Machine Translated by Google

Penelitian penyakit tanaman Res. Tanaman Dis. 20(3) : 173-181(2014)

Akses Terbuka Tinjauan Mini http://dx.doi.org/10.5423/RPD.2014.20.3.173

Tinjauan Metode Deteksi Virus Tumbuhan

Joo-jin Jeong1 , Ho-jong Ju1,2*dan Jaejong Noh3 **

*Penulis koresponden
Telp : +82-63-270-2519
Faks: +82-63-270-2531
Email: juhojong@jbnu.ac.kr
1
Departemen Biologi Pertanian Universitas Nasional Chonbuk, Jeonju 561-756, Korea
2
Pusat Penelitian Medis Tanaman Universitas Nasional Chonbuk, Jeonju 561-756, Korea
3
Stasiun Percobaan Semangka, Layanan Penelitian & Penyuluhan Pertanian Jeollabuk-do,
Gochang 585-863, Korea

**Penulis koresponden
Telp : +82-63-290-6399
Faks: +82-63-290-6398
Email: nohjj@korea.kr
Diterima 31 Juli 2014
Direvisi 2 September 2014
Diterima 4 September 2014
Deteksi dini dan akurat virus tanaman merupakan komponen penting untuk mengendalikannya. Karena globalisasi perdagangan
melalui perjanjian perdagangan bebas (FTA) dan perubahan iklim yang cepat mendorong transfer virus dari negara ke negara
dan inang serta vektornya, diagnosis penyakit virus menjadi lebih penting.
Karena gejala penyakit virus tidak berbeda dengan variasi yang besar dan dikacaukan dengan gejala stres abiotik, diagnosis
simtomatik mungkin tidak tepat. Dari tiga dekade terakhir, enzim-linked immu nosorbent assays (ELISAs), yang dikembangkan
berdasarkan prinsip serologis, telah banyak digunakan. Namun, ELISA untuk mendeteksi virus tanaman menurun karena
beberapa keterbatasan seperti ketersediaan antibodi untuk virus target, biaya untuk memproduksi antibodi, kebutuhan sampel
dalam jumlah besar, dan waktu untuk menyelesaikan ELISA. Banyak teknik lanjutan yang memungkinkan untuk mengatasi
kekurangan ELISA. Sejak reaksi berantai polimerase (PCR) dikembangkan sebagai teknik untuk memperkuat DNA target, PCR
berkembang menjadi banyak varian dengan sensitivitas yang lebih besar daripada ELISA. Banyak sistem deteksi virus tanaman
yang diulas di sini, yang meliputi sistem deteksi berbasis imunologi, teknik PCR, dan metode berbasis hibridisasi seperti
microarray. Beberapa teknik telah digunakan secara praktis, sementara beberapa masih dalam pengembangan untuk
mendapatkan tingkat kepercayaan untuk penggunaan yang sebenarnya.
Kata kunci : ELISA, PCR, Deteksi Virus Tanaman, Diagnosis Gejala

pengantar
Secara umum, virus sangat kecil dibandingkan dengan kelompok lain dari
patogen tanaman seperti jamur dan bakteri yang dapat divisualisasikan
melalui mikroskop tetapi virus tanaman terlalu kecil untuk diamati
menggunakan mikroskop cahaya dan mereka hanya dapat dilihat
menggunakan mikroskop elektron transmisi dan terbuat dari protein selubung
dan jenis asam nukleat, DNA atau RNA berdasarkan inti asam nukleat yang
membawa informasi genetik (Ellis et al., 2008). Sejak virus mosaik Tembakau
(TMV) pertama kali dikenali lebih dari satu abad yang lalu, lebih dari 1000
virus tanaman telah ditemukan (King et al., 2011; Scholthof, 2000). Telah
diketahui bahwa seperti patogen tanaman lainnya termasuk bakteri, jamur,
dan plasma fito, virus tanaman menyebar dan menyebabkan kerugian
ekonomi yang besar bagi banyak tanaman seperti jelai, jagung, kentang,
beras, dan gandum (Agrios, 2005; Ellis et al. , 2008; Aneh, 2005). Virus
menduduki peringkat sebagai patogen tanaman terpenting kedua setelah
jamur (Vidaver dan Lambrecht, 2004). Kerugian ekonomi telah diperkirakan
lebih dari beberapa miliar dolar per tahun di seluruh dunia
Penelitian Penyakit Tumbuhan
Masyarakat Patologi Tanaman Korea
pISSN 1598-2262, eISSN 2233-9191
karena virus tanaman (Hull, 2002; Plant Virus, 2003). Virus tumbuhan
menyebabkan kerusakan di dalam sel tumbuhan dengan mengintervensi
alokasi sumber daya yang dihasilkan tumbuhan melalui fotosintesis.
Kerusakan tanaman akibat penyakit virus sulit diprediksi, karena
tergantung pada wilayah, strain virus, kultivar/varietas tanaman inang, dan
waktu infeksi (Aneh, 2005). Gejala penyakit virus meliputi kerutan, jaringan
daun kecoklatan, mosaik, dan nekrosis. Namun, terkadang gejala tidak dapat
dideteksi secara visual karena infeksi virus tanaman tidak menimbulkan gejala
(Bove et al., 1988; van der Want dan Dijkstra, 2006).
Selain itu, tanaman juga dapat menunjukkan gejala seperti virus ketika
tanaman merespon cuaca yang tidak menguntungkan, ketidakseimbangan
nutrisi, infeksi oleh jenis patogen lain yang disebutkan di atas, kerusakan
yang disebabkan oleh hama atau agen abiotik dan lain-lain (van der Want
dan Dijkstra, 2006). Dengan demikian, diagnosis penyakit virus berdasarkan
gejalanya lebih sulit daripada patogen lain (Lievens et al., 2005).
Diagnosis merupakan dasar untuk mengelola penyakit tanaman dan untuk
memprediksi kerugian tanaman oleh infeksi patogen tanaman (van der Want
dan Dijkstra, 2006). Diagnosis penyakit virus yang akurat merupakan langkah
penting pertama untuk sistem manajemen tanaman (Aboul-Ata et al., 2011).
Sejak setelah infeksi virus, perawatan agrokimia
Machine Translated by Google
174 Penelitian Penyakit Tanaman Vol. 20 No.3
untuk tanaman tidak mengarah pada pengendalian yang efektif, penyakit
virus paling efektif dikelola sebagai tindakan pengendalian diterapkan
sebelum infeksi (Aboul-Ata et al., 2011). Untuk mencegah penyakit virus
tanaman, penting untuk mengetahui penyebab dan membedakan tanaman
yang sakit dan tanaman yang tidak terinfeksi yang menunjukkan virus–
seperti gejala (Pearson et al., 2006).
Sebagai internasionalisasi pasar pertanian domestik, diagnostik virus
sangat penting untuk menggunakan benih berkualitas tinggi serta benih
bebas virus (Lievens et al., 2005; Wang et al., 2011). Seperti disebutkan
di atas, tidak seperti patogen tanaman lainnya, pengelolaan penyakit virus
tanaman berdasarkan metode langsung belum dikembangkan, sehingga
penyakit virus dapat dikendalikan dengan strategi tidak langsung seperti
pengendalian vektor virus serangga atau menghilangkan tanaman yang
sakit (Aboul- Ata dkk., 2011; Wang dkk., 2011).
Metode untuk deteksi dan identifikasi virus sangat penting dalam
manajemen penyakit virus (Aboul-Ata et al., 2011). Oleh karena itu,
metode deteksi harus lebih nyaman, efektif, spesifik dan memungkinkan
penggunaan untuk mendeteksi patogen tanaman (McCartney et al., 2003).
