MORPHOLOGICAL, CYTOLOGICAL AND

MOLECULAR MARKER ANALYSES OF

‘TAPESTRY’ CALADIUM VARIANTS
REVEAL DIVERSE GENETIC CHANGES
AND ENABLE ASSOCIATION OF LEAF
COLORATION PATTERN LOCI WITH
MOLECULAR MARKERS
 Kelompok 3
Candra Catur Nugroho A2603211015
Ratna Sani Tambunan A2503211004
Habibi Firmansah A2503211009
Shahrizall M.A A2503211015

somaclonal variations_3
PENDAHULUAN
Pendahuluan
Salah satu jenis variasi genetik yang penting Caladium (Caladium × hortulanum Birdsey)
adalah variasi somaklonal yang diinduksi adalah tanaman hias penting yang
termasuk dalam family Araceae.
melalui kultur in vitro sel, jaringan dan organ.
Pendekatan utama untuk pengembangan
Varian somaklonal telah dilaporkan di kultivar baru caladium adalah melalui
banyak tanaman, dan dapat menunjukkan hibridisasi seksual antara kultivar komersial
dan breeding lines.
keragaman yang nyata pada karakter
morfologi, sifat fisiologis, dan ketahanan
atau toleransi terhadap stress biotik atau
abiotik.
Pendahuluan
Terdapat kesulitan dalam melakukan seleksi
terhadap karakter daun baru yang disebabkan
oleh variabilitas (keragaman) terbatas dalam
plasma nutfah saat ini. Sehingga, sumber
baru dari variasi genetik sangat dibutuhkan
dalam pemuliaan caladium.
Perubahan fenotipik pada varian somaklonal
caladium tampaknya terutama melibatkan
karakter daun (Ahmed et al. 2002, 2004;
Thepsithar et al. 2010; Thongpukdee dkk.
2010).

Sejak kultur jaringan pertama kali dilaporkan

pada caladium di tahun 1974 , sejumlah
laporan menunjukkan bahwa variasi somatik
umum terjadi pada beberapa kultivar
caladium.
Pendahuluan
Terjadinya variasi somaklonal pada caladium
tampaknya tergantung pada penggunaan
zat pengatur tumbuh, jenis eksplan dan
genotipe tanaman.
Dalam penelitian sebelumnya, Cai et al.
(2015) menerapkan teknik induksi mutasi in
vitro pada caladium dan perlakuan kultur
daun caladium 'Tapestry' dengan colchicine.

Namun, hanya sedikit varian yang dilaporkan

telah dikarakterisasi pada tingkat sitologi
atau molekuler. Kurangnya karakterisasi
sitologi dan genetik molekuler dari varian ini
telah menghambat adopsi variasi
somaklonal yang lebih luas sebagai
pendekatan baru untuk pemuliaan caladium.
Pendahuluan
Terjadi efektivitas perlakuan colchicine
untuk menggandakan kromosom caladium
dan induksi tetraploid.

Tujuan dari penelitian ini :

1. Mengevaluasi secara fenotipik varian di
antara regeneran Caladium 'Tapestry'
dengan atau tanpa perlakuan colchicine
2. Mengkarakterisasi varian secara sitologi
(kandungan DNA inti dan jumlah
kromosom) dan secara molekuler
(marka molekuler pada pola pita)
BAHAN DAN
METODE
 lanjutan

Bahan Tanaman
Kultivar komersial 'Tapestry' digunakan sebagai bahan tanam
untuk kultur jaringan.
Umbi tanaman 'Tapestry' ditanam dalam wadah plastik (diameter
15 cm) yang diisi dengan campuran tanah dan ditambah dengan
pupuk dengan dosis 5 g per wadah.
Daun yang belum dewasa/muda (sekitar 2 minggu) digunakan
sebagai eksplan untuk kultur jaringan.
Pertama, daun muda dibersihkan dengan keran air selama 30
menit, didesinfeksi dengan alkohol 70% (v/v) selama 15 detik dan
pemberian 0,5% (b/v) asam natrium dikloroisosianurat ditambah
dengan Tween 20 (1–2 tetes per 500 mL) selama 20 menit.
Setelah desinfeksi, bahan kimia yang tersisa di daun dihilangkan
dengan membilas daun tersebut dengan air steril sebanyak 3x
dengan masing-masing berlangsung setidaknya selama 15 detik.
 lanjutan

Kultur Jaringan Daun & Regenerasi

Tanaman
Tepi daun dihilangkan, lalu daun dipotong menjadi potongan daun kecil (≈
0,5cm × 0,5 cm).
Potongan daun dikultur dalam cawan petri (15 x100 mm) berisi media induksi
kalus caladium 1 (CCI-1) yang mengandung 4,43 g L−1 medium Murashige dan
Skoog (MS) komersil , 1 mg L−1 NAA, 3 mg L−1 BA, sukrosa 4% (b/v), dan agar
0,8% (b/v) (pH 5,8).
Kultur caladium direndam dalam larutan medium cair yang mengandung
colchicine dalam toples kaca yang dibungkus dengan empat hingga enam
lapisan kain hitam. kemudian diletakkan di atas shaker dengan kecepatan
rendah 50 rpm.
Setelah itu, kultur daun yang diberi colchicine, dicuci menggunakan air steril
dan kemudian dikulturkan pada media CCI-1 untuk mendorong regenerasi
tunas selama 2 bulan. Kemudian, tunas hasil regenerasi dikulturkan pada
media perkembangan plantlet 2 (PE-2) untuk menginduksi akar.
 lanjutan

Skrinning dan Karakterisasi

Morfologi Beberapa Varian
Untuk mengkonfirmasi potensi temuan baru dari varianbaru, disertakan
empat varian sebagai kontrol (CK-26, C20D6-28, C10D4-113, dan C10D4-17)
yang sebelumnya dikarakterisasi oleh Cai et al. (2015).
Menanam kembali keempat varian tersebut dan semua varian baru
berdampingan dengan wildtype tanaman 'Tapestry' di rumah kaca di bawah
kondisi yang sama.
Warna utama tulang daun, bercak daun, dan tepi daun dikarakterisasi
menggunakan colour chart Royal Horticultural Society (RHS).
Daun khas per varian digunakan untuk pengambilan data, karakterisasi
morfologi, dan deskripsi perubahan morfologi.
Hanya tanaman yang diregenerasi yang menunjukkan perubahan morfologis
yang berbeda dan stabil dari wildtype yang dicirikan sebagai varian untuk
analisis lebih lanjut.
 lanjutan

Aklimatisasi dan Pembentukan

Tanaman di Rumah Kaca
Setelah 5 bulan di kultur jaringan, planlet hasilregenerasi dipindahkan dari
toples kaca ke tray 128-sel (2,5 × 2,5 × 2,5 cm/sel) diisi dengan tanah
campuran.
Semua tray yang berisi planlet dipelihara dalam growth chamber dengan
suhu yang terkontrol antara 22 - 26 °C, tingkat cahaya konstan 150 μmol m−2
s−1 dan fotoperiode 16 jam terang dan 8 jam gelap selama 3 minggu.
Kemudian, planlet dipindahkan ke rumah kaca di bawah fotoperiode alami
dengan suhu yang terkontrol antara 20 - 29 °C.
2 bulan kemudian, tanaman caladium dipindahkan secara individual dari tray
ke wadah plastik (diameter 15 cm) yang diisi dengan campuran tanah.
 lanjutan

Perhitungan Kromosom
Ujung akar yang tumbuh (panjang ≈ 1 cm) yang mengandung jaringan
meristem dikumpulkan dari wildtype 'Tapestry' dan tanaman varian
menggunakan forsep bedah.
Untuk pra-perlakuan, ujung akar tersebut direndam dalam 0,002 M larutan 8-
hydroxyquinoline selama 3 jam dalam kondisi gelap pada suhu kamar.
Kemudian, ujung akar difiksasi dalam larutan fiksatif yang mengandung tiga
bagian metanol dan satu bagian asam asetat pada suhu 4 °C selama minimal
4 jam.
Ujung akar yang terhidrolisis dengan baik (lunak) dibilas dengan air deionisasi
3x dan kemudian diwarnai dalam larutan acetocarmine selama setidaknya 4t
jam.
Jaringan meristem dijepit di bawah kaca penutup. Preparat diperiksa di
bawah mikroskop BH-2. Preparat yang memiliki kromosom yang tersebar
dengan baik difoto di bawah mikroskop BX-41 (Olympus) menggunakan
kamera Qlympus Q-color 5 dan software Q-capture pro 7.
 lanjutan

Penentuan Kandungan DNA Inti

Kandungan DNA inti dari varian tanaman dan wildtype 'Tapestry' ditentukan
menggunakan Cyflow® Ploidy Analyzer dan protokol yang dijelaskan oleh
Doležel et al. (2007) dan dimodifikasi oleh Cao et al. (2014).
Jumlah potongan daun yang sama (≈ 0,5 × 0,5 cm) dari caladium dan gandum
hitam (sereal Secale) 'Daňkovské' dikumpulkan dan dicincang bersama dalam
1 mL buffer lisis LB01 dingin di cawan petri.
Untuk setiap sampel, 50 μL propidium iodida (1 mg mL-1) dan RNase (1 mg
mL-1) ditambahkan ke suspensi inti masing-masing untuk pewarnaan inti
dan degradasi RNA.
Setelah 5 menit inkubasi dalam gelap, sampel inti disiapkan dan dimasukkan
ke dalam flow cytometer untuk dianalisis.
 lanjutan

Analisa Marka SSR

20 varian 'Tapestry' (16 baru dan 4sebelumnya dilaporkan oleh Cai et al. (2015),
wildtype 'Tapestry', 17 tanaman regenerasi non-varian 'Tapestry', dan tujuh
kultivar caladium komersial ('Red Flash', C103, 'Big Red', 'Dr. TL Meade', 'Blaze',
'Freida Hemple' dan 'White Christimas') dianalisis dengan 22 marka SSR
spesifik-caladium.
Metode CTAB digunakan untuk ekstraksi total DNA genom.
Konsentrasi DNA diestimasi pada Spektrofotometer Nanodrop™ 1000
(Thermo Scientific, Odessa, TX, USA) dan diencerkan ke konsentrasi 8 ng
μL−1.
Amplifikasi PCR dilakukan padaMasterCycler mengikuti program
touchdown: denaturasi pada suhu94 °C selama 2 menit, 7siklus pada suhu94
°C selama 45 detik, 68 °C (turunkan 2 °C secara bertahap setiap siklus)
selama 45 detik, dan 72 °C selama 60 detik, dan kemudian 30 siklus 45 detik
pada suhu 94 °C, 45 detik pada 54 °C dan 60 detik untuk 72 °C, dan ekstensi
akhir pada suhu72 °C selama 5 menit. Produk PCR yang dihasilkan dipisahkan
di 6,5% gel poliakrilamida dan divisualisasikan pada DNA analyzer LI-COR
4300.
 lanjutan

Analisa Data
ANOVA dilakukan di perangkat lunak statistik JMP 12.0.
Uji Dunnett (nilai P < 0,05) digunakan untuk memisahkan rata-rata
kandungan DNA inti antara wildtype dan variannya.
Analisis clustering hierarki juga dilakukan pada varian berdasarkan profil
marka SSR dalam perangkat lunak yang sama menggunakan metode
"tunggal"; hasil dari analisis ini ditampilkan sebagai plot konstelasi.
HASIL DAN
METODE
 Identification of new variants

Dari 501 tanaman ‘Tapestry' yang diregenerasi

68 menunjukkan perubahan fenotipe
48 memiliki kandungan DNA inti dua kali lipat dan dianggap telah
berubah menjadi tetraploid dan tidak dianalisis lebih lanjut.
Terdapat 20 varian sisa, termasuk empat varian (CK-26, C20D6-28,
C10D4-113, and C10D4-17) control yang memiliki kandungan DNA inti mirip
dengan wildtype pada Tabel 1.
7 (35%) diregenerasi dari segmen daun tanpa perlakuan colchicine
13 (65%) diregenerasi dari segmen daun yang diberi perlakuan
colchicine
Terdapat 16 varian baru yang ditemukan dalam penelitian ini.
lanjutan

Morphological characterization of variants

nDA Content
Berdasarkan karakteristik daun, varian ini dipisahkan menjadi
sepuluh jenis berbeda (Tabel 2 dan Gambar. 1).
CK-26 dan C05D4-17 pada VT1 berbeda dari wildtype, tipe
ini memiliki bercak merah pada daun dan tepi daunnya
berwarna hijau kuning.
Warna pinggir daun VT2 (C05D6-11 dan C05D4-36) berbeda
dari VT1. Hal yang menarik adalah warna merah pada
bagian pinggir daun hanya ditemukan pada varian VT3
(C20D6-28).
Tanaman VT4 (C10D4-120, CK-27, C10D4-113, dan C05D4-31
sangat mirip dengan wildtype, kecuali pada cuping daun
yang sling melekat dan tumpang tindih.
Daun di VT5 (C10D4-17, C10D2-23, dan C10D4-3) mirip
dengan wildtype namun bentuk daunnya lebih bulat.
lanjutan

Morphological characterization of variants

Berbeda dengan wildtype, tanaman di VT6 (CK-46) memiliki
tulang daun berwarna merah muda, pada daun terdapat bercak
nDA Content
putih, dan tepi daun berwarna hijau muda.
Varian pada VT7 (C05D4-13) dan VT8 (CK 10, CK-53, dan C05D6-11)
tidak memiliki bercak pada daun, dan memiliki tulang daun
berwarna merah pucat dan area diantara tulang daun berwarna
hijau kekuningan.
Di antara semua VT dan wildtype, hanya VT9 (C05D2-34 dan CK-22)
yang menunjukkan perubahan warna tulang daun (merah menjadi
hijau).
Selain itu ada satu varian yang memiliki daun chimera seperti
gabungan dari wildtype dan mempunyai area daun seperti VT7
yang selanjutnya dikelompokkan menjadi VT10.
Kandungan DNA
Inti
DNA inti (nDNA) , atau asam
deoksiribonukleat, adalah DNA
yang terkandung dalam setiap inti
sel dari organisme eukariotik
Wildtype 'Tapestry' memiliki kandungan DNA inti 9.16
pg/2C (Tabel 3). Kandungan DNA inti CK-26 dan
C05D4-17 di VT1, C20D6- 28 di VT3, CK-27 dan C04D4-
31 di VT4, C10D4-17, C10D2- 23 dan C10D4-3 di VT5,
CK-10 di VT8, C05D2-34 di VT9, dan CK-47 di VT10
berkisar antara 9,01 hingga 9,23 pg/2C, kira-kira
98,8% hingga 100,8% dari konten DNA wildtype.
 lanjutan

nDNA content
Varian lain menunjukkan peningkatan atau penurunan
yang signifikan dalam isi DNA inti dibandingkan dengan
wildtype. C05D6-11 dan C05D4-36 (dalam VT2) memiliki
5,3-5,5% lebih tinggi konten DNA inti dari wildtype. Di
VT4, C10D4-120 memiliki kandungan DNA 4,2% lebih
rendah daripada wildtype, sedangkan C10D4-113
memiliki 9,7% lebih tinggi. Di VT6, CK-46 memiliki DNA
inti 3,0% lebih rendah konten, berbeda dengan C05D4-
13 di VT7, yang memiliki 5,8% kandungan DNA yang lebih
tinggi dari wildtype. Di VT8, CK-53 dan C05D2-66
mengandung DNA inti 4,5-4,8% lebih rendah daripada
wildtype. Di VT9, CK-22 memiliki kandungan DNA inti
3,3% lebih tinggi daripada wildtype.
lanjutan

nDNA Content

nDNA Content
Secara keseluruhan, isi DNA inti dalam varian ini berkisar dari 8,74 (dalam CK-53) hingga 10,14 pg/2C (dalam C10D4-
113), yang 4,8% lebih rendah menjadi 9,7% lebih tinggi dari kandungan DNA nuklir wildtype. Sebelas varian (CK-26,
C05D4-17, C20D6-28, CK-27, C04D40-31, C10D4-17, C10D2-23, C10D4-3, CK-10, C05D2-34, dan CK-47) dan wildtype
memiliki isi DNA inti yang serupa, sementara lima varian (C05D6-11, C05D4-36, C10D4-113, C05D4-13, dan CK-22)
mengandung DNA inti 3,3-9,7% lebih banyak daripada wildtype, dan empat varian (C10D4-120, CK-46, CK-53, dan
C05D2-66) memiliki DNA inti 3,0-4,8% lebih sedikit daripada wildtype.
Identifikasi Morfologi
Tanaman Caladium
Metode
Perhitungan
Kromosom

Perhitungan kromosom dilakukan

dengan menggunakan analisis mitosis
dengan metode Pra-Perlakuan Lengkap
dengan metode squash. Dengan
menggunakan larutan 8-hydroxyquinolin
0,002 M untuk menghentikan aktivitas
benang gelendong, dan aceto orcein
sebagai Chromosome painting
Chromosome
Pada kasus ini terdapat 20 varian dari
tanaman keladi pada tingkat variasi
jumlah kromosom. Dimana 9 varian

Counting
teridentifikasi sebagai aneuploid yang
terdiri dari monosomik, trisomik,
tetrasomik dan pentasomik.

Tanaman aneuploid adalah organisme

yang kandungan kromosom dalam inti
selnya tidak merupakan kelipatan dari
jumlah kromosom haploidnya.
Ketidakgenapan tersebut karena adanya
penambahan atau kehilangan satu atau
beberapa kromosom

Hal ini membuktikan bahwa teknik kultur

jaringan dapat memungkinkan terjadinya
keragaman somaklonal akibat perubahan
genetik pada tingkat kromosom.
C05D2-66 (2n = 2x = 29) wildtype (2n = 2x = 30) C05D4-13 (2n = 2x + 1 = 31),

CK-22 (2n = 2x + 1 = 31), C05D4-36 (2n = 32) C05D6-11 (2n = 33)

Analisis
Penanda SSR
Semua marka menghasilkan satu atau dua pita DNA yang jelas pada 6,5% gel
poliakrilamida (Gambar 3).
7 kultivar komersial (‘Merah Besar’, ‘Blaze’, C103, ‘Dr. TL Meade’, ‘Freida
Hemple’, 'Red Flash' dan 'White Christmas') termasuk dalam analisis karena
mereka memiliki kesamaan dengan beberapa dari 20 varian/mutan pada
warna vena utama dan/atau pola pewarnaan daun .
Dari 20 marka SSR, 5 (CaM18, CaM24, CaM42, CaM48, dan CaM62) mendeteksi
perubahan pola pita pada varian 'Tapestry' (Tabel 3; Gambar 3).
AGambar 3.
Pola pita SSR
 Berdasarkan profil marka SSR, diperoleh hasil analisis hierarki (clustering)
yang ditampilkan sebagai plot konstelasi, yang mengelompokkan varian
menjadi 4 cluster yaitu:
1. Cluster 1: C05D4-13, CK-10, CK-53, C05D2- 66, C05D2-34, dan CK-22
2. Cluster 2: C10D2-23, C05D6- 11, CK-26, CK-47, C10D4-3, C10D4-17, C05D4-31,
C10D4-113, C20D6-28 dan C05D4-17
3. Cluster 3: C05D4- 36, C10D4-120, dan CK-46
4. Cluster 4: CK-27
Gambar 4. Analisis
Clustering Hierarki
Kesimpulan
Karakterisasi rinci varian caladium 'Tapestry' menunjukkan bahwa varian tersebut memiliki
genetik basa pada tingkat molekuler dan seluler.
Varian yang teridentifikasi dapat memberikan sumber sifat baru yang berharga untuk
penangkaran caladium dan/atau dapat digunakan sebagai alat baru untuk pemahaman
yang lebih baik tentang pewarisan sifat-sifat penting dan membangun asosiasi penanda
sifat.
Terimakasih
Nuhun