Bahan-bahan yang tidak boleh dipanaskan, seperti serum dan beberapa macam gula
tertentu dapat disterilkan dengan menggunakan membran filter. Dalam bidang
mikrobiologi, alat penyaring yang paling banyak dipergunakan adalah filter berkerfield,
filter chamberland, filter seilz, dll. Filter-filter ini terbuat dari polimer khusus dengan
diameter 0,45 mikron, sehingga dapat menahan bakteri yang terkandung dalam sample.
Dalam praktikum ini saudara akan menggunakan membran yang terbuat dari polisulfon,
yang diproduksi oleh Millipore.
Alat dan bahan
a. Polisulfon membran dengan diameter 0,22 mikron (hidrofilik)
b. Satu set alat percobaan membran lengkap dengan regulator gas.
c. Cawan petri
d. Botol McCartney
e. Gun pipet lengkap dengan tipsnya
f. Medium NA tegak
g. Air tercemar
Petunjuk Praktikum 1
 Oleh: I N.

Cara kerja
a. Cairkan medium NA dalam penangas air dan biarkan pada temperatur 40 oC.
b. Saringlah sejulah air yang sudah tercemar (air kali) dengan menggunakan membran
polisulfon.
c. Pipet sebanyak 1 ml. Air hasil saringan ini dan tempatkan ke dalam cawan petri
d. Sebagai kontrol, pipet 1 ml air yang belum disaring dan tempatkan pada cawan petri
kedua.
e. Tuangkan masing-masing satu tabung medium NA (suhu 40 oC) ke dalam masing-
masing cawan petri yang sudah berisi sampel air.
f. Goyang kedua cawan sedemikian rupa sehingga sampel menjadi homogen dengan
medium, dan biarkan membeku.
g. Inkubasi kedua cawan petri tersebut pada suhu 20-30 oC selama 24-48 jam.
h. Amati kedua cawan petri !!. Kesimpulan apa yang dapat anda ambil dari percobaan ini
?

Petunjuk Praktikum 1
 Oleh: I N.

4
PRAKTIKUM
ENUMERASI DAN ISOLASI

Perhitungan jumlah mikroba (enumerasi) yang terkandung di dalam sampel dapat

dilakukan dengan berbagai cara, antara lain: metode pengenceran, metoda perhitungan
langsung dalam ruang hitung (hemasitometer), Metode membran filter, metode berat
kering dan volume sel, metode MPN, dll. Pada praktikum ini, saudara akan belajar
menentukan jumlah sel yang terdapat dalam suatu sample dengan menggunakan metoda
pengenceran dan metoda penghitungan langsung dengan menggunakan alat
haemasitometer (Improved New Bauwer).

4.1 Metoda pengenceran

Metoda pengenceran ini menggunakan suatu seri pengenceran dari sampel yang
kemudian ditanam pada medium. Setelah diinkubasi, koloni yang tumbuh dapat dihitung
dengan asumsi bahwa satu koloni yang tumbuh berasal dari satu sel. Dengan demikian,
maka jumlah sel pada sample asal dapat dihitung dengan cara mengalikan jumlah koloni
yang tumbuh dengan faktor pengencernya. Pengenceran biasanya dinyatakan dengan
pangkat negatif, misalnya 10-5 untuk pengenceran 1:100.000. Dengan menggunakan
metoda ini kita dapat menghitung jumlah total mikroba yang terdapat dalam sample air
atau sample tanah.

Alat dan bahan

a. Sampel (bahan makanan, air dan bahan lainnya)
b. media NA (atau media lain yang sesuai dengan tujuan)
c. Botol steril (eppendorf tube)
d. Cawan petri
e. Larutan NaCL 0,85% steril
f. Pipetman

Cara kerja
a. Ambil sampel air secara aseptik dengan menggunakan botol steril.
b. Cairkan medium NA dalam penangas air dan dinginkan sampai suhu 45oC.
Kalau menggunakan cara sebar, Media Agar siap pakai sudah disiapkan di dalam
cawan petri.
c. Tandai 6 cawan petri dengan 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 ,10-6.
d. Kocok sampel air sampai homogen dan ambil secara aseptik sebanyak 1 ml, kemudian
dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang telah berisi 9 ml air steril untuk
mendapatkan faktor pengenceran sebesar 10 kali (10-1).
e. Kocok tabung reaksi ini dengan baik, dan ambil air di dalamnya secara aseptik
sebanyak 1 ml, dan masukkan ke dalam cawan petri yang bertanda 10-1. Dari tabung
ini juga, ambil sebanyak 1 ml sampel dan masukkan ke dalam tabung reaksi kedua

Petunjuk Praktikum 1
 Oleh: I N.
yang telah berisi 9 ml air steril untuk memperoleh faktor pengenceran sebesar 100 kali
(10-2).
f. Masukkan sebanyak 0,1 ml bertanda 10-2 ke dalam media agar, lalu sebar dipermukaan
Media Agar dengan mempergunakan gelas kaca bengkok. Celupkan gelas kaca
bengkok ke dalam alkohol 70%, bakar di atas api, dan dinginkan sebelum dilakukan
penyebaran.
g. Lakukan lamgkah (f) pada pengenceran yang lainnya.
h. Untuk menghitung total mikroba dalam sampel lainnya, prosedur yang dipakai persis
sama dengan diatas, tetapi banyaknya sample yang harus ditimbang adalah 1 gram
sample padat atau 1 ml sample cair (Perhatikan lampiran !!!!).
i. Inkubasi semua cawan yang telah ditanami dengan sample yang berisi mikroba pada
temperature 37 oC selama 24 jam.
j. Lakukan penghitungan koloni yang tumbuh pada semua cawan Petri yang jumlah
koloninya berkisar antara 30 – 300 koloni.
k. Jumlah sel mikroba yang terdapat pada sample dihitung dengan cara mengalikan
jumlah koloni yang tumbuh pada medium dengan factor pengenceran.

Petunjuk Praktikum 1
 Oleh: I N.

Metode pengencera

1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

Contoh bahan cair 9 ml 9 ml 9 ml 9 ml

(10-1) (10-2) (10-3) (10-4)

Gambar 4-1. Cara menyebarkan (spreading) sample di cawan petri

X = julah koloni yang tumbuh dalam cawan petri X 10 X faktor pengenceran

Petunjuk Praktikum 1
 Oleh: I N.

5
PRAKTIKUM
BIAKAN MURNI

5.1. Pendahuluan
Untuk memepelajari karakteristik mikrooragnisme, langkah awal yang harus dilakukan
adalah mengisolasi mikrooragnisme dari sumbernya. Salah satu cara mengisolasi
mikroorganisme dari campuran mikroorganisme adalahd neagn teknik penggoresan
(streak plate techniques) (Gamba 4.1.). Atau mikrooragnisme bisa pula diisolasi dari
media agar yang sudah disebar setelah melakukan penghitungan jumlah mikroorganisme
menggunakan agar tuang. Dalam melakukan isolasi, diperlukan suatu teknik aseptik
sehingga mikrooragnisme yang kita dapatkna tidak tercemar (kontaminsa) olehg
mikroorganisme lainnya. Dan untuk langkah ini dfalam teknik dasar mikroobiologi
biasanya dilakukan dnegan pemurnian isolat dengan beberapa kali penggoresan yang
berulang (re-streaking) dengan cara yang sama seperti di bawah ini.

5.2. Isolasi mikroba

Alat dan bahan
a. Cawan petri
b. Medium NA
c. Medium NA miring

Cara kerja
a. Cairkan media NA tegak dalam penangas air dan tuangkan ke dalam cawan petri steril.
b. Setelah beku, pilihlah koloni-koloni yang tumbuh pada cawan hitung dalam
enumerasi, yang menurut saudara menarik. Lakukan “streak for single colony” pada
media steril dalam cawan petri yang telah beku.
c. Inkubasi selama 24 jam.
d. Isolasi koloni yang tumbuh dan tanam pada medium agar miring. Biakan ini akan
dipakai pada praktikum selanjutnya.

Petunjuk Praktikum 2
 Oleh: I N.

Gambar 5-B. Ambil koloni Gambar 5-C. Lakukan

tunggal. penggoresan. Setiap memulai
goresan baru, jarum ose harus
dipanaskan.

Gambar 5-A. Pilih koloni

yang mudah diambil
secara random dari cawan
Petri.

Petunjuk Praktikum 2
 Oleh: I N.

6
PRAKTIKUM
PEWARNAAN SEL BAKTERI

6.1. Pendahuluan
Pengenalan bentuk mikroba (morfologi), kecuali mikroalgae harus dilakukan pewarnaan
terlebih dahulu agar dapat diamati dengan jelas. Tujuan pewarnaan adalah:
1. Mempermudah pengamatan bentuk sel mikroorganisme (khususnya bakteri).
2. Memperjelas ukuran jasad
3. Dapat mengamati struktur luar dan struktur dalam dari sel mikroba.
4. Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan, sehingga sifat fisik, kimia dari
jasad dapat diketahui. Dengan demikian, kita dapat menggunakan pewarnaan sebagai
salah satu cara untuk klasifikasi bakteria. Berhasil atau tidaknya pewarnaan sangat
ditentukan oleh waktu pemberian warna dan umur biakan yang diwarnai (Umur biakan
yang baik adalah 24 jam).

6.2 Berbagai macam metoda pewarnaan

6.2.1 Pewarnaan langsung dengan pewarna basa
Umumnya zat pewarna merupakan garam-garam yang dibangun oleh ion-ion yang
bermuatan positif atau negatif, dimana salah satu ion-ion tersebut berwarna. Kalau suatu
sel bakteri yang dinding selnya bermuatan relatif negatif bersatu dengan ion yang
bermuatan positif dari suatu pewarna, maka menyebabkan sel bakteri tersebut terwarnai.
Zat pewarna dapat dikelompokkan menjadi dua group, yaitu zat pewarna yang
bersifat basa dan zat pewarna yang bersifat asam. Kalau ion positif dari zat pewarna yang
mengandung warna tersebut, maka pewarna tersebut adalah pewarna basa. Dan bila
warna tersebut berada pada ion yang bermuatan negatif, maka pewarna tersebut adalah
pewarna asam.
Alat dan bahan
a. Kultur bakteri yang diiolasi dalam praktikum sebelumnya dan beberapa biakan murni.
b. Pewarna Metilene blue
c. Pewarna kristal violet.
d. Karbol fuhsin
e. Kaca objek bersih dan kaca penutup.

Cara kerja.
a. Letakkan sebuah kaca objek yang bebas lemak diatas meja kerja.
b. Teteskan setetes air ditengah-tengah kaca objek tersebut.
c. Dengan menggunakan jarum Ose yang telah dipijarkan, ambil sedikit biakan bakteri
yang saudara isolasi pada praktikum sebelumnya atau dari biakan murni bakteri yang
disediakan oleh asisten saudara.

Petunjuk Praktikum 2
 Oleh: I N.
d. Buat apusan bakteri pada air yang diletakkan pada kaca objek dengan cara menggesek-
gesekan jarum ose yang berisi biakan bakteri, sehingga didapatkan suatu campuran
yang tipis dan merata.
e. Fiksasi diatas api bunsen dengan jarak sekitar 30 Cm. Dari nyala api. Dalam
memfiksasi ini jangan terlalu panas karena dapat merusak bentuk sel.
f. Teteskan salah satu larutan pewarna yang disediakan oleh asisten pada sediaan yang
telah difiksasi. Pewarna Metilene blu akan mewarnai sel dalam 30 - 60 detik, Kristak
violet dalam 10 detik, dan Karbol fuhsin dalam 5 detik.
g. Cuci dengan air mengalir.
h. Keringkan sediaan dengan meletakkannya diantara kertas saring.
i. Amati dengan mikroskop dengan menggunakan lensa objektive dengan perbesaran
100 kali, dan minyak imersi.
j. Catat dan gambar bentuk sel dan warna sel mikroorganisme yang saudara lihat.

Pertanyaan :
1. Apakah kultur yang saudara isolasi merupakan kultur murni, mengapa ?
2. Apa maksud memfiksasi sediaan ?.

6.2.2. Pewarnaan negatif atau pewarnaan tak langsung

Salah satu pewarna asam adalah nigrosin atau tinta cina. Karena daya mewarnai pada zat
ini berada pada ion negatif dan tidak bereaksi dengan ion negatif lainnya dari sel bakteri,
maka pewarna ini tidak mewarnai sel. Dalam hal ini, yang terwarnai adalah lingkungan
sekitar sel. Dengan cara ini saudara sudah dapat mengamati bentuk-bentuk sel bakteri dan
juga ukurannya dengan jelas.

Alat dan bahan

a. Kultur bakteri hasil isolasi atau kultur yang disediakan oleh asisten.
b. Cairan nigrosin atau tinta cina
c. Kaca objek bebas lemak.

Cara kerja
a. Teteskan sati tetes cairan nigosin atau tinta cina pada pinggir ujung kaca objek.
b. Dengan menggunakan jarum Ose yang telah dipijarkan, ambil sedikit biakan bakteri
dan suspensikan pada tetesan nigrosin pada permukaan kaca objek.
c. Ratakan suspensi bakteri dalam nigrosin pada permukaan kaca objek ini dengan
menggunakan kaca objek lain.
d. Biarkan kering pada suhu kamar, dan amati dengan mikroskop (perbesaran lensa
objektif 100 x), dan pakai minyak imersi.
e. Gambar bentuk bakteri yang saudara lihat.

Cara-cara pewarnaan berikut merupakan teknik pewarnaan diferensial, sebagai

salah satu cara dalam mengklasifikasi bakteri.

Petunjuk Praktikum 2
 Oleh: I N.

6.2.3. Pewarnaan Gram

Pewarnaan Gram merupakan pewarnaan yang sangat umum dalam bidang
bakteriologi. Dengan pewarnaan ini, kelompok bakteri dapat dibedakan menjadi dua,
yaitu kelompok bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif . Ada banyak modifikasi
dari teknik pewarnaan ini, namun semua teknik tersebut berdasarkan pada prinsip yang
sama, yaitu :
1. Mewarnai mikroorganisme dengan pewarna dasar, yaitu dengan kristal violet atau
gentian violet.
2. Fiksasi warna, yaitu untuk menguatkan perlekatan warna dasar, misalnya dilakukan
dengan garam iodin (modifikasi larutan lugol).
3. Pencucian atau penghapusan warna dasar dengan alkohol, aseton, atau campuran
alkohol dengan aseton.
4. Pewarnaan kembali dengan pewarna pembanding atau kontras yang berbeda dengan
pewarna dasar, yaitu untuk mewarnai sel-sel yang telah hilang warnanya oleh
penghapusan warna. Misalnya dalam hal ini dipakai safranin atau karbol fuhsin..

Bakeri yang setelah diwarnai dengan pewarna dasar warnanya tidak terhapus oleh
alkohol akan berwarna violet karena terwarnai oleh kristal violet, dan tidak lagi menyerap
pewarna kontras. Kelompok bakteri yang mempunyai sifat ini dikelompokkan menjadi
bakteri Gram positif. Sedangkan, kelompok bakteri yang telah diwarnai dengan pewarna
dasar dan warnanya terhapus setelah diperlakukan dengan alkohol, akan menyerap
pewarna safranin atau karbol fuhsin yang dipakai sebagai pewarna kontras, sehingga
dalam preparat akan terlihat warna merah(warna safranin atau karbol fuhsin). Kelompok
bakteri yang demikian disebut dengan bakteri Gram negatif.

Alat dan bahan

a. Kultur muda bakteri yang diisolasi atau yang disediakan oleh asisten.
b. Larutan kristal violet
c. Larutan garam iodin.
d. Alkohol 95 %.
e. Larutan safranin
f. Kaca objek

Cara kerja
a. Buat apusabn bakteri pada kaca objek kering dan bersih.
b. Fiksasi diatas nyala api bunsen atau di udara.
c. Warnai dengan larutan kristal violet selama 1 - 1,5 menit.
d. Cuci dengan air suling.
e. Tetesi dengan larutan garam iodin, dan biarkan selama 1 menit.
f. Cuci dengan larutan alkohol 95 % sampai warnanya terhapus, biasanya selama 0,5
menit (30 detik).
g. Cuci dengan air.
h. Warnai dengan safranin atau karbol fuhsin selama 2 menit.
i. Cuci dengan air, dan buang kelebihan air dengan menggunakan kertas hisap, tanpa
menggosok sediaan.
Petunjuk Praktikum 2
 Oleh: I N.
j. Keringkan diudara atau diatas nyala api bunsen.
k. Amati dibawah mikroskop dengan perbesaran 1000 kali. (ingat pakai minyak imersi).
l. Catat pengamatan saudara.

Gambar 6-1. Zat warna umum yang digunakan dalam pewarnaan Gram

Langkah kerja

NO. Langkah Waktu Keterangan

1 Krital violet 60 detik  Zat warna utama

2 Cuci dnegan air Cuci sedikit saja

3 Gram lar. Yod 60 detik  Sebagai Mordant, membantu zat warna mebentuk
(Lar Mordan) kompleks (terikat kuat) dengan bagian bermuatan
dalam didinding sel, plasma membran dan sitoplasma.
4 Cuci dengan air Cuci dengan
saksama
5 Alkohol 95% 10 detik  Pencuci zat warna, kompleks yod-kristal violet
kompleks. Karena bakteri Gram negatif mempunyai
didning sel lebih tipis dari Gram positif maka
kompleks yod-kristal violet akan tercuci dnegan cepat
6 Cuci dengan air Cuci dengan
saksama
Safranin 60 detik  Zat warna sekunder. Fungsi safranin adalah sebagai
7 zat warna pengkonter dari warna vbakteri Gram,
negatif yang tercuci karena penambahan alkohol.
Bakteri Gram positif hanya sedikit mengikat safranin
karena bagian bermuatan sudah diikat oleh kristal
violet.
8 Cuci dnegan air Bilas sebentar
saja
9 Keringkan Dengan tissue
kering

Petunjuk Praktikum 2
 Oleh: I N.

C
N-asetil muramat

N-asetil muramat

..... peptida pendek

jembatan peptida

B
Gambar 6-A: Komponen dinding sel bakteri Gram positif;
(6-B): Gram negatif; 6-C: lapisan peptidoglikan

DAFTAR PUSTAKA
1. Madigan, M.T., Martinko, J.M., Parker, J. Brock Biology of Microorganisms. 10
th Ed. Perason Education Inc. Upper Saddle River, New Jersey (2003).
2. Lay, D.W. Analisis Mikroba di Laboratorium. Penerbit Raja Grafindo
Persada, Jakarta (1994).
3. Seely, H.W.Jr., dan VanDemark, P.J. Microbes in cation. A Laboratory Manual
of Microbiology. 3rd Ed. W.H. Freeman and Company. San Francisco (1981).
4. Hairy, J.B. Clinical Diagnostic and Management by Laboratory Method, 9ed,
WB Saunders, Co. (1989).
5. Colome, J.S., Kubinski, A.M., Cano, R.J., Grady, D.V. Laboratory Exercise
in Microbiology. West Pub. Comp., USA. (1986).
6. White, T.J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J. Amplification and Direct Sequencing of
Fungal Ribosomal RNA Genes for Phylogenetics. In PCR Protocols. A Guide to
Methods and Applications, ed. Innis, M.A., Gelfand, D.H., Sninsky, J.J. & White,
T.J. pp.315-322. San Diego: Academic Press, Inc. ISBN 0-12-372181-4 (1990).
7. Ausbel F., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A.,
Struhl, K., Albright, L.M., Coen, D.M., Varki, A. Current Protocols in Molecular
Biology. Jhon Wiley & Son, Inc., USA (1997)

Petunjuk Praktikum 2