Banyak metode telah dikembangkan untuk mendeteksi virus tanaman,
seperti pengamatan mikroskopis, teknik serologis, metode molekuler dan
sebagainya (Lopez et al., 2008; Makkouk dan Kumari, 2006; Webster et
al., 2004). Diantaranya, sejumlah metode untuk diagnosis penyakit virus
tanaman diulas dalam dua bagian berikut, metode serologis dan metode
molekuler.
Metode serologis:
Sistem deteksi serologis menggunakan antibodi spesifik yang
dikembangkan pada hewan sebagai respons terhadap antigen (Torrance,
1998). Virus dapat dideteksi jika antigen virus digunakan untuk mengembangkanplatform
antibodi.ELISA, sedangkan TBIA dilakukan pada membran nitroselulosa
Sebenarnya, teknik semacam ini telah digunakan untuk alat diagnostik
rutin. Banyak metode serologis telah dilaporkan termasuk enzyme-linked
immunosorvent assay (ELISA), tissue blot immunoassay (TBIA) dan
quartz crystal microbalance immunosensors (QCMI).
ELISA. ELISA umum dilakukan di pelat polistiren yang mampu mengikat
antibodi atau protein dengan asosiasi reaksi enzim-substrat (Corning Life
Science, 2001; Luminex, 2010). Untuk mendapatkan hasil yang akurat
dan dapat direproduksi, reaksi enzim-substrat perlu dioptimalkan waktu
dan kondisi perkembangannya (Corning Life Science, 2001). ELISA telah
digunakan sebagai uji yang sangat populer untuk mendeteksi virus
tanaman di dalam bahan tanaman, vektor serangga, dan biji (Clark dan
Adams, 1977; Naidu dan Hughes, 2001; Webster et al., 2004). Tingkat
infeksi diukur berdasarkan optical density (derajat pewarnaan) reaksi
ELISA (Corning Life Science, 2001; Webster et al., 2004). Keuntungan
ELISA adalah sensitif, sampel yang banyak dapat diperiksa pada saat
yang bersamaan (Vemulapati et al., 2014) sedikitnya jumlah antibodi untuk
mendeteksi penyakit, dan prosesnya dapat semi otomatis (Naidu dan
Hughes, 2001). Antiserum spesifik telah dikembangkan untuk melawan
virus target (Torrance, 1998). Memiliki
telah digunakan untuk mendeteksi banyak virus termasuk CMV, Citrus
tristeza virus (CTV), Potato leaf roll virus (PLRV), Potato virus X (PVX),
dan Potato virus Y (PVY) (El-Araby et al., 2009; Sun et al., 2001). Jumlah
sampel yang besar untuk ELISA diperlukan untuk menangkap antigen
yang diinginkan dari sampel dibandingkan dengan sampel yang
membutuhkan metode molekuler dan membutuhkan waktu sekitar 2 hari
untuk diagnosis (Lievens et al., 2005; Luminex, 2010). Karena ELISA
adalah uji berbasis antigen-antiboi, ketersediaan antibodi yang merespon
dengan benar terhadap agen target dianggap sebagai faktor yang sangat
penting. ELISA sering memberikan kesalahan diagnosis karena positif
palsu yang terutama dihasilkan dari reaksi non-spesifik atau reaktivitas
silang dengan faktor-faktor tertentu dalam sampel (Kfir dan Genthe, 1993).
Antibodi yang digunakan dalam ELISA dapat merespon banyak strain
dengan gejala yang berbeda karena kurangnya spesifisitas. Oleh karena
itu, strain virus yang sangat terkait tidak dapat dibedakan dengan benar
dengan ELISA (Boonham et al., 2014). Meskipun sensitivitas ELISA
ditingkatkan dengan menambahkan beberapa aditif dalam buffer ekstraksi
(Fegla dan Kawanna, 2013), ELISA umumnya kurang sensitif jika
dibandingkan dengan metode molekuler. Karena alasan ini, meskipun
ELISA telah banyak digunakan untuk tujuan diagnostik hingga saat ini,
penggunaan ELISA dalam hal diagnosis tampaknya secara bertahap
menurun. Diperkirakan bahwa alat asli pengganti untuk digunakan di masa
mendatang akan diperkenalkan ke pasar diagnostik atau lebih banyak
penelitian akan dilanjutkan untuk mengatasi kekurangan ELISA.
Tissue blot immunoassay (TBIA). Karena prinsip TBIA sama dengan
prinsip ELISA yang diterapkan antibodi, TBIA memiliki keandalan yang
sama terhadap ELISA untuk mendeteksi virus tanaman (Hanÿeviÿ et al.,
2012). Perbedaan utama adalah pelat polistiren digunakan sebagai
dan nilon. Itulah sebabnya pengujian ini disebut sebagai TBIA atau TIBA
(Webster et al., 2004). Seperti ELISA, TBIA juga membutuhkan antibodi
spesifik untuk menghilangkan false positive dan juga membutuhkan
konsentrasi virus yang besar untuk mengurangi false negative. Namun,
karena TBIA memiliki manfaat besar dibandingkan ELISA dalam hal waktu
deteksi, biaya, sensitivitas dan kemudahan, TBIA telah diterapkan untuk
diagnosis sejumlah penyakit virus yang disebabkan oleh Bamboo mosaic
virus (BoMV), Bean yellow mosaic virus (BYMV), CTV, Cymbidium mosaic
virus (CyMV), Pepaya ringspot virus (PRSV), Sweet Potato Feathery
Mottle Virus (SPFMV), dan Tomato Spotted Wit Virus (TSWV) (Bove et
al., 1988; Eid et al., 2008; Hanÿeviÿ et al. al., 2012; Lin et al., 1990;
Makkouk dan Kumari, 2006; Shang et al., 2011; Webster et al., 2004).
Imunosensor keseimbangan mikro kristal kuarsa (QCMI).
QCM mengukur massa berdasarkan getaran dan perubahan frekuensi
secara real time dan telah banyak digunakan untuk mengukur massa kecil
dalam kondisi vakum, gas, dan cair (Kurosawa et al., 2006; Mecea, 2005,
2006). Kombinasi imunologis dengan QCM menghasilkan QCMI sebagai
perangkat transduser yang sensitif terhadap massa (Owen et al., 2007).
Reaksi pengikatan antigen-antibodi menyebabkan penurunan frekuensi
osilasi kristal kuarsa dalam reaksi positif. QCMI, yang menawarkan
beberapa keuntungan, termasuk high
Machine Translated by Google
Penelitian Penyakit Tanaman Vol. 20 No.3
sensitivitas, keluaran waktu nyata, portabilitas, entitas bebas label,
dan biaya operasi, fabrikasi, dan pemeliharaan yang rendah menjadi
alternatif yang menarik untuk metode analisis konvensional (Chen dan
Tang, 2007; Lee dan Chang, 2005; Tang et al., 2006) . Jika sinyal
analitis terlalu lemah untuk mendeteksi bahan target, sensitivitas
deteksi dapat ditingkatkan dengan memperkenalkan langkah
peningkatan sinyal (Kurosawa et al., 2006). QCMI menunjukkan
sensitivitas deteksi yang tinggi untuk bahan biologis bahkan virus
(Bachelder et al., 2005; Eun et al., 2002; Kleo et al., 2011; Lee dan
Chang, 2005; Owen et al., 2007; Su et al. , 2003; Susmel et al., 2000;
Uttenthaler et al., 2001). Karena instrumen deteksi QCM dapat
diminum dan QCM dilapisi dengan antibodi spesifik virus untuk
mendeteksi virus tanaman memiliki masa hidup yang panjang,
instrumen ini dapat digunakan untuk deteksi virus tanaman di lokasi (Becker(PAMV),
Karena QCM telah terbukti berhasil dalam mendeteksi virus
tanaman, termasuk virus mosaik Cymbidium (CyMV), TMV dan virus
mosaik kuning Turnip (TYMV), dideteksi menggunakan QCM (Dickert
et al., 2004; Eun et al., 2002; Zan et al., 2012).
Metode molekuler:
Metode molekuler dapat diterapkan untuk diagnosis banyak
penyakit virus ketika informasi genetik virus tersedia. Sebagai metode
alternatif selain serologi, metode ini paling sering digunakan di
laboratorium karena akurasi dan sensitivitasnya yang tinggi.
Reaksi berantai polimerase (PCR).
PCR dan PCR transkripsi balik (RT-PCR). PCR adalah teknik ilmiah
yang digunakan untuk memperkuat, atau membuat jutaan salinan
identik dari urutan DNA tertentu dalam tabung reaksi kecil. Sebelum
memulai setiap putaran baru untuk amplifikasi DNA, DNA didenaturasi,
dua set oligonukleotida (disebut primer) menyatu dengan untai
komplementer yang terdenaturasi. Kemudian, primer memimpin
sintesis DNA oleh DNA polimerase. Semua reaksi terjadi secara
berurutan dengan cara yang bergantung pada templat. Melalui ini,
urutan target DNA yang menarik diperkuat secara eksponensial (Saiki
et al., 1985, 1988).
PCR telah digunakan sebagai salah satu teknik inti untuk penelitian
berbasis biologi molekuler dalam banyak aplikasi seperti kloning,
manipulasi gen, analisis ekspresi gen, genotip, sequencing, dan
mutagenesis. Selain itu, PCR juga telah digunakan sebagai alat
diagnostik untuk mendeteksi penyakit (Makkouk dan Kumari, 2006;
Schaad dan Frederick, 2002).
Saat ini, PCR merupakan teknik yang populer untuk mendeteksi
virus tanaman di laboratorium dan sangat umum digunakan dalam
eksperimen molekuler (Webster et al., 2004). PCR saat ini merupakan
dasar dari semua metode diagnostik, yang digunakan dengan metode
deteksi lainnya (Lopez et al., 2008). Metode diagnostik virus yang
efektif, PCR mampu memproses dengan spesifisitas primer. PCR
dilakukan melalui tiga tahap, denaturasi di atas 94o C, nealing primer
pada 50-75o C (tergantung primer) dan pemanjangan pada 72o C
(Makkouk dan Kumari, 2006; McCartney et al., 2003).
RT-PCR yang digunakan untuk mendeteksi virus RNA membutuhkan
transkriptase balik yang ditambahkan pada langkah transkripsi balik
sebelum langkah PCR biasa (Lopez et al., 2008; Webster
175
dkk., 2004). Sejak teknik RT-PCR sensitif, spesifik, dan murah
dibandingkan dengan metode serologis dan juga lebih dapat
diandalkan daripada metode serologis (Lievens et al., 2005; Lopez et
al., 2008; McCartney et al., 2003), telah dikembangkan dan digunakan
untuk mendeteksi banyak virus kentang seperti PVX, PLRV, dan PVS
pada batang atau biji kentang (Drygin et al., 2012; Ham, 2003; Peiman
dan Xie, 2006; Peter et al., 2009). Virus kentang dalam kutu daun,
vektornya, dapat dideteksi dengan RT-PCR (Peter et al., 2009; Singh
et al., 2004). Selain itu, RT-PCR untuk mendeteksi virus RNA tanaman
digunakan untuk tujuan karantina (Lee et al., 2011). Teknik ini mampu
mendeteksi lima virus yang tidak dilaporkan di Korea antara lain
Cucumber vein yellowing virus (CVYV), Cucurbit yel low stunting
disorder virus (CYSDV), Potato aucuba mosaic virus
dan Cooper,
virus2011;
kerdil Eun et al.,
kuning 2002)(PYDV),
kentang . dan virus klorosis tomat
(ToCV) (Lee et al., 2011).
PCR multipleks. Dua atau lebih target DNA atau RNA dapat
dideteksi secara bersamaan melalui multipleks PCR dalam satu reaksi
(Lopez et al., 2008; Webster et al., 2004). Metode ini membutuhkan
beberapa primer spesifik untuk mendeteksi lebih dari dua virus atau
bakteri (Li et al., 2011; Menzel et al., 2002; Qu et al., 2011; Singh et al., 2000).
Ada beberapa contoh deteksi simultan virus dan juga patogen tanaman
lain dalam satu inang (Singh et al., 2000).
Banyak virus berciri utama secara bersamaan terdeteksi pada
pohon apel yang sakit melalui multipleks-PCR (Menzel et al., 2002).
Sebagai perbandingan multiplex-PCR dengan ELISA untuk mendeteksi
virus tanaman, Apple chlorotic leafspot virus (ACLSV), Apple mosaic
virus (ApMV), Prune dwarf virus (PDV), Prunus necrotic ringspot virus
(PNRSV), dan Plum pox virus (PPV), tingkat infeksi yang dilaporkan
dari multiplex-PCR adalah sekitar 16,7% sedangkan ELISA adalah
10% meskipun sampel yang sama telah digunakan, menunjukkan
bahwa multiplex-PCR lebih unggul dari ELISA dalam hal deteksi dan
sensitivitas (Yardimic dan Culal-Klllc, 2011). Mumford dkk. (2000)
menggunakan fluoresensi untuk mendeteksi banyak virus secara real
time. Terlepas dari manfaat ini, PCR konvensional digunakan lebih
dari PCR multipleks, mungkin karena kesulitan teknis campuran reaksi
yang melibatkan banyak primer yang kompatibel (Lopez et al., 2008).
Selain itu, sulit untuk merancang primer spesifik untuk setiap DNA
target dan untuk membedakan dengan perbedaan amplifikasi DNA
dari setiap ukuran gen (Lopez et al., 2008; Webster et al., 2004).
PCR bersarang. Metode ini berguna ketika titer virus sangat rendah,
gen target tidak stabil, dan tidak dapat diperiksa dengan elektroforesis
karena produk amplifikasi rendah (Webster et al., 2004). Produk dari
amplifikasi PCR primer digunakan untuk amplifikasi PCR kedua.
Namun, reaksi kedua dapat disebabkan menghadapi risiko kontaminasi
(Lopez et al., 2008). Masalah yang disebutkan di atas dapat
diselesaikan dengan Nested PCR (Olmos et al., 1999). Beberapa
virus, termasuk PNRSV, PDV, PPV dan CTV, dideteksi dengan teknik
ini (Adkar-Puru shothama et al., 2011; Helguera et al., 2001, 2002;
Olmos et al., 1999). Nested PCR ini digabungkan dengan
Immunocapture-RT PCR untuk meningkatkan sensitivitas dan
mempermudah preparasi sampel
Machine Translated by Google
176 Penelitian Penyakit Tanaman Vol. 20 No.3
(Helguera et al., 2001, 2002). Metode ini diterapkan untuk mendeteksi virus
mosaik selada (LMV) bahkan pada kutu daun tunggal (Moreno et al., 2007).
Kerjasama PCR (Co-PCR). Baik PCR kerjasama maupun nested-PCR
membutuhkan set tetra primer (Olmos et al., 1999; Olmos et al., 2002).
Namun, PCR kerjasama membutuhkan satu primer eksternal dan tiga primer
internal, bukan dua primer eksternal dan dua primer internal yang terkait
dengan nested-PCR (Olmos et al., 2002; Pantaleo et al., 2001). Karena PCR
kerjasama menggunakan empat primer seperti nested-PCR, teknik ini
memiliki beberapa keunggulan dibandingkan PCR konvensional (Lopez et
al., 2008; Olmos et al., 2002). Manfaatnya termasuk reaksi tunggal,
meminimalkan risiko kontaminasi, sensitivitas tinggi yang mirip dengan
nested PCR, deteksi secara real-time, dan kemampuan penggabungan
dengan hibridisasi dot blot (Bertolini et al., 2007; Lopez et al., 2008; Martos
et al. ., 2011). Selain itu, Co-operational PCR dapat menghindari false
positive yang ditunjukkan pada nested PCR (Olmos et al., 2002) dan juga
dapat diterapkan pada capillary air thermal cyclers yang tidak dapat
diterapkan untuk nest-PCR yang digunakan untuk mendeteksi virus Squash
vein yellowing ( SqVYV) (Adkins et al., 2008).
Akibatnya, PCR kerjasama membutuhkan waktu lebih sedikit daripada
nested-PCR (Olmos et al., 2002). Kendala utama penggunaan PCR
konvensional adalah adanya inhibitor PCR. Masalah ini dapat diatasi dengan
co-PCR dengan sampel yang diencerkan. Sampel yang tidak diencerkan
menunjukkan produk yang lemah dengan co-PCR sedangkan sampel yang
diencerkan memberikan sinyal yang lebih baik (Capote et al., 2009; Caruso
et al., 2003). Menurut deteksi virus Cherry leafroll (CLRV), sensitivitas co-
PCR diamati dalam deteksi virus setidaknya 100 kali lebih tinggi dari RT-
PCR dan mirip dengan RT-PCR bersarang (Olmos et al., 2002). Namun,
perlu dicatat bahwa tidak semua co PCR menunjukkan sensitivitas yang
lebih tinggi dibandingkan dengan RT-PCR (Capote et al., 2009).
PCR waktu nyata. Real-time PCR dikembangkan sebagai salah satu
metode teknis untuk memantau produk amplifikasi PCR secara real-time
dan juga memungkinkan kuantifikasi akurat produk PCR (McCartney et al.,
2003; Ruiz-Ruiz, 2009). PCR waktu nyata dapat secara dramatis mengurangi
waktu deteksi dan dapat digunakan untuk konsentrasi kecil gen target yang
memungkinkan untuk mendiagnosis (Heid et al., 2011; Lopez et al., 2008)
karena tidak memerlukan elcetroforesis gel untuk konfirmasi. Juga telah
diketahui bahwa ini lebih cepat daripada PCR konvensional dengan risiko
kontaminasi yang lebih kecil (Lopez et al., 2008). Meskipun kurva pemantauan
waktu nyata dinaikkan saat DNA diamplifikasi secara eksponensial, ada
beberapa kelemahan menggunakan PCR waktu nyata. Salah satunya adalah
bahwa amplifikasi berhenti ketika mencapai tingkat tertentu, dataran tinggi
(Gibson et al., 1996). Kelemahan lainnya adalah metode real-time
membutuhkan peralatan yang sangat mahal. Meskipun kekurangan ini, PCR
real-time telah semakin banyak digunakan karena metode ini telah
menunjukkan deteksi yang berharga untuk virus tanaman (McCartney et al.,
2003). Citrus tristeza virus (CTV) di berbagai jaringan tanaman dan TMV di
tanah dideteksi oleh PCR real-time dan quantified Citrus leaf blotch virus
(CLBV) (Ruiz-Ruiz et al., 2007, 2009; Yang et al., 2012).
Itu juga digunakan untuk membedakan dua bakteri patogen kentang pada
umbi kentang yang terinfeksi (Qu et al., 2011).
amplifikasi isotermal.
Secara umum, penggunaan varian PCR meningkat untuk diagnosis
penyakit. Untuk menyelesaikan putaran pertama PCR, PCR memerlukan 3
suhu berbeda untuk denaturasi DNA untai ganda, annealing primer ke DNA
target, dan ekstensi sintesis DNA. Oleh karena itu diperlukan instrumen
mahal yang dapat mengontrol suhu secara tepat. Polimerase, yang dapat
mengamplifikasi DNA, pada suhu konstan telah ditemukan. Ini disebut PCR
isotermal. Banyak PCR isotermal ada tetapi di sini amplifikasi berbasis
urutan asam nukleat (NASBA) dan amplifikasi isotermal yang dimediasi loop
(LAMP) dijelaskan.
Amplifikasi berbasis urutan asam nukleat (NASBA). NASBA, amplifikasi
kontinu yang bergantung pada primer, telah digunakan untuk amplifikasi
langsung RNA oleh PCR menggunakan transkriptase terbalik, RNase H dan,
T7 RNA polimerase (Compton, 1991).
Salah satu perbedaan dibandingkan dengan PCR konvensional adalah
bekerja pada kondisi isotermal daripada siklus termal. Yang lainnya adalah
bahwa produk oleh NASBA adalah antisense terhadap urutan virus target.
Lopez dkk. (2008) melakukan seluruh proses pada 41oC selama 60 menit
dan memvisualisasikan pengujian waktu nyata menggunakan suar molekuler.
Karena lebih sensitif daripada PCR konvensional, waktu reaksi dapat
dikurangi (Vaskova et al., 2004). NASBA waktu nyata telah diterapkan untuk
mendeteksi virus tanaman termasuk Strawberry vein banding virus (SVBV),
Apple stem pitting virus (ASPV) dan PPV (Klerks et al., 2001; Leone et al.,
1997; Olmos et al., 2007 ; Vaskova dkk., 2004).
Amplifikasi isotermal yang dimediasi loop (LAMP). LAMP dilakukan pada
suhu konstan selama satu jam dengan menggunakan empat primer (Notomi
et al., 2000). Produk pertama terbentuk dalam formasi loop dan DNA terus-
menerus diamplifikasi dari produk pertama menghasilkan berbagai ukuran
struktur DNA (Gbr. 1).
Diagnosis, oleh karena itu, dimungkinkan meskipun ada sejumlah kecil gen
target (Parida et al., 2008; Tomita et al., 2008).
Produk LAMP dari reaksi dapat dideteksi dengan elektroforesis dan diamati
apusan beberapa pita di jalur reaksi LAMP positif (Notomi et al., 2000; Parida
et al., 2008; Tomita et al., 2008).
Uji LAMP baru-baru ini diterapkan untuk deteksi cepat beberapa virus
pada hewan, seperti Canine parvovirus
(Cho et al., 2006). Selain itu, telah digunakan untuk menentukan jenis
kelamin asparagus, organisme hasil rekayasa genetika (GMO), dan
Fitoplasma (Lee et al., 2009; Shiobara et al., 2011; Tomlinson, 2010). RT-
LAMP telah dikembangkan untuk pemantauan sederhana virus RNA
termasuk PVY dan PLRV (Ju, 2011; Nie, 2005).
Microarray (susunan Oligonukleotida).
Microarray adalah platform yang dikembangkan dari teknologi blotting
selatan. Teknik ini menggunakan kaca sebagai pengganti nitroselulosa dan
membran nilon sebagai pendukung (Maskos dan Southern,
Machine Translated by Google
Penelitian Penyakit Tanaman Vol. 20 No.3
Gambar 1. Prinsip LAMP-PCR. Sementara langkah denaturasi DNA (DNA untai
ganda menjadi untai tunggal) sangat penting untuk PCR konvensional, LAMP-
PCR tidak memerlukan itu. Ada 11 langkah untuk LAMP-PCR.
1, Setelah FIP (salah satu primer LAMP) menyatu dengan urutan DNA target
yang dikondisikan sekitar 65oC , untai DNA disintesis dari ujung 3' F2 di FIP
oleh DNA polimerase dengan aktivitas perpindahan untai; 2, F3 menyatu ke
wilayah F3c pada DNA target dan memulai pelepasan untai komplementer
terkait-FIP yang disintesis pada langkah 1; 3-4, Untai tunggal yang dilepaskan
membentuk struktur loop di ujung 5' karena F1c melengkapi F1 dan setelah BIP
menyatu dengan komplemennya, untai DNA baru disintesis dari ujung 3' B2 di
BIP oleh DNA polimerase; 5, B3 menyatu ke wilayah B3c, di luar BIP, pada DNA
target dan memulai sintesis untai DNA (untai komplementer terkait-BIP),
membentuk struktur seperti dumbell dengan loop batang di setiap ujungnya
karena komplemen dari F1 dan B1 ke F1c dan B1c, masing-masing. Struktur ini
berfungsi sebagai bahan awal untuk amplifikasi; 6-12, FIP menyatu dengan DNA
loop batang dan memimpin sintesis DNA perpindahan untai dan, melepaskan
untai yang disintesis sebelumnya yang membentuk struktur loop batang di ujung
3' karena B1c melengkapi B1. Kemudian untai komplementer dengan FIP
dilepaskan. Untai yang dilepaskan membentuk struktur seperti halter dengan
loop batang di setiap ujungnya karena F1 dan B1 masing-masing melengkapi
F1c dan B1c.
Karena sintesis DNA berlanjut, ada berbagai struktur ukuran (Di bawah izin
dari Eiken Chemical Co, Ltd. 2005; Eiken, 2005).
1992) dan pada awalnya dikembangkan untuk diferensiasi ekspresi
RNA messen ger (Schena et al., 1995). Kemudian, teknik ini
menunjukkan potensi untuk mendeteksi patogen virus tanpa
177
amplifikasi RNA virus (Nam et al., 2014). Oligochip yang digunakan
dalam susunan oligonukleotida terdiri dari ribuan probe spesifik yang
terlihat pada permukaan padat seperti pelat kaca (Lopez et al., 2008).
Probe DNA untai tunggal yang disintesis dengan nukleotida sekitar
25bp hingga 70bp dihibridisasi dengan virus yang diekstraksi dari
tanaman (Lee et al., 2003; Wang et al., 2002, 2003).
Sebagian besar kelemahannya adalah biaya karena memerlukan mesin
pengolah yang sangat canggih untuk mendeteksi probe dan membaca
reaksi dan juga membutuhkan ruang bebas debu (Wang et al., 2002).
Masalah lainnya adalah konstruksi oligonukleotida untuk dihibridisasi
dengan DNA target dalam hal spesifisitas dan sensitivitas (Dugat-Bony
et al., 2012). Karena itu, belum banyak digunakan dan masih dalam
tahap penelitian. Namun, beberapa uji coba untuk menggunakan
metode ini dapat ditemukan karena mampu mendeteksi urutan yang
dikenal dan tidak dikenal dalam sampel lingkungan, menghasilkan
identifikasi virus yang tidak dikenal oleh Oligo-chip (Boonham et al.,
2007; Dugat-Bony et al., 2012; Nam dkk., 2014; Schena dkk., 1995).
Metode ini digunakan untuk mendeteksi virus kentang seperti Potato
virus A (PVA), Potato virus M (PVM), Potato virus S
(PVS), PVX, PVY dan PLRV dan virus tanaman yang menginfeksi
cucurbit (Bystricka et al., 2005; Lee et al., 2003). Ia juga mampu
mengidentifikasi virus tanaman apa pun pada tingkat genus dan dapat
membedakan galur yang relevan (Hammond, 2011; Wang et al., 2002;
2003; Zhang et al., 2010). Baru-baru ini, chip oligonukleotida (LSON)
skala besar dikembangkan untuk mendeteksi dan mengidentifikasi 538
virus tanaman (Nam et al., 2014). Karena metode ini memiliki potensi
besar untuk mendeteksi semua patogen pada hewan dan manusia, dan
tanaman dalam satu chip, metode ini dapat diperluas untuk tujuan karantina.
Kesimpulan
Kerugian ekonomi diperkirakan lebih dari beberapa miliar dolar per
tahun di seluruh dunia karena penyakit virus tanaman dan tidak ada
bahan kimia komersial untuk mengelolanya. Penyakit tanaman yang
disebabkan oleh virus dapat dikendalikan secara efektif bila cara
pengendalian diterapkan pada tahap awal perkembangan penyakit
virus atau dengan menanam tanaman bebas virus. Inilah alasan
mengapa diagnosis yang akurat penting. Diagnosis simtomatik masih
berguna tetapi sering kali memiliki hasil yang salah, karena kebingungan
terkait dengan gejala variabel yang tinggi oleh interaksi antara inang
dan virus atau oleh cekaman abiotik. Oleh karena itu, diperlukan formulir
plat diagnostik yang andal yang dapat diterima secara resmi.
Metode berdasarkan prinsip serologi dan biologi molekuler telah
digunakan untuk diagnosis virus. ELISA yang terkait dengan serologi
dimulai dan diadaptasi sebagai alat diagnostik di seluruh dunia karena
mudah digunakan dengan daya tahan. Setelah PCR ditemukan,
diagnostik berbasis PCR telah diadaptasi sebagai sistem diagnostik
yang sebanding dengan ELISA bahkan menjadi metode yang dominan.
Ada beberapa alasan untuk perubahan ini. PCR distandarisasi di tingkat
industri sebagai ELISA sehingga digunakan di seluruh dunia dalam
fasilitas diagnostik. Selain itu, assay berbasis PCR memiliki sensitivitas
yang lebih baik dibandingkan ELISA dan bahkan lebih cepat. Metode
amplifikasi asam nukleat isotermal termasuk LAMP sedang
dikembangkan untuk deteksi virus karena lebih cepat dan memiliki sensitivitas yang
Machine Translated by Google
178 Penelitian Penyakit Tanaman Vol. 20 No.3
dibandingkan PCR konvensional. Meskipun microarray diciptakan untuk
menguji variasi tingkat ekspresi messenger RNA masih dalam tahap
penelitian untuk meningkatkan sensitivitas untuk membedakan sinyal
target dengan latar belakang karena host, yang merupakan salah satu
kelemahan untuk microarray dibandingkan dengan metode PCR, telah
terbukti sangat potensial untuk gunakan sebagai alat diagnostik.
Banyak jenis teknik yang tersedia sekarang dan sedang berkembang
untuk tujuan diagnostik. Karena tidak ada metode deteksi yang ideal
untuk memenuhi semua persyaratan untuk mendeteksi, sangat penting
untuk mengembangkan teknik yang tepat dan efektif yang dapat diterapkan
untuk pengelolaan penyakit virus di tingkat dunia.
Dengan demikian pertanian berkelanjutan akan tercapai.
Pengakuan
Pekerjaan ini didukung oleh Hibah dari Next-Generation Biogreen 21
Program (PJ008063), Administrasi Pembangunan Pedesaan, Republik
Korea.
Referensi
Aboul-Ata, AE, Mazyad, H., El-Attar, AK, Soliman, AM, Anfoka, G., Zeidaen, M.,
Gorovits, R., Sobol, I. dan Czosnek, H. 2011. Diagnosis dan pengendalian
virus sereal di Timur Tengah. Adv. Res. Virus 81: 33-61.
Adkar-Purushothama, CJ, Maheshwar, PK, Sano, T. dan Janard hana, GR 2011.
Uji PCR bersarang RT yang sensitif dan andal untuk mendeteksi virus Citrus
tristeza dari tanaman jeruk yang terinfeksi secara alami. Curr. Mikrobiol. 62:
1455-1459.
Adkins, S., Webb, SE, Baker, CA, Baker, CA dan Kousik, CS 2008.
Deteksi virus menguning vena squash menggunakan reaksi rantai polimerase
bersarang menunjukkan bahwa gulma Cucurbit Momordica charantia adalah
inang reservoir. Tanaman Dis. 92: 1119-1123.
Agrios, GN 2005. Patologi Tumbuhan. edisi ke-5. Elsvier, New York, NY.
922 hal.
Bachelder, E., Ainslie, K. dan Pishko, M. 2005. Memanfaatkan jumlah sel T kristal
+
keseimbangan mikro untuk mengukur CD4 kuarsa. Sensor Lett. 3:
211-215.
Becker, B. dan Cooper, MA 2011. Sebuah survei dari literatur biosensor
microbalance kristal kuarsa 2006-2009. J. Mol. Kenali.
24: 754-787.
Bertolini, E., Torres, E., Olmos, A., Martin, MP, Bertaccini, A. dan Cambra, M.
2007. PCR kerjasama digabungkan dengan bridisasi dot blot hy untuk deteksi
dan pengelompokan 16SrX fitoplasma.
Tanaman Pathol. 56: 677-682.
Boonham, N., Kreuze, J., Winter, S., Van der Vlugt, R., Bergervoet, J., Tomilinson,
J. dan Mumford, R. 2014. Metode dalam diagnostik virus: Dari ELISA ke
sekuensing generasi berikutnya. Res. Virus 186: 20-
31.
Boonham, N., Tomilinson, J. dan Mumford, R. 2007. Microarrays untuk Identifikasi
Cepat Virus Tanaman. annu. Pdt. Fitopatol. 45: 307-328.
Bove, JM, Vogel, R., Albertini, D. dan Bove, JM 1988. Penemuan strain virus
Tristeza (K) yang tidak menimbulkan gejala pada jeruk nipis Meksiko. Prosiding
Konferensi ke-10 IOCV. Spanyol 1988.
Organisasi Internasional Ahli Virologi Jeruk Riverside, CA. hal.14-16.
Bystricka, D., Lenza, O., Mraza, I., Piherovad, L., Kmochd, S. dan Sipc, M. 2005.
Microarray berbasis oligonukleotida: Peningkatan baru dalam deteksi
microarray virus tanaman. J. Viral. Metode
128: 176-182.
Capote, N., Bertolini, E., Olmos, A., Vidal, E., Martinez, MC dan Cambra, M. 2009.
Metode persiapan sampel langsung untuk mendeteksi virus Plum pox oleh
RT-PCR waktu nyata. Int. Mikrobiol. J.12: 1-6.
Caruso, P., Bertolini, E., Cambra, M. dan Lopez, MM 2003. Reaksi rantai
polimerase Co-operasional baru dan sensitif (Co PCR) untuk deteksi cepat
Ralstonia solanacearum dalam air. J.
Mikrobiol. Metode 55: 257-272.
Chen, Z.-G. dan Tang, D.-Y. 2007. Interaksi antigen-antibodi dari imunosensor
keseimbangan mikro kristal kuarsa berdasarkan antarmuka biomimetik
komposit nanopartikel yang difungsikan dengan magnetik CoFe2O4/SiO2 .
Bioproc. Biosis. Ind. 30: 243-249.
Cho, H., Kang, J. dan Park, N. 2006. Deteksi parvovirus anjing dalam sampel tinja
menggunakan amplifikasi isotermal yang dimediasi loop.
J. Dokter hewan. Diagnosa Menginvestasikan. 18: 81-84.
Clark, MF dan Adamas, AN 1977. Karakteristik lempeng mikro dari uji imunosorben
terkait-enzim untuk mendeteksi virus tanaman. J. Gen. Virol. 34: 475-483.
Compton, J. 1991. Amplifikasi berdasarkan urutan asam nukleat. Alam
350: 91-92.
Ilmu Kehidupan Corning. 2001. Memilih Sistem Deteksi: Metrik Colori, Fluorescent,
Metode Luminescent. Buletin Teknis ELISA 5:p14 http:// catalog2.corning.com/
Lifesciences/media/pdf/
elisa5.pdf (Diakses 24 Juli 2014).
Dickert, FL, Hayden, O., Bindeus, R., Mann, K., Blaas, D. dan Waig mann, E.
2004. Sensor QCM bioimprinted untuk skrining deteksi virus dari getah
tanaman. anal Bioanal. Kimia 378: 1929-1934.
Drygin, YF, Blintsov, AN, Grigorenko, VG, Andreena, IP, Opsipov, AP, Varitzev,
YA, Uskov, AI, Kravchenko, DV dan Atabekov, J.
G. 2012. Uji lapangan yang sangat sensitif imunodiagnostik aliran lateral
infeksi PVX. aplikasi Mikrobiol. Bioteknologi. 93: 179-189.
Dugat-Bony, E., Peyretaillade, E., Parisot, N., Biderre-Petit, C., Jaziri, F., Hill, D.,
Rimour, S. dan Peyret, P. 2012. Mendeteksi sekuens yang tidak diketahui
dengan DNA microarrays: strategi desain penyelidikan eksploratif. Mengepung.
Mikrobiol. 14: 356-371.
Eid, S., Atamian, HS, Abou-Jawdah, Y. and Havey, MJ 2008. Untuk menilai
pergerakan virus gangguan pengerdilan kuning Cucurbit pada plasma nutfah
mentimun yang rentan dan toleran menggunakan metode serologis dan
berbasis asam nukleat. J. Fitopatol. 156: 438-445.
Eiken Chemical Co. Ltd. 2005. Prinsip metode LAMP. http://loop amp.eiken.co.jp/
e/lamp/principle.html (Diakses 24 Juli 2014).
El-Araby, SW, Ibrahim, AI, Hemeida, AA, Mahmo, A., Soliman, M.
A., El-Attar, KA dan Mazyad, MH 2009. Diagnosis biologis, serologis dan
molekuler dari tiga virus kentang utama di Mesir.
Int. J. Viral. 5: 77-88.
Ellis, SD, Boehm, MJ and Qu, F. 2008. Pertanian dan Sumber Daya Alam:
Penyakit Virus Tanaman (PP401.05) [Lembar Fakta]. Universitas Negeri Ohio,
Universitas Negeri Ohio. Perpanjangan. http://ohioline.osu.edu/
hyg-fact/3000/pdf /PP401_05.pdf (Diakses 24 Juli 2014).
Machine Translated by Google
Penelitian Penyakit Tanaman Vol. 20 No.3
Eun, AJ, Huang, L., Chew, F., Li, SF dan Wong, S. 2002. Deteksi dua virus anggrek
menggunakan immunosensors microbalance kristal kuarsa (QCM). J. Viral.
Metode 99: 71-79.
Fegla, G. dan Kawanna, M. 2013. Peningkatan ELISA tidak langsung untuk
mendeteksi beberapa virus tanaman. Int. J. Pertanian. Biol. 15: 939-944.
Gibson, UEM, Heid, CA dan Williams, PM 1996. Metode baru untuk RT-PCR
kuantitatif waktu nyata. Res. Genom 6: 995-1001.
Ham, YI 2003. Tinjauan tentang kejadian dan studi kentang
penyakit virus di Korea. Res. Tanaman Dis. 9: 1-9.
Hammond, J. 2011. Microarray virus tanaman universal, uji PCR spektrum luas,
dan alat lain untuk deteksi dan identifikasi virus. Akta Hortik. 901: 49-60.
Hanÿeviÿ, K., erni, S., Radi, T. dan kori, D. 2012. Perbandingan metode yang
berbeda untuk deteksi virus Citrus tristeza di Satsuma
mandarin. J. Tanaman Dis. Melindungi. 119: 2-7.
Heid, CA, Stevens, J., Livak, KJ and Williams, MP 2011. Waktu nyata
PCR kuantitatif. Res. Genom 6: 986-994.
Helguera, PR, Docampo, DM, Nome, SF dan Ducasse, DA 2002.
Deteksi yang ditingkatkan dari virus kerdil Prune dalam daun persik dengan
reaksi rantai transkripsi-polimerase imunocapture-reverse dengan Reaksi
rantai polimerase bersarang (IC-RT-PCR Nested PCR). J. Fitopatol. 150: 94-96.
Helguera, PR, Taborda, R., Docampo, DM dan Ducasse, DA 2001.
Reaksi berantai transkripsi-polimerase terbalik imunocapture yang
dikombinasikan dengan nested PCR sangat meningkatkan deteksi virus bintik
cincin nekrotik Prunus pada buah persik. J. Viral. Metode
95: 93-100.
Hull, R. 2002. Virologi Tanaman Matthew. edisi ke-4 Pers Akademik,
New York, NY. 1001 hal.
Ju, H.-J. 2011. Deteksi virus gulungan daun kentang yang sederhana dan cepat
(PLRV) dengan transkripsi balik loop-mediated isothermal am plification (RT-
LAMP). Patologi Tumbuhan J. 27: 1-4.
Kfir, R. dan Genthe, B. 1993. Keuntungan dan kerugian penggunaan teknik
imunodeteksi untuk pencacahan mikroorganisme dan racun dalam air. Ilmu
Air. teknologi. 27: 243-
252.
Raja, AMQ, Adams, MJ, Eric, BC dan Lefkowitz, EJ 2011. Taksonomi Virus:
Laporan Kesembilan Komite Internasional Taksonomi Virus. lain. San diego,
CA. 1339 hal.
Kleo, K., Kapp, A., Ascher, L. dan Lisdat, F. 2011. Deteksi DNA virus vaccinia oleh
microbalance kristal kuarsa. anal Biokimia. 418: 260-266.
Klerks, MM, Leone, G., Lindner, JL, Schoen, CD dan ven den Heuvel, JF 2001.
Deteksi cepat dan sensitif virus lubang batang apel di pohon apel melalui
amplifikasi RNA dan penyelidikan dengan suar molekul fluoresen. Fitopatologi
91: 1085-1091.
Kurosawa, S., Park, J.-W., Aizawa, H., Wakida, S.-I., Tao, H. dan Ishi hara, K.
2006. Imunosensor microbalance kristal kuarsa untuk pemantauan lingkungan.
Biosens Bioelektron. 22: 473-481.
Lee, D., Mura, LM, Alnutt, RT dan Powell, W. 2009. Deteksi organisme yang
dimodifikasi secara genetik (GMO) menggunakan plifikasi am isotermal dari
urutan DNA target. Bioteknologi BMC. 9: 1-7.
Lee, GP, Min, BE, Kim, CS, Choi, SH, Harn, HH, Kim, SU and Ryu, KH 2003.
Hibridisasi chip cDNA virus tanaman untuk mendeteksi dan membedakan
empat Tobamovi yang menginfeksi cucurbit
179
tipu muslihat. J. Viral. Metode 110: 19-24.
Lee, J.-S., Cho, WK, Lee, S.-H., Choi, H.-S. dan Kim, KH 2011. Pengembangan
metode berbasis RT-PCR untuk mendeteksi lima virus tanaman karantina
yang tidak dilaporkan menginfeksi famili Cucurbitaceae atau Solanaceae.
Patologi Tumbuhan J. 27: 93-97.
Lee, YG dan Chang, KS 2005. Penerapan immunosensor microbalance kristal
kuarsa tipe aliran untuk penentuan waktu nyata virus demam sapi sapi dalam
cairan. Talanta 65: 1335-1342.
Leone, G., van Schijndel, HB, van Genien, B. dan Schoen, CD
1997. Deteksi langsung virus gulungan daun kentang pada umbi kentang
dengan imunocapture dan metode amplifikasi asam nukleat isotermal NASBA.
J. Viral. Metode 66: 19-27.
Li, M., Asano, T., Suga, H. dan Kageyama, K. 2011. PCR multipleks untuk
mendeteksi Phytophthora nicotianae dan P. cactorum, dan survei
kemunculannya di area produksi stroberi Jepang. Tanaman Dis. 95: 1270-1278.
Lievens, B., Grauwet, TJMA, Cammue, BPA dan Thomma, BP
HJ 2005. Perkembangan terkini dalam diagnosa gen patogen tanaman:
tinjauan. Res. Terbaru Dev. Mikrobiol. 9: 57-79.
Lin, NS, Hsu, YH dan Hsu, HT 1990. Deteksi imunologi virus tanaman dan
organisme seperti mikoplasma dengan blotting jaringan langsung pada
membran nitroselulosa. Fitopatologi 80: 824-
828.
Lopez, MM, Llop, P., Olmos, A., Marco-Noales, E., Cambra, M. dan Bertolini, E.
2008. Apakah alat molekuler memecahkan tantangan yang ditimbulkan oleh
deteksi bakteri dan virus patogen tanaman?.
Curr. Masalah Mol. Biol. 11: 13-45.
Luminex. 2010. Catatan Teknis Teknologi xMAP: Mengatasi keterbatasan biaya
dan kinerja ELISA dengan teknologi xMAP. http://www.luminexcorp.com/prod/
groups/public/docu ments/lmnxcorp/308-xmap-vs.-elisa-white-paper.pdf
(Diakses pada 22 Juli 2014).
Makkouk, KM dan Kumari, SG 2006. Diagnosis molekuler tanaman
virus. Arab. J. Perlindungan Tanaman. 24: 135-138.
Martos, S., Torres, E., El Bakali, MA, Raposo, R., Gramaje, D., Armen gol, J. dan
Luque, J. 2011. Pcr kerjasama digabungkan dengan hibridisasi dot blot untuk
mendeteksi Phaeomoniella chla mydospora pada kayu anggur yang terinfeksi.
J. Fitopatol. 159: 247-254.
Maskos, U. and Southern, EM 1992. Hibridisasi oligonukleotida pada penyangga
kaca: penghubung baru untuk tesis sintesis oligonukleotida dan sifat hibridisasi
oligonukleotida yang disintesis in situ. Asam Nukleat Res. 20: 1679-1684.
McCartney, AH, Foster, SJ, Fraaige, BA dan Ward, E. 2003. Diagnostik molekuler
untuk patogen tanaman jamur. Penanggulangan Hama. Sci. 59: 129-142.
Mecea, VM 2005. Dari neraca mikro kristal kuarsa hingga prinsip dasar pengukuran
massa. anal Lett. 38: 753-767.
Mecea, VM 2006. Apakah microbalance kristal kuarsa benar-benar sensor massa?
Sens. Act. A 128: 270-277.
Menzel, W., Jelkmann, W. dan Maiss, E. 2002. Deteksi empat virus apel dengan
tes multipleks RT-PCR dengan koamplifikasi mRNA tanaman sebagai kontrol
internal. J. Viral. Metode 99: 81-92.
Moreno, A., Bertolini, E., Olmos, A., Cambra, M. dan Fereres, A. 2007.
Estimasi kecenderungan vektor untuk virus mosaik Selada berbasis
Machine Translated by Google
180 Penelitian Penyakit Tanaman Vol. 20 No.3
pada deteksi virus pada kutu daun tunggal. Menjangkau. J. Pertanian. Res. 5: 376-
384.
Mumford, RA, Walsh, K., Barker, I. dan Boonham, N. 2000. Deteksi virus moptop
kentang dan virus mainan Tembakau menggunakan mul tiplex real-time
fluorescent reverse transcription polymerase chain reaction assay. Fitopatologi
90: 448-453.
Naidua, RA dan Hughes, JA 2001. Metode untuk mendeteksi penyakit virus
tanaman. Dalam: Prosiding Konferensi yang Diselenggarakan oleh IITA, Plant
Virology in Sub Sahara Africa hlm. 233-260. Institut Pertanian Tropis Antar
Nasional. Negara Bagian Oyo, Nigeria
Nam, M., Kim, JS, Lim, SM, Park, CY, Kim, JG, Choi, FS, Lim, HS, Moon, JS and
Lee, SH 2014. Pengembangan chip oligonukleotida skala besar untuk diagnosis
virus tanaman dan penggunaan praktisnya. Patologi Tumbuhan J. 30: 51-57.
Nie, X. 2005. Pembalikan transkripsi loop-mediated isotermal am plifikasi DNA
untuk deteksi virus Potato Y. Plant Dis. 89: 605-610.
Notomi, T., Okayama, H., Masubuchi, H., Yonekawa, T., Watanabe, K., Amino, N.
dan Hase, T. 2000. Amplifikasi isotermal yang dimediasi loop dari DNA. Asam
Nukleat Res. 28:e63 doi: 10.1093/nar/28.12.
e63.
Olmos, A., Bertolini, E. dan Cambra, M. 2002. Simultaneous and co operational
amplification (Co-PCR): sebuah konsep baru untuk mendeteksi virus tanaman.
J. Viral. Metode 106: 51-59.
Olmos, A., Bertolini, E. dan Cambra, M. 2007. Amplifikasi isotermal digabungkan
dengan hibridisasi aliran cepat untuk diagnosis sensitif virus Plum pox. J. Viral.
Metode 139: 111-115.
Olmos, A., Cambra, M., Esteban, O., Gorris, MT dan Terrada, E. 1999.
Perangkat dan metode baru untuk penangkapan, transkripsi balik, dan PCR
bersarang dalam satu tabung tertutup. Res. Asam Nukleat 27: 1564-
1565.
Owen, TW, Al-Kaysi, RO, Bardeen, CJ dan Cheng, Q. 2007. Imunosensor gravimetri
mikro untuk deteksi langsung partikel virus influenza A aerosol. Sens. Act. B
126: 691-699.
Pantaleo, V., Saponari, M. dan Gallitelli, D. 2001 Pengembangan protokol PCR
bersarang untuk mendeteksi virus yang menginfeksi zaitun dalam ekstrak
mentah. J. Tanaman Pathol. 83: 143-146.
Parida, M., Sannarangaiah, S., Dash, PK, Rao, PVL dan Morita, K.
2008. Amplifikasi isotermal yang dimediasi loop (LAMP); generasi baru teknik
amplifikasi gen yang inovatif; perspektif dalam diagnosis klinis penyakit menular.
Pdt. Med.
virus. 18: 407-421.
Pearson, MN, Semanggi, GRG, Guy, PL, Fletcher JD dan Beever, R.
E. 2006. Sebuah tinjauan dari virus tanaman, viroid dan catatan mollicute untuk
Selandia Baru. Australia. Tanaman Pathol. 35: 217-252.
Peiman, M. dan Xie, C. 2006. Deteksi sensitif virus kentang, PVX, PLRV, dan PVS,
dengan RT-PCR pada daun dan umbi kentang. Australia.
Tanaman Dis. Catatan 1: 41-46.
Peter, KA, Gildow, F., Palukaitis, P. dan Gray, SM 2009. Terminal C dari domain
readthrough Polerovirus P5 membatasi infeksi virus ke floem. J. Viral. 83:
5419-5429.
Virus Tumbuhan. 2003. Dunia Mikrobiologi dan Imunologi. http://
www.encyclopedia.com/doc/1G2-3409800449.html (Diakses pada 20 Juli 2014)
Qu, XS, Wanner, LA and Christ, BJ 2011. Uji multiplex real-time PCR (TaqMan)
untuk deteksi dan diskrimina simultan
tion tepung kentang dan penyakit kudis umum dan patogen. J. Aplikasi
Mikrobiol. 110: 769-777.
Ruiz-Ruiz, S., Ambros, S., del Carmen Vives, M., Navarro, L., Moreno, P. dan Jose,
G. 2009. Deteksi dan kuantisasi virus bercak daun jeruk oleh TaqMan real-time
RT- PCR. J. Viral. Metode 160: 57-62.
Ruiz-Ruiz, S., Moreno, P., Jose, G. dan Ambros, S. 2007. Sebuah uji RT-PCR real-
time untuk deteksi dan kuantisasi mutlak virus Citrus tristeza di jaringan
tanaman yang berbeda. J. Viral. Metode 145: 96-
105.
Saiki, R., Gelfand, D., Stoffel, S., Scharf, S., Higuchi, R., Horn, G., Mullis, K. dan
Erlich, H. 1988. Amplifikasi enzimatik terarah primer DNA dengan DNA
polimerase termostabil. Sains 239: 487-491.
Saiki, RK, Scharf, S., Falcona, F., Mullis, K., Horn, GT, Erlich, HA dan Arnheim, N.
1985. Amplifikasi enzimatik urutan genom beta-globin dan analisis situs restriksi
untuk diagnosis sel sabit anemia. Sains 230: 1350-1354.
Schaad, NW dan Frederick, RD 2002. PCR waktu-nyata dan aplikasinya untuk
diagnosa penyakit tanaman secara cepat. Bisa. J. Tanaman Pathol.
24: 250-258.
Schena, M., Shalon, D., Davis, RW dan Brown, PO 1995. Pemantauan kuantitatif
pola ekspresi gen dengan microarray DNA pelengkap. Sains 270: 467-470.
Scholthof, K.-BG 2000. Virus mosaik tembakau. Instruktur Kesehatan Tanaman.
http://www.apsnet.org/edcenter/intropp/lessons/
virus/Halaman/Tob accoMosaic.aspx (Diakses 20 Juli 2014).
Shang, H., Xie, Y., Zhou, X., Qian, Y. dan Wu, J. 2011. Metode serologis berbasis
antibodi monoklonal untuk mendeteksi virus mosaik bintik-bintik hijau Mentimun.
virus. J.8: 228-234.
Shiobara, Y., Yoshino, M., Uragami, A., Widiastuti, A., Omori, A., Kuba, K., Saito,
H., Hirata, Y., Sonoda, T., Koizumi, