TUGAS DASAR ANALISIS MIKROSKOPIS BAHAN BAKU

“ REVIEW VIDEO”

Nama : Karina Azizah

NIM : 195080301111005
Kelas : T2 Dasar Analisis Mikroskopis Bahan Baku

PERTEMUAN 1
Video 1. Mikroskop Confocal
Mikroskop confocal ditemukan karena kekurangan mikroskop fluoresensi.
Dalam mikroskop fluoresensi, mikroskop menggunakan sinar UV intensitas tinggi
karena sampel terus menerus dialihkan ke sinar UV intensitas tinggi. Ini
menyebabkan pemutihan foto/memudarnya foto karena sampel berada di bawah
molekul floresensi. Bidang fokus di mikroskop menyebabkan gambar fluoresensi
yang diperoleh kabur. Jadi untuk mengatasi masalah ini, mikroskop confocal
diciptakan. Mikroskop confocal tidak lain adalah mikroskop fluoresensi yang
dimodifikasi dengan dua modifikasi. 1. Menggunakan sinar laser sebagai pengganti
lampu busur merkuri sebagai sumber cahaya. 2. Gambar diambil dengan kamera
digital dengan lubang jarum. Fungsinya, lubang jarum memungkinkan cahaya salah
satu bidang fokus difokuskan pada kamera digital. Sinar yang datang dari busur dan
di bawah bidang fokus dihilangkan.

- Mekanisme kerja mikroskop confocal:

1. Laser difokuskan di wilayah kecil spesimen. Pewarna fluoresen dalam spesimen

menghasilkan fluoresensi yang ditangkap oleh kamera digital.

2. Menggunakan dua cermin berputar dalam arah x dan y. Laser sekarang

difokuskan di wilayah spesimen berikutnya dan fluoresensi ditangkap oleh kamera
digital.

3. Laser memindai seluruh permukaan spesimen dan gambar dari setiap titik yang
diitangkap.

4. Sebuah perangkat lunak akan menggabungkan semua gambar ini menjadi satu
gambar yang tajam.
 Sinar laser memindai sepanjang permukaan spesimen. Mikroskop confocal
juga dikenal sebagai mikroskop pemindaian laser confocal. Mikroskop confocal juga
digunakan untuk menghasilkan gambar 3d, karena adanya lubang jarum yang
memungkinkan cahaya hanya masuk dari satu bidang fokus. Citra bidang fokus
yang berbeda dapat diambil dan dikompilasi menjadi citra 3d menggunakan
perangkat lunak.

Video 2. Principal, Analysis and Practice of CLSM

Mikroskop confocal mengambil gambar fluorescent resolusi tinggi dari

pewarnaan sel dan jaringan dengan menghilangkan cahaya di luar fokus. dalam
mikroskop confocal jika tidak menggunakan lubang pada lensa vokal melainkan
kita menggunakan gambar proyeksi belakang pada sebuah detektor Pusat atau
titik dalam hubungannya dengan sumber titik fokus. fungsi sebaran titik pada
mikroskop confocal yang menunjukkan perbaikan dalam resolusi lateral yang
mungkin diperoleh dalam kasus confocal.  mikroskop confocal digunakan untuk
lokalisasi atau kolonialisasi protein pencitraan dua atau lebih noda Fluoresensi
visualisasi pewarnaan 3D  kuantifikasi ekspresi protein perolehan gambar
berkualitas tinggi untuk presentasi. mikroskop confocal dapat digunakan untuk

memvisualisasikan struktur berukuran antara 200 nm dan 1 cm yang

dapat diberi label dengan fluoresensi  soal biologi dan biologi jaringan. Mikroskop
confocal mengunakan sinar laser untuk memindai sampel yang telah dicelup.
Sampel-sampel ini disiapkan pada slide dan dimasukkan. Kemudian, dengan
bantuan cermin dichromatic, perangkat menghasilkan gambar yang diperbesar
pada layar komputer. Operator dapat membuat gambar 3D dengan merakit
beberapa pemindaian. Mikroskop confocal menawarkan pembesaran tingkat
tinggi, tetapi resolusinya jauh lebih baik. Mikroskop ini biasanya digunakan dalam
biologi sel dan aplikasi medis.

