Disusun Oleh:

NINDYA SEKAR MAYURI S.Pd., M.Si

Program Studi D3 Farmasi

 PRAKTIKUM 1

PENGGUNAAN MIKROSKOP

A. TUJUAN
- Mengetahui bagian-bagian mikroskop cahaya
- Mampu menggunakan mikroskop dengan baik dan benar

B. TINJAUAN PUSTAKA
Mikroskop digunakan untuk memperbesar gambaran dari benda yang terlalu kecil untuk
dilihat dengan mata telanjang. Kata mikroskop berasal dari bahasa Latin, yaitu micro berarti
kecil dan scopium berarti penglihatan. Ilmuan yang mendasari ditemukannya mikroskop
adalah Robert Hooke yang lahir di Inggris 18 Juli 1632. Dia adalah ilmuan yang
memperkenalkan dinding sel pertama kali pada tahun 1665 ketika ia mengamati sel-sel mati
pepagan pohon ek dengan mikroskop. Namun diperlukan lensa hebat buatan Antoni van
Leeuwenhoek untuk memvisualisasikan sel hidup. Berdasarkan metode kerjanya, ada dua
jenis mikroskop, yaitu mikroskop optik (mikroskop biologi dan mikroskop stereo) dan
mikroskop elektron. Mikroskop optik menggunakan cahaya yang dilewatkan pada lensa
objektif dan lensa okuler untuk menghasilkan bayangan yang diperbesar dari preparat.
Mikroskop elektron menggunakan elektron yang membesarkan benda. Kemampuan
memperbesar bayangan pada mikroskop elektron jauh lebih besar dari pada mikroskop optik.
Cara kerja dari mikroskop optic adalah dari cahaya lampu yang dibiaskan oleh lensa
condenser, setelah melewati lensa kondenser sinar mengenai spesimen dan diteruskan oleh
lensa objektif. Lensa objektif ini merupakan bagian yang paling penting dari mikroskop
karena dari lensa ini dapat diketahui perbesaran yang dilakukan mikroskop. Sinar yang
diteruskan oleh lensa objektif ditangkap oleh lensa okuler dan diteruskan pada mata atau
kamera. Pada mikroskop ini mempunyai batasan perbesaran yaitu dari 400 X sampai 1400 X.

1
Bagian-bagian mikroskop

Fungsi bagian-bagian mikroskop

 Lensa okuler → Untuk memperbesar gambar objek dari lensa objektif sehingga terlihat
oleh mata
 Tabung mikroskop (badan mikroskop) → Bagian yang menghubungkan lensa objektif dan
lensa okuler
 Revolver → Mengatur lensa objektif yang akan dipakai
 Lensa objektif → Untuk memperbesar objek yang diamati agar terlihat oleh lensa okuler
 Meja mikroskop → Tempat meletakkan objek yang akan diamati
 Klip/penjepit → Menjepit objek agar tidak bergeser saat diamati
 Kaki mikroskop → Sebagai alas atau tempat bertumpunya mikroskop
 Cermin → Menerima cahaya dan memantulkannya kearah objek pengamatan
 Diafragma→ Mengatur banyaknya cahaya yang masuk ke lensa
 Lengan → Untuk memegang, mengangkat dan memindahkan mikroskop
 Mikrometer → untuk memperoleh fokus yang lebih tepat atau bayangan atau gambar yang
paling jelas

2
  Makrometer → mengatur fokus dengan menggerakkan tabung okuler sehingga diperoleh
bayangan atau gambar yang jelas

C. ALAT DAN BAHAN

- Mikroskop optik
- Preparat yoghurt
- Object Glass
- Cover Glass
- Cotton Bud
- Air
D. PROSEDUR KERJA
1. Menyiapkan mikroskop
 Ambil mikroskop dari lemari penyimpanan dengan cara tangan kanan memegang lengan
mikroskop dan tangan kiri menumpu bagian bawahnya (kaki mikroskop)
 Mikroskop dibawa dengan posisi tegak
 Letakkan mikroskop di atas meja yang kokoh
 Periksa mikroskop, yang terdiri dari kelengkapan bagian-bagiannya, dalam keadaan bersih
dan tidak rusak
 Lensa-lensanya harus bebas debu, air dan minyak (untuk membersihkannya gunakan kertas
lensa)

Gambar cara memegang mikroskop yang benar

3
2. Mengatur penyinaran
 Aturlah cermin, sehingga mendapatkan cahaya yang betul
 Untuk mikroskop yang dilengkapi dengan kondensor (untuk mengatur atau mengumpulkan
cahaya), pengumpulan cahaya dapat diatur dengan memutar bonggol pengatur kondesor
 Untuk mikroskop yang tidak dilengkapi dengan kondensor pengaturan cahaya dilakukan
dengan memutar diafragmanya
3. Mengatur lensa
 Gunakan lensa objektif terlemah
 Pasang preparat di atas meja mikroskop dengan cara menjepitnya, atur preparat hingga
bagian yang ingin diamati kira-kira di bawah lensa objektif
 Sambil melihat melalui lensa okuler, putar makrometer secara perlahan-lahan hingga
banyangan objek yang diamati terlihat jelas. Untuk memperjelas lagi, gunakan mikrometer
 Atur cahaya dengan lever diafragma (keeping pemutar)
 Pindahkan objek yang akan diamati hingga di tengan lapangan pemandangan dengan cara
menggeserkan kaca objek
4. Mengganti perbesaran
 Putar lensa objektif sesuai dengan yang diinginkan perbesarannya hingga terdengar bunyi
klik
 Atur kembali diafragmanya
5. Menyimpan mikroskop
 Naikkan makrometer, lepaskan preparat
 Posisikan lensa objektif terlemah
 Tegakkan lengan mikroskop
 Mikroskop siap disimpan
6. Penggunaan Kaca Benda dan Kaca Penutup pada Pengamatan Preparat
 Sediakan kaca benda dan kaca penutup
 Teteskan reagen di atas kaca benda, kemudian letakkan preparat di atas kaca benda. Tutup
preparat menggunakan kaca penutup secara perlahan dengan membentuk sudut 45 derajat
pada salah satu sisi kaca benda.

4
 Gambar Teknik penggunaan kaca benda dan kaca penutup

E. HASIL PENGAMATAN
1. Gambarlah mikroskop beserta bagian-bagiannya !
2. Gambarlah hasil pengamatan yang kalian amati dibawah mikroskop!

F. PERTANYAAN
1. Dalam mikrobiologi, jelaskan penggunaan mikroskop!
2. Sebutkan jenis-jenis mikroskop!
3. Pada perbesaran berapa, mikroorganisme dapat terlihat di mikroskop?
4. Bagaimanakh cara kerja mikroskop?

5
 PRAKTIKUM II
PENGENALAN ALAT-ALAT PRAKTIKUM

A. TUJUAN:
-Mengetahui alat-alat yang digunakan pada praktikum Mikrobiologi beserta fungsinya
masing-masing.

B. TINJAUAN PUSTAKA:
Alat-Alat Laboratorium Mikrobiologi
Beberapa alat yang digunakan dalam kegiatan mikrobiologi di laboratorium adalah sebagai berikut
(Syulasmi dkk.,2011; Anonim (a), 2016:21) :
1. Jarum inokulasi dan lup inokulasi/ose
Jarum inokulasi digunakan untuk untuk menanam mikroba dengan cara tusukan. Sedangkan
lup inokulasi/ose digunakan untuk menanam mikroba dengan cara goresan/streak. Sebelum
dan sesudah digunakan, jarum/lup inokulasi harus disterilkan terlebih dahulu dengan cara:
panaskan jarum/lup inokulasi di atas pembakar bunsen dari bawah ke atas sampai seluruh
kawatnya pijar. Biasakanlah untuk memanaskan ujung jarum/lup inokulasi di dalam kerucut
api sebelah dalam yang berwarna biru ( lebih dingin dari kerucut api sebelah luar) selama 1-2
detik pertama agar terhindar dari percikan. Biarkan jarum/lup inokulasi mendingin selama ±
30 detik sebelum dipakai untuk mencegah matinya mikroorganisme yang akan dipindahkan.
Setelah selesai dipakai, jarum/lup inokulasi harus dipijarkan pada bagian ujung (bagian yang
terkena mikroorganisme) di atas pembakar bunsen, kemudian tunggu sampai kawat yang
berpijar tidak memijar kembali (tidak berwarna merah), selanjutnya jarum/lup inokulasi aman
untuk dimasukkan ke dalam alkohol 70%.
2. Batang bengkok/spreader/batang Drigalsky
Digunakan untuk menanam mikroba dengan cara sebar/pulasan/spread. Sebelum dan setelah
digunakan rendam di dalam alkohol 70%.
3. Autoklaf
Digunakan untuk sterilisasi alat/bahan/media tertentu dengan menggunakan uap air bertekanan
tinggi pada suhu 121ºC selama 15-20 menit. Dalam melakukan sterilisasi dengan
menggunakan autoklaf hal-hal yang perlu diperhatikan adalah:

6
 - sterilisasi tergantung pada uap, karena itu udara harus dikosongkan betul betul dari ruang
sterilisasi
- semua bahan yang disterilkan harus terkena uap
- bahan-bahan yang berpori atau yang berbentuk cair harus permeable terhadap uap
- untuk yang berbahan cair, masukkan cairan sesuai batas dalam botol/tabung/erlenmeyer,
jangan diisi penuh
- pastikan tekanan pada jarum sudah menunjukkan angka nol sebelum autoklaf dibuka untuk
menghindari kecelakaan akibat tekanan yang terlalu tinggi
- gunakan plastik yang tahan panas ketika membungkus alat/bahan/media.
4. Microbiological Safety Cabinet (MSC) merupakan ruang/lemari tempat menanam mikroba.
5. Colony counter untuk menghitung jumlah koloni mikroba.
6. Mikroskop
Digunakan untuk pemeriksaan suatu sediaan secara mikroskopis atau untuk memperbesar
pandangan sehingga objek dapat dilihat dengan jelas. Untuk mengamati bakteri, gunakanlah
pembesaran kuat dengan memakai lensa objektif perbesaran 100x dan pakailah minyak imersi.
7. Inkubator
Digunakan untuk inkubasi media yang telah ditanami mikroba agar mikroba dapat tumbuh
secara optimal dan untuk menyimpan mikroorganisme untuk tujuan tertentu.
8. Lemari pendingin/refrigerator
Digunakan untuk menyimpan media steril yang siap pakai agar isi dan mutu media tersebut
tidak berubah, menyimpan untuk sementara waktu bahan/spesimen yang belum sempat
diperiksa agar tidak mengalami perubahan dan menyimpan cakram antibiotik/antibiotic disk
yang belum dipakai agar tidak mengalami perubahan.
9. Pembakar bunsen
Digunakan untuk memanaskan dan mensterilkan alat seperti jarum/lup inokulasi dan batang
bengkok.
10. Mikropipet dan tip
Digunakan untuk mengambil cairan yang volumenya tepat sesuai dengan volume yang tertera
pada pipetnya. Terdapat berbagai volume maksimal yang dapat diambil oleh mikropipet seperti
mikropipet 1000µL untuk mengambil cairan maksimal 1000 µL (1 mL) dan 100 µL untuk
mengambil cairan maksimal 100 µL (0,1 mL).

7
11. Hotplate stirrer digunakan untuk mecampur dan memanaskan medium/ bahan.
12. pH meter
Digunakan untuk mengukur pH medium pertumbuhan mikroorganisme atau suatu larutan agar
sesuai dengan pH yang diinginkan. Sebelum digunakan, pH meter dikalibrasi dengan
mencelupkan dalam larutan buffer. Sebelum dan sesudah dipakai, pH meter harus disemprot
secara hati hati dengan menggunakan aquades.
13. Alat-alat lain yang perlu diketahui di laboratorium mikrobiologi: haemositometer, cawan petri,
kaca obyek, kaca obyek cekung, kaca penutup, oven, shaker incubator, pinset, gelas arloji,
disk blank, disk antibiotik, filter bakteri, tabung Durham, tabung reaksi, beaker glass,
erlenmeyer, pipet tetes, pipet gondok (volumetrik), termometer, gelas ukur.

C. ALAT:
1. Jarum ose 12. Pembakar spirtus
2. Batang bengkok/Drigalsky 13. Gelas benda
3. Jarum inokulasi 14. Gelas penutup
4. Autoklaf 15. Oven
5. Colony counter 16. Shaker
6. Mikroskop 17. Hot plate stirrer
7. Inkubator 18. Pinset
8. Timbangan analitik 19. Gelas arloji
9. Lemari pendingin/refrigerator 20. Tabung reaksi
10. Mikropipet 21. Rak tabung reaksi
11. Cawan petri

D. PROSEDUR KERJA:
Simulasi/demo alat dan penjelasan mengenai cara kerja, fungsi alat, dan teknik aseptik.

E. HASIL PENGAMATAN:
Buatlah tabel yang berisikan gambar dari alat-alat yang telah ditunjukkan dalam praktikum ini.
Jelaskan fungsinya masing-masing.

8
F. PERTANYAAN
1. Bagaimana prinsip kerja dari alat autoklaf? Jelaskan bagaimana proses penggunaan autoklaf
dari awal sampai akhir pemakaian!

9
 PRAKTIKUM III
TEKNIK ASEPTIK DAN STERILISASI
A. TUJUAN:
- Memahami teknik-teknik sterilisasi.
- Menerapkan prinsip-prinsip dasar teknik aseptik ketika bekerja di Laboratorium.

B. TINJAUAN PUSTAKA:
Teknik Aseptik
Teknik aseptik merupakan metode pertama yang dipelajari oleh orang-orang yang berkecimpung
dalam bidang Mikrobiologi. Pada prinsipnya teknik aseptik adalah usaha menghindarkan setiap
kontak antara kultur murni (“pure culture”), medium steril dan semua wadah steril serta permukaan
meja kerja, dengan mikroorganisme kontaminan/ kompetitor (mikroorganisme yang tidak
diinginkan). Teknik aseptik dibutuhkan misalnya, pada saat melakukan kultivasi mikroorganisme
dan pemindahan (transfer) kultur murni dari satu vessel (mis. tabung reaksi) ke tabung reaksi yang
lain. Teknik aseptik harus ditegakkan untuk mencegah terjadinya kontaminasi oleh
mikroorganisme “kompetitor” pada kultur mikroba (murni) yang digunakan dalam suatu
eksperimen serta pada media dan peralatan yang sudah steril. Ancaman kontaminasi
mikroorganisme “kompetitor” selalu ada (mungkin terjadi) karena mikroorganisme terdapat
dimana-mana dan karena ukurannya kecil maka mudah tersebar melalui udara dan mudah
ditemukan pada berbagai permukaan peralatan laboratorium dan media pertumbuhan
mikroorganisme. Oleh karena itu, penguasaan akan teknik aseptik sangat diperlukan untuk
mendukung keberhasilan eksperimen (praktikum) di Laboratorium Mikrobiologi. Prinsip-prinsip
dasar teknik aseptik yang harus ditegakkan adalah:
1. Media pertumbuhan dalam wadah (mis. erlenmeyer atau tabung reaksi) harus disterilisasi
segera setelah dibuat.
2. Wadah dan alat (mis. petridish, jarum ose, tip pipet) serta aquades yang akan digunakan untuk
kultivasi mikroorganisme sebaiknya dibungkus dan kemudian disterilkan terlebih dahulu
sebelum digunakan.
3. Area kerja atau meja kerja harus disterilkan dahulu sebelum dipakai dan selalu dijaga
sterilitasnya sepanjang pemakaiannya (misalnya, tidak meletakkan ose dan tip pipet yang telah
digunakan untuk kultivasi maupun transfer mikroorganisme, di atas meja kerja. Jarum ose

10
 harus disterilkan kembali (dengan dibakar pada nyala api Bunsen) sebelum diletakkan di
tempatnya dan tip pipet bekas pakai harus diletakkan dalam larutan disinfektan/ alkohol).
4. Tangan selalu disemprot dengan alkohol 70% sebelum dan setelah bekerja.
5. Mulut tabung reaksi dan penutupnya harus selalu dipanaskan dahulu sebelum maupun sesudah
transfer ataupun kultivasi mikroorganisme. Tutup/sumbat tabung kultur tidak boleh diletakkan
di atas meja kerja untuk mencegah kontaminasi antara tabung reaksi kultur dan meja kerja.
6. Biasakan untuk memisahkan (mengkategorikan) segala macam peralatan dan medium antara
yang steril dan terkontaminasi agar pekerjaan berjalan lancar.
7. Transfer kultur dan kultivasi mikroorganisme harus dilakukan di dekat nyala api Bunsen pada
meja kerja yang sudah disterilkan atau dalam Laminar-Air Flow Cabinet (Rakhmawati dkk.,
2011: 2-3).

Gambar 2. Cara memanaskan tabung reaksi yang berisi isolat mikroba

(Sumber : Grainger dkk., 2001)

11
 Sterilisasi
Sterilisasi merupakan proses destruksi atau penghilangan mikroba yang hidup. Obyek yeng
terbebas dari kehidupan mikroba disebut steril. Sterilisasi merupakan salah satu cara untuk
mengontrol mikroba, sedang cara yang lain adalah dengan menghambat pertumbuhan mikroba.
Namun sterilisasi berbeda dengan cara yang kedua, dalam hal, bahwa pada sterilisasi seluruh
mikroba yang ada dimatikan atau dihilangkan dan obyek menjadi steril (Cappuccino dan Sherman,
1983). Metode sterilisasi dipilih berdasarkan bahan atau material yang akan digunakan, jenis
mikroba yang terlibat, dan tujuan dari sterilisasi itu sendiri (Gunasekaran, 2005). Pada prinsipnya
sterilisasi dapat dilakukan dengan 3 cara yaitu secara mekanik, fisik dan kimiawi.
1. Sterilisai secara mekanik (filtrasi) menggunakan suatu saringan yang berpori sangat kecil (0.22
mikron atau 0.45 mikron), sehingga mikroba tertahan pada saringan tersebut. Proses ini
ditujukan untuk sterilisasi bahan yang peka panas, misalnya larutan enzim dan antibiotik.
2. Sterilisasi secara fisik dapat dilakukan dengan pemanasan & penyinaran.
a. Pemanasan
1) Pemijaran (dengan api langsung): membakar alat pada api secara langsung, contoh alat :
jarum inokulum, pinset, batang L, dll.
2) Panas kering: sterilisasi dengan oven kira-kira 60-180ºC. Sterilisasi panas kering cocok
untuk alat yang terbuat dari kaca misalnya erlenmeyer, tabung reaksi dll.
3) Uap air panas: konsep ini mirip dengan mengukus. Bahan yang mengandung air lebih tepat
menggungakan metode ini supaya tidak terjadi dehidrasi.
4) Uap air panas bertekanan : menggunakan autoklaf
b. Penyinaran dengan UV
Sinar Ultra Violet juga dapat digunakan untuk proses sterilisasi, misalnya untuk membunuh
mikroba yang menempel pada permukaan interior Microbial Safety Cabinet atau Laminar Air
Flow dengan disinari lampu UV
3. Sterilisaisi secara kimiawi biasanya menggunakan senyawa desinfektan, antara lain alkohol
(Hafsan dkk., 2015: 19-20).

D. PROSEDUR KERJA:
Simulasi teknik aseptic dan sterilisasi

12
E. HASIL PENGAMATAN:
Buatlah tabel yang berisikan gambar dari alat-alat yang telah ditunjukkan dalam praktikum ini.
Jelaskan fungsinya masing-masing.

F. PERTANYAAN
1. Mengapa sebelum dipakai, jarum/lup inokulasi harus dipijarkan di atas pembakar spirtus?
2. Sebutkan keunggulan sterilisasi menggunakan autoklaf !
3. Apa fungsi dari alkohol 70% dalam kegiatan kerja di laboratorium mikrobiologi?

13
 PRAKTIKUM IV
PEMBUATAN MEDIA
A. TUJUAN
- Memilih dan membuat media pertumbuhan mikroorganisme.
B. TINJAUAN PUSTAKA
Pembuatan Media
Media adalah suatu bahan yang digunakan untuk menumbuhkan mikroba yang terdiri atas
campuran nutrisi atau zat-zat makanan. Selain untuk menumbuhkan mikroba, media dapat juga
digunakan untuk isolasi, memperbanyak, pengujian sifat-sifat fisiologis dan perhitungan jumlah
mikroba (Lay, 1994; Jutono, dkk., 1980). Syarat media yang baik untuk pertumbuhan mikroba
adalah lingkungan kehidupannya harus sesuai dengan lingkungan pertumbuhan mikroba tersebut,
yaitu: harus mengandung semua nutrisi yang mudah digunakan oleh mikroba, harus mempunyai
tekanan osmose, tegangan muka, dan pH yang sesuai, harus steril, dan tidak mengandung zat-zat
penghambat. Medium dapat diklasifikasikan berdasar atas susunan kimia, konsistensi, dan
fungsinya (Saparianti, dkk., 2014: 16-17).
Klasifikasi medium berdasar susunan kimia:
1. Medium anorganik yaitu medium yang tersusun dari bahan-bahan anorganik.
2. Medium organik yaitu medium yang tersusun dari bahan-bahan organik.
3. Medium sintetik yaitu medium yang susunan kimianya dapat diketahui dengan pasti; medium
ini biasanya digunakan untuk mempelajari kebutuhan makanan mikroba.
4. Medium non sintetik yaitu medium yang susunan kimianya tidak dapat ditentukan dengan
pasti, medium ini banyak digunakan untuk menumbuhkan dan mempelajari taksonomi
mikroba.
Klasifikasi medium berdasarkan konsistensinya (Cappuccino dan Sherman, 1983):
1. Medium cair (liquid medium) yaitu medium yang berbentuk cair.
2. Medium padat (solid medium) yaitu medium yang berbentuk padat karena mengandung bahan
pembentuk gel yang berupa agar. Untuk membentuk medium yang padat diperlukan agar
sebesar 1,5-1,8 %. Berdasarkan atas keperluannya medium ini dapat dibuat tegak atau miring
(misalnya medium agar tegak, medium agar miring)

14
3. Medium padat yang dapat dicairkan (semi solid medium) yaitu medium yang dalam keadaan
panas (dipanasi) berbentuk cair tetapi dalam keadaan dingin berbentuk padat. Medium ini
mengandung agar-agar atau gelatin kurang dari 1%.
Klasifikasi medium berdasarkan fungsinya (Saparianti, dkk., 2014: 1-18):
1. Medium diperkaya (enriched medium), yaitu medium yang ditambah zat-zat tertentu
misalnya (serum, darah, ekstrak tumbuh-tumbuhan dan lain-lain), sehingga dapat digunakan
untuk menumbuhkan mikroba heterotrof tertentu.
2. Medium selektif (selektive medium), yaitu medium yang ditambah zat kimia tertentu yang
bersifat selektif untuk mencegah pertumbuhan mikroba lain, misalnya medium yang
mengandung kristal violet pada kadar tertentu dapat mencegah pertumbuhan bakteri Gram
positif tanpa mempengaruhi bakteri Gram negatif.
3. Medium diferensial (differensial medium), yaitu medium yang ditambah reagensia atau zat
kimia tertentu yang menyebabkan suatu mikroba membentuk pertumbuhan atau mengadakan
perubahan tertentu sehingga dapat untuk membedakan bakteri himolitik dan non himolitik.
4. Medium penguji (assay medium), yaitu medium dengan susunan tertentu yang digunakan
untuk pengujian vitamin-vitamin, asam-asam amino, antibiotik dan lain-lain.
5. Medium untuk perhitungan jumlah mikroba, yaitu medium spesifik yang digunakan untuk
menghitung jumlah mikroba dalam suatu bahan misalnya medium untuk menghitung jumlah
bakteri Actinomycetes dan lain-lain.
6. Medium khusus, yaitu medium untuk menentukan tipe pertumbuhan mikroba dan
kemampuannya untuk mengadakan perubahan-perubahan kimia tertentu..

Komposisi dan Pembuatan Nutrient Agar dan Nutrient Broth

1. Pembuatan Nutrient Agar (NA)
a. Timbang komponen medium dengan menggunakan timbangan analitik untuk volume yang
diinginkan sesuai dengan komposisi berikut:
- Beefextract 3 g
- Peptone 10 g
- NaCl 5 g
- Agar 15 g
- Aquades s.d 1000 ml

15
b. Larutkan beefextract, peptone, dan NaCl dengan aquades di dalam beaker glass dan diaduk
dengan batang pengaduk atau menggunakan hot plate stirrer sampai homogen.
c. Ukur pH medium menggunakan alat pH meter, medium NA memiliki pH 6,8-7,3. Jika pH belum
sesuai maka pH bisa diturunkan dengan menambahkan larutan asam (HCL) atau pH dinaikkan
dengan menambahkan larutan basa (NaOH). Pengukuran pH dilakukan sebelum penambahan agar
supaya alat pH meter tidak mengalami kerusakan.
d. Tambahkan agar ke dalam campuran media dan diaduk secara konstan dan diberi panas. Dapat
menggunakan kompor gas atau hot plate stirrer (jangan sampai overheat, karena akan terbentuk
busa dan memuai sehingga tumpah).
e. Setelah itu media dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer dan disterilisasi dengan autoklaf.
f. Tuang media steril ke dalam cawan petri steril secara aseptis. Jika diinginkan media miring maka
media langsung dituang ke dalam tabung kemudian disterilisasi, setelah disterilisasi, tempatkan
tabung reaksi yang berisi media dalam tempat/wadah yang miring, kemudian diamkan sampai
media mengeras. Media dapat dipakai satu hari setelah sterilisasi dan diletakkan secara terbalik
pada ruang penyimpanan (media dalam cawan petri) untuk menghindari uap dalam cawan petri
membasahi medium agar mengurangi kontaminasi pada media.
2. Pembuatan Nutrient Broth (NB)
Komposisi untuk media NB sama dengan NA, tetapi tidak memakai agar sebagai pemadat. (Hafsan
dkk.,2015: 16-18; Syulasmi dkk., 2011).

C. ALAT DAN BAHAN

1. Media Nutrient Agar (NA) (Oxoid) 10. Erlenmeyer
2. Aquades 11. Hot plate stirrer
3. Cawan petri 12. Botol jar
4. Tabung reaksi 13. Plastik tahan panas dan karet gelang
5. Rak tabung reaksi 14. Aluminium foil
6. Timbangan analitik 15. Kertas HVS bekas
7. Mikropipet dan tip 0,1 ml dan 1 ml 16. Plastik wrap
8. Media Nutrient Broth (NB) 17. Gelas ukur
9. Kertas saring 18. Beaker glass

16
D. PROSEDUR KERJA:
1. Sterlisasi Alat dan Media
a. Masing-masing kelompok membuat :
- Penutup tabung reaksi dari kapas dan kasa steril.
- 9 mL aquades yang dimasukkan ke dalam 10 tabung reaksi.
- Cawan petri sebanyak 20 buah yang dibungkus dengan kertas HVS bekas.
- Cakram dari kertas saring dengan diameter 0,6 cm sebanyak 15 buah.
b. Untuk dipakai bersama seluruh kelompok, perwakilan kelompok membuat :
- Tip mikropipet 1 mL sebanyak 40 buah dan tip 0,1 mL sebanyak 10 buah dimasukkan ke
dalam botol jar.
- 100 mL NB yang dimasukkan ke dalam Erlenmeyer.
- NA sebanyak 2 L dan dimasukkan ke dalam 10 Erlenmeyer 250 mL masing-masing
sebanyak 200 mL.
- 9 mL NA yang dimasukkan dalam 10 tabung reaksi.
c. Bungkus semua alat dan bahan dengan plastik tahan panas kemudian ikatlah dengan karet
gelang dan masukkan ke dalam keranjang autokalf.

2. Pembuatan Media Kultur

a. Timbang media NA (Oxoid) sesuai prosedur di kemasan. Penimbangan media dilakukan
secara teliti dan cepat, kemudian serbuk media dimasukkan secara hati-hati ke dalam Beaker
glass.
b. Tambahkan aquades dan aduk sampai merata dengan batang pengaduk. Panaskan dengan hati-
hati menggunakan hotplate sampai media tercampur homogen (ditunjukkan dengan warna
yang kuning jernih). Perhatian: pada saat pemanasan jangan sampai terbentuk buih
berlebihan sampai meluap!
c. Pindahkan media dalam Beaker glass kedalam Erlenmeyer, tutup dengan aluminium foil
kemudian plastik, selanjutnya diikat dengan karet.
d. Sterilkan seluruh media dan alat tersebut dengan menggunakan autoklaf selama 15 menit.

17
Setelah alat dan media disterilkan, perwakilan kelompok mengerjakan:
a. Mengeluarkan alat dan media dari autoklaf, dan menyusun rapi di meja.
b. Menuangkan NA dalam Erlenmeyer ke dalam cawan petri steril sebanyak 50 buah dan diwrap
menggunakan plastik wrap.
c. Meletakkan NA dalam tabung reaksi dalam keadaan miring.

E. PERTANYAAN
1. Mengapa dalam pembuatan media perlu dilakukan pengukuran pH?
2. Jelaskan syarat apa sajakah yang harus dipenuhi dalam pembuatan media yang baik!

18
 PRAKTIKUM V
ISOLASI KULTUR CAMPURAN MIKROBA, MENGHITUNG JUMLAH KOLONI
DAN KARAKTERISASI KOLONI BAKTERI

A. TUJUAN:
- Melakukan isolasi kultur campuran mikroba dari alam.
- Menghitung jumlah koloi bakteri.
- Mengenali bentuk dan koloni bakteri.

B. TINJAUAN PUSTAKA:
Isolasi Kultur Campuran Mikroba
Di alam populasi mikroba tidak terpisah sendiri (segregasi) menurut jenisnya, tetapi berada (exist)
dari populasi campuran berbagai macam sel. Di dalam laboratorium populasi bakteri ini dapat
menjadi sumber penyediaan kultur murni yang diperoleh melalui isolasi. Kultur mikroba dibiakkan
dengan cara menginokulasikan pada agar cawan, dimana penyebaran kultur dilakukan dengan
goresan di atas agar. Tujuan penyebaran kultur adalah untuk memisahkan sel-sel mikroba satu
dengan yang lain, sehingga setelah inkubasi masing-masing sel akan tumbuh dan berkembang biak
membentuk kumpulan sel atau koloni yang terpisah dan dapat terlihat oleh mata (Sumbali dan
Mehrotra, 2009). Macam-macam cara mengisolasi dan menanam mikroba adalah: 1). Spread plate
method (cara tebar/sebar), 2). Streak plate method (cara gores), 3). Pour plate method (cara tabur).
a. Spread Plate Method (Cara Tebar/Sebar)
Teknik spread plate merupakan teknik isolasi mikroba dengan cara menginokulasi kultur mikroba
secara pulasan/sebaran di permukaan media agar yang telah memadat agar diperoleh kultur murni.
Metode ini dilakukan dengan mengencerkan biakan kultur mikroba. Karena konsentrasi sel-sel
mikroba pada umumnya tidak diketahui, maka pengenceran perlu dilakukan beberapa tahap,
sehingga sekurang-kurangnya ada satu dari pengenceran itu yang mengandung koloni terpisah (30-
300 koloni). Koloni mikrobia yang terpisah memungkinkan koloni tersebut dapat dihitung.

b. Pour Plate Method (Cara Tabur)

Cara ini dasarnya ialah menginokulasi medium agar yang sedang mencair pada temperatur 45-
50ºC dengan suspensi bahan yang mengandung mikroba, dan menuangkannya ke dalam cawan

19
petri steril. Hal ini akan menyebarkan sel-sel bakteri tidak hanya pada permukaan agar saja
melainkan sel terendam agar (di dalam agar), sehingga terdapat sel yang tumbuh dipermukaan agar
yang kaya O2 dan ada yang tumbuh di dalam agar yang tidak banyak begitu banyak mengandung
oksigen. Setelah inkubasi akan terlihat koloni-koloni yang tersebar di permukaan agar yang
mungkin berasal dari 1 sel bakteri, sehingga dapat diisolasi lebih lanjut (Jutono, dkk.,
1980).

c. Streak Plate Method (Cara Gores)

Cara gores umumnya digunakan untuk mengisolasi koloni mikroba pada cawan agar, sehingga
didapatkan koloni terpisah dan merupakan biakan murni atau meremajakan kultur ke dalam
medium baru. Cara ini dasarnya ialah menggoreskan suspensi bahan yang mengandung mikroba
pada permukaan medium agar yang sesuai pada cawan petri. Setelah inkubasi maka pada bekas
goresan akan tumbuh koloni-koloni terpisah yang mungkin berasal dari 1 sel mikroba, sehingga
dapat diisolasi lebih lanjut (Jutono, dkk., 1980). Penggoresan yang sempurna akan menghasilkan
koloni yang terpisah. Bakteri yang memiliki flagella seringkali membentuk koloni yang menyebar
terutama bila digunakan lempengan yang basah. Untuk mencegah hal itu harus digunakan
lempengan agar yang benar-benar kering permukaannya (Lay, 1994).

Perhitungan Jumlah Koloni Bakteri

Mikroorganisme adalah makhluk hidup yang kosmopolit, terdapat di mana-mana. Keberadaan dan
besarnya populasi mikroorganisme sangat penting diketahui dan dipelajari karena besarnya
populasi mikroorganisme dapat menentukan kualitas produk, menentukan tata guna sumber daya,
dan lain-lain (Syulasmi dkk, 2011). Jumlah total mikroorganisme dalam sediaan farmasi seperti
obat perlu dihitung untuk menentukan batas kontaminan maksimal jumlah bakteri yang ada dalam
sediaan farmasi tersebut, baik yang diperoleh dari bahan alam maupun sintetis (Wibowo, 2017).
Menghitung jumlah total tanpa merinci kelompok atau jenis disebut enumerasi. Metoda yang
digunakan untuk menghitung jumlah mikroorganisme bermacam-macam, antara lain :
1. Hitung mikroskopik (direct microscopic count) menggunakan hemasitometer,
2. Turbidimetri (uji kekeruhan) menggunakan spectrophotometer,
3. Hitung cawan (plate count). Metode Hitung cawan digunakan untuk mengetahui perkiraan
jumlah sel yng hidup, yaitu melalui penanaman suspensi pada agar. Prinsip metode hitung

20
 adalah jika sel mikroba yang masih hidup ditumbuhkan pada media agar, maka sel mikroba
itu akan berbiak membentuk koloni yang dapat dilihat dan dihitung dengan mata telanjang,
dan disebut dengan “colony forming unit” = cfu. Pada metode hitung cawan, cawan yang
dipilih untuk perhitungan koloni ialah yang mengandung 30-300 koloni. Metode hitungan
cawan ada dua yeitu metode tuang (pour plate) dan metode permukaan (surface/spread plate)
(Syulasmi dkk., 2011; Anonim, 2016(b):23).

Karakterisasi Koloni Bakteri

Pengamatan Morfologi mikroba merupakan tindakan pertama kali jika ingin mempelajari suatu
jenis bakteri lebih lanjut, khususnya untuk tujuan identifikasi. Setelah mendapatkan kultur murni
maka biakan yang diinginkan ditumbuhkan ke berbagai bentuk media untuk dikenali ciri
koloninya. Ciri koloni yang diamati berupa ukuran, pigmentasi, bentuk tepi, elevasi dan
pertumbuhan pada media cair (Hafsan dkk., 2015: 42-45).

C. ALAT DAN BAHAN

1. Tabung reaksi
2. Media NA dalam cawan petri
3. Batang bengkok/Drigalsky
4. Mikropipet dan tip 0,1 ml dan 1,0ml
5. Jarum ose
6. Pembakar spiritus
7. Korek api
8. Sprayer berisi alkohol 70%
9. Plastik wrap
10. Air bekas cucian piring penjual makanan
11. Kertas label/spidol marker kecil
12. Aquades dalam tabung reaksi
13. Inkubator
14. Vorteks

21
D. PROSEDUR KERJA
Isolasi Biakan Murni dan Perhitungan Jumlah Bakteri

Gambar 3. Cara pengerjaan metode hitung cawan tuang

1. Sediakan 6 tabung reaksi, masing-masing berisi 9 mL aquades steril, letakkan secara berurutan
dan beri tanda 1 s/d 6.
2. Buatlah pengenceran dari sampel yang akan diperiksa mulai dari pengenceran 10 -1, 10-2, 10-3,
10-4, 10-5, 10-6 dengan cara memasukkan 1 mL sampel (air dari cucian piring bekas makanan
penjual nasi kuing/bakso/dll) ke dalam tabung reaksi pertama kemudian kocok (dapat
menggunakan vorteks) maka konsentrasi larutan menjadi10 -1 Kemudian pipet 1 mL larutan
dari tabung pertama masukkan ke tabung kedua dan kocok sampai homogen, konsentrasi
menjadi 10-2 demikian seterusnya sampai tabung ke-6.
3. Sediakan 4 cawan petri steril, letakkan berurutan dan beri tanda 10 -3, 10-4, 10-5, 10-6 dengan
spidol/kertas label.
4. Ambil larutan dari tabung ke-3,4,5, dan 6 masing-masing 1 mL dengan menggunakan
mikropipet dan tip dan masukkan ke dalam cawan petri steril yang sudah diberi tanda.
5. Siapkan medium NA cair dengan suhu 40 ºC - 45ºC dan masukkan kedalam cawan petri yang
sudah berisi larutan sampel, goyangkan hingga homogen dengan cara memutar cawan petri
searah jarum jam dan berlawanan arah jarum jam di atas meja (membentuk angka 8), biarkan
hingga dingin dan mengeras (sama halnya ketika akan mengisolasi menggunakan metode pour
plate).

22
6. Tutup pinggiran cawan petri menggunakan plastik wrap, dan inkubasikan pada suhu 22ºC - 37
ºC selama 24-48 jam di dalam inkubator.

7. Hitung jumlah koloni bakteri / ml sampel dengan rumus :

1
jumlah bakteri (cfu/mL) = 𝐽𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑘𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖 𝑥
𝑝𝑒𝑛𝑔𝑒𝑛𝑐𝑒𝑟𝑎𝑛
misal : diketahui jumlah koloni dalam cawan petri pengenceran 10-4 adalah 45 koloni maka jumlah
koloni bakteri adalah
1
22 x = 22 x 104 = 2,2 x 105 cfu/mL
10−4

(Untuk penulisan jumlah bakteri adalah satu angka di belakang koma)

Cat: perhitungan untuk jumlah koloni bakteri tiap pengenceran ditanam dalam cawan petri secara
duplo, koloni yang dapat dihitung ialah koloni yang berjumlah 30-300 koloni, cara perhitungan
yang jelas terdapat dalam LAMPIRAN

Gambar 4. Pour Plate Method

(Sumber: Anonim(a), 2016:32 )

Untuk mempelajari cara spread plate:

1. Ambil NA dalam cawan petri yang sudah memadat
2. Ambil larutan sampel/bakteri sebanyak 0,1 mL pada tabung reaksi pengenceran 10 -1
menggunakan mikropipet
3. Tuangkan di atas permukaan NA dalam cawan petri dan sebarkan menggunakan Batang L
dengan terlebih dahulu memanaskan batang L di atas pembakar spirtus.
4. Sebarkan sampai tidak terlihat lagi cairan di atas permukaan media
8. Tutup pinggiran cawan petri menggunakan plastik wrap dan inkubasikan pada suhu 22-37
selama 24-48 jam di dalam inkubator

23
 Gambar 5. Spread Plate Method
(Sumber: Anonim(a), 2016:32 )

Untuk mempelajari cara streak plate:

1. Ambil NA dalam cawan petri yang sudah memadat
2. Ambil larutan sampel/bakteri sebanyak 1 ose pada tabung reaksi pengenceran 10-1. Gores lup
inokulasi mengikuti arah seperti pada gambar
3. Tutup pinggiran cawan petri menggunakan plastik wrap dan inkubasikan pada suhu 22-37
selama 24-48 jam di dalam inkubator

Gambar 6. Streak Plate Method

(Sumber: Anonim(a), 2016:32 )

Karakteristik Koloni Bakteri

1. Ambil cawan petri yang berisi media agar NA.
2. Buka cawan petri dan salah satu anggota kelompok mengucapkan beberapa kata sambil
berhadapan dengan cawan agar terbuka dengan jarak 15 cm dari permukaan agar, kemudian
segera tutup kembali.
3. Untuk cawan petri selanjutnya, sentuhlah tangan praktikan ke atas permukaan cawan, dan
tutuplah segera.

24
4. Untuk cawan petri yang ketiga, bukalah cawan petri berisi media agar NA selama 5 menit
(kelompok 1), 10 menit (kelompok 2), 15 menit (kelompok 3), dan 20 menit (kelompok 4),
kemudian tutup kembali.
5. Semua pinggiran cawan petri di wrap menggunakan plastik wrap.
6. Ketiga cawan diinkubasikan pada suhu kamar atau ke dalam inkubator suhu 22-30ºC selama 2
x 24 jam.
7. Amati pada hari kedua, catat, serta dokumentasikan ciri-ciri koloni yang muncul.

25
 Gambar 7. Karakteristik koloni bakteri
(Sumber: Benson dalam Anonim(b) 2016:12 )

26
E. HASIL PENGAMATAN

Tabel Pengamatan 1.......................................

Jumlah koloni akhir
Jumlah koloni
Pengenceran (cfu/mL)
Ulangan 1 Ulangan 2 Rata-rata
10-3
10-4
10-5
10-6

Tabel Pengamatan 2................................................

Gambar hasil
inokulasi Penjelasan
(dokumentasi)

Metode pour plate

Metode spread plate

Metode strreak plate

Tabel Pengamatan 3......................................

No Karakteristik Sumber mikroba
Mulut Tangan Udara
1 Jumlah
2 Macam
3 Bentuk
4 Warna
5 Kenaikan
permukaan
koloni
6 Kepekatan
7 Penampakan

27
 8 Keterangan
tambahan
9 Dokumentasi

F. PERTANYAAN
1. Berapakah jumlah koloni yang muncul pada air bekas cucian piring yang Anda
temukan!Bandingkanlah dengan kelompok lain, sampel mana yang memiliki jumlah koloni
terbanyak?
2. Adakah kelemahan dari melakukan perhitungan mikroba dengan metode cawan hitung? Jika
ada jelaskan!
3. Adakah pengaruh membuka cawan dengan lamanya waktu yang berbeda-beda terhadap jumlah
atau macam koloni yang tumbuh (lihat data kelompok lain)?Jelaskan!
4. Pada perlakuan manakah koloni bakteri yang memiliki jumlah terbanyak? macam terbanyak?

28
 DAFTAR PUSTAKA

Anonim(a). 2016. Panduan Praktikum Mikrobiologi.Yogakarta: Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma.
Anonim(b). 2016. Buku Petunjuk Praktikum Mikrobiologi. Malang: UIN Maulana Malik Ibrahim.
Cappuccino, J.G. and Sherman, N. 1983. Microbiology: A Laboratory Manual. Calofornia:
Addison-Wesley Publishing Company.
Grainger, J., Hurst,J., Burdass,D. 2001. Basic Pratctical Microbiology: A manual. UK: The
Society for General Microbiology
Gunasekaran, P. 2005. Laboratory Manual in Microbiology. New Delhi: New Age International
(P) Limited, Publishers.
Hafsan, Sukmawaty,E., Masri,M. 2015. Penuntun Praktikum Mikrobiologi. Makassar: Fakultas
Sains dan Teknologi UIN Alauddin Makassar.
Jutono, dkk.. 1980. Pedoman Praktikum Mikrobiologi Umum. Yogyakarta: Departemen
Mikrobiologi, Fakultas Pertanian UGM.
Lay, B. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta: PT Raja Grafindo Persada.
Rakhmawati,A., Octavia,B., Umniyatie,S. 2011. Petunjuk Praktikum Mikrobiologi. Jurdik
Biologi FMIPA UNY.
Saparianti,E dkk. 2014. Buku Petunjuk Praktikum Mikrobiologi Umum. Malang: Fakultas
Teknologi Pertanian Universitas Brawijaya.
Sumbali, G. dan Mehrotra, R.S. 2009. Principles of Microbiology, 1 Ed. New Delhi: Tata McGrow
Hill Education Private Limited.
Syulasmi, A., Hamdiyati,Y., Kusnadi. 2011. Petunjuk Praktikum Mikrobiologi. Bandung:
Universitas Pendidikan Indonesia.
Wibowo, M.S. 2017. Standar Mikrobiologi untuk Produk Farmasi. Bandung: ITB

29