Cara kerja mikroskop confocal yaitu dengan cara pencitraan multicolor di

confocal, mengumpulkan z tumpukan di confocal,lalu penyelesaian masalah.
Sistem optik confocal hanya terdiri dari sumber titik cahaya yang kemudian
digunakan untuk mencari sebuah titik tunggal pada spesimen. Daya radiasi yang
direfleksikan kemudian diukur melalui sebuah titik, detektor lubang jarum.
Sumber titik dan detektor titik confocal pada sistem optik hanya menghasilkan
satu image titik obyek tunggal dan oleh karenanya beberapa bentuk scanning
diperlukan untuk bisa menghasilkan sebuah gambar dari bagian luas spesimen
tersebut. Ada perbedaam kedalaman yang unik karena keistimewaan irisan
optika yang menyebabkan kemampuan mendapatkan gambar 3D pada spesimen
volume. Dalam mikroskop confocal, pengamatan tidak menggunakan lubang
pada lensa focal melainkan menggunakan gambar proyeksi belakang pada
sebuah detektor pusat/titik dalam hubungannya dengan sumber titik fokus.
Mikroskop fluoresensi terbagi menjadi 2 yaitu mikroskop fluoresensi eksitasi 1
photon dan mikroskop fluoresensi eksitasi 2 photon. Pada mikroskop 2 photon,
fungsi sebaran titik efektif adalah 2 kali lipat lebih besar dari fungsi confocal 1
photon pada arah lateral maupun axial. Mikroskop 2 photon akan menghasilkan
kontras gambar yang lebih tinggi.

 Lubang jarum pada mikroskop confocal dapat menghilangkan cahaya di

luar fokus lubang jarum dapat disesuaikan karena ukurannya tergantung pada
lensa objektif yang digunakan dan panjang gelombang cahaya ukuran lubang
jarum diukur dalam unit lapang 1 = hanya ada cahaya fokus dalam mikroskop
fluoresensi cahaya dalam cahaya fokus jauh lebih sedikit daripada cahaya di luar
fokus sumber cahaya yang lebih intens dibutuhkan laser digunakan detektor yang
lebih sensitif digunakan biasanya tabung photomultiplier kamera EMCCD. Untuk
pengamatan benda keseluruhan, penting untuk mengatur tempat lubang jarum
dalam serangkaian spiral Archimedean dan memutar cakramnya. Sistem ini
mampu menghasilkan gambar kualitas tinggi tanpa dibutuhkan pemakaian sinar
laser dalam waktu riil dengan tingkatan TV dan kecepatan pengamatan yang
lebih tinggi.

Metode operasi sistem ini yaitu pertama mengambil gambar dengan

lubang kecil yang dikodekan sehingga memperoleh komposisi konvensional
ditambah dengan gambar confocal. Kemudian memindahkan semua lubang kecil
ke keadaan terbuka untuk memperoleh gambar konvensional. Meskipun
pendekatan ini dapat diimplementasikan dengan menggunakan kristal cair spatial
modulator cahaya, lebih murah dan sederhana hanya untuk mempengaruhi kode
korelasi photolithographic pada cakram dan memutarnya sehingga transmisivitas
pada setiap titik gambar bervariasi sesuai dengan orto-normal yang diinginkan.
Keistimewaan yang paling penting dari mikroskop confocal yaitu sifat optikal
sectioningnya, yang memungkinkan struktur volume diberikan dalam 3D melalui
tumpukan citra fokus menyeluruh yang sesuai agar dapat mencapai kinerja
tertinggi, maka penting jika resolusi optik sama dengan semua kedalaman pada
bagian optik.

PERTEMUAN 2
Video 1. Kurt Thorn (UCSF) Confocal
Aspek yang sangat penting dari mikroskop konvensional epifloresensi

medan lebar adalah dapat menghasilkan gambar yang sangat bagus, namun

memiliki cahaya in-fokus dan out-of-fokus. Pada mikroskop non-confocal

menghasilkan gambar yang jelas, tajam dan in-focus, namun gambar buram pada

bagian sampel yang tidak fokus dicitrakan. Dan salah satu cara untuk menyiasatinya

disebut mikroskop confocal. Mikroskop confocal menghasilkan gambar dengan

menghilangkan bagian out-fokus, memiliki detail sampel yang bagus dan in-focus

yang tajam. Pada mikroskop confocal terdapat 2 buah komponen yaitu: 1. Bagian

Optik dan 2. Bagian Confocal.

citra gambar dihasilkan dari irisan sampel yang melintang. Pengambilan gambar

pada sampel dilakukan dari bawah ke atas hingga gambar lengkap secara bertahap.

Sehingga citra yang dihasilkan berbentuk menyerupai kubus kubus utuh.

Pengambilan gambar dilakukan dengan merekam bidang fokus dari atas ke bawah

kubus ini. Dan memuat kubus tersebut ke komputer untuk menghasilkan

rekonstruksi 3D. Pengambilan gambar irisan dilakukan pada bidang fokus yang

berbeda, lalu menumpuknya dan menghitung ulang struktur 3D objek. Prinsip kerja

mikroskop confocal dengan mendapatkan gambar in-fokus dan menghilangkan

cahaya out-of-fokus. Pada mikroskop confocal terdapat lubang jarum untuk

mendapatkan titik tunggal masuknya cahaya. Yang mana akan mendapatkan

fluoresensi dari fokus dan lubang jarum akan melewatkan cahaya yang berasal dari

titik fokus tertentu dan tidak akan melewatkan cahaya yang berasal dari titik fokus

lain menuju sampel. Cahaya yang datang dari bagian atas sampel dan tidak terfokus

pada lubang jarum akan mengenai sisi samping lubang jarum dan diblokir. Hal ini

disebut confocal karena lubang jarum berada di bidang fokus yang sama dengan

sampel, jadi cahaya yang masuk akan confocal dengan sampel.

Raster scanning untuk mengambil gambar dari seluruh sampel sekaligus,

mencitrakan setiap titik dalam sampel pada satu waktu dan mengukur seberapa

terang satu titik itu. Untuk melihat sisi yang lain makadapat dilakukan dengan

bergerak sedikit dan mengukur tempat berikutnya sampai mikroskop mencitrakan

seluruh sampel. Sistem laser atau iluminasi yang memungkinkan mikroskop

memfokuskan cahaya ke tempat yang sempit pada sampel. Sedangkan penggunaan

sumber lampu konvensional yang tidak terlalu terang dan sulit fokus. Laser memiliki

kemampuan yang berkolom, bertenaga tinggi, dan dapat difokuskan ke tempat yang

sempit dalam sampel, Sehingga dapat menerangi satu tempat pada satu waktu dan

dapat menolak cahaya yang datang dari mana saja kecuali dari lubang jarum.

Untuk memindai sampel dilakukan dengan merekam intensitas dari titik yang

berbeda dalam sampel. Untuk melakukannya perlu memindahkan titik melintasi

sampel dan mengubah sudut masuknya cahaya ke obyektif. Sampel mendapat

cahaya yang masuk lurus ke bawah, sehingga sampel difokuskan tepat di tengah

tujuan. Untuk menerangi tempat yang berbeda, maka sudut cahaya masuk diubah

sesuai sasaran. Untuk memindahkan cahaya yang masuk saat mengiluminasi titik

yang berbeda maka diperlukan cermin yang dapat membelokkan cahaya yang

masuk dari lubang jarum, selain itu penggunaan cermin ini juga untuk
mengembalikan cahaya yang dipancarkan oleh sampel ke detektor. Skema ini terjadi

dengan cara membatalkan sudut pemindaian apa pun yang diletakkan di tempat

pertama dengan menggunakan cermin dichroic yang ditempatkan setelah lubang

jarum. Cermin ini diatur sedemikian rupa sehingga dapat memantulkan sinar laser

dan memancarkan cahaya emisi dari sampel. Sehingga cahaya keluar dari cermin

dichroic, lalu ke cermin pemindai, dan cermin pemindai digerakkan untuk mengubah

sudut di mana sinar laser mengenai sampel. Skema ini dilakukan tanpa mengubah

sumber cahaya masuk. Kemudian cahaya turun dari cermin pemindaian dan

memindai tempat yang berbeda pada sampel. Untuk membatalkan pemindaian,

maka lampu dan cermin yang berada pada sudut yang sama perlu dimatikan,

sehingga cermin pemindai akan membatalkan pemindaian yang diletakkan di tempat

pertama. Jadi sekarang cahaya, terlepas dari mana asalnya akan kembali melalui

jalur yang sama, melalui cermin dichroic dan melalui lubang jarum. Setelah itu

cahaya akan memasuki detektor untuk direkam intensitas cahaya yang datang dari

sampel.

Karena mikroskop memindai secara bertahap pada sampel maka dibutuhkan

detektor yang peka terhadap cahaya dari sampel. Detektor harus menangkap

cahaya dengan sangat cepat, karena jika ingin memindai gambar 1 megapiksel

(1000x100), maka diperlukan beberapa mikrodetik untuk mendeteksi setiap titiknya.

Oleh karena itu digunakan tabung pengganda foto yang merupakan teknologi lama

yang cocok untuk aplikasi semacam ini dan pada dasarnya tabung hampa udara

yang memiliki jendela di atasnya, sehingga cahaya masuk melalui jendela ini dan

mengenai apa yang disebut katoda foto. Katoda foto merupakan bahan yang

menghasilkan elektron saat disambar cahaya. Saat elektron-elektron itu keluar

maka akan ada serangkaian dinoda pemfokusan yang terbuat dari potongan-
potongan logam bertegangan tinggi yang menarik electron. Dan ketika elektron-

elektron itu menghantamnya, elektron tambahan akan keluar untuk mendapatkan

amplifikasi. Mikroskop confocal menghilangkan cahaya di luar fokus, memberikan

tampilan yang bagus, jelas, dan tajam hanya dari daerah yang berada dalam fokus.

Confocal scan head adalah bagian atas mikroskop yang memiliki optik pemindaian

yang menggerakkan sinar laser di sekitar sampel serta lubang jarum yang

memotong cahaya di luar fokus dengan adanya serat yang meluncurkannya ke

detektor. Unit ini dibaut di atas mikroskop tegak (lingkup tegak FN1). Ruang lingkup

ini sendiri adalah lingkup yang sangat sederhana dan sepenuhnya manual. Terdapat

lensa mata yang dapat beralih antara confocal dan eyepieces pada bagian ini.

Sampel yang ada di bawah kemudian dikenai laser yang memasok cahaya ke

sistem confocal. Umumnya terdapat tiga laser yakni, laser UV untuk pewarna

tereksitasi UV seperti DAPI, laser biru (laser 488) untuk pewarna hijau, dan laser

kuning (laser 561) untuk pewarna merah. Ketiga laser ini berada dalam satu kotak

yang akan meluncurkan cahaya ke dalam serat optik dan mengirimkan cahaya ke

kepala pemindai konfigurasi. Serat optik kedua akan mengambil cahaya dari kepala

pemindai yang keluar dari sampel dan kemudian mengirimkannya ke detektor yang

mendeteksi cahaya yang dipancarkan dari sampel. Daun jendela di mikroskop

confocal akan terbuka untuk membiarkan setiap panjang gelombang masuk ke

mikroskop. Kemudian proses pemindaian laser akan terjadi, yang mana laser

menyapu tempat sampel berada dan kemudian menerangi setiap piksel tersebut

secara bergantian. Kecepatan scanning dalam arah horizontal di sini sangat cepat,

tetapi dapat memindai dalam arah vertikal dengan cukup jelas. Kemudian dilakukan

pengaturan scanning confocal pada seluruh sampel dengan mengatur masing-

masing saluran ini secara bergantian. Pengatura tiga gambar berwarna di komputer,

lalu atur daya dan penguatan detektor yang sesuai untuk mendapatkan sinyal yang

baik. Pertama adalah citra warna biru, citra warna hijau dan warna merah per

gambar yang dihasilkan. Gambar dengan cahaya biru menandakan nukleat dari sel,

hijau adalah penanda aktin, dan merah adalah penanda permukaan sel. Mikroskop

bidang lebar bekerja paling baik pada spesimen yang tipis dengan ketebalan <20

mikron. Sampel tipis membutuhkan resolusi tinggi, terutama dalam 3D. Ketika

sampel lebih tebal dari 20 mikron pemindaian laser atau pemindaian dengan

menggunakan confocal akan membentuk gambar yang jelas.

Video 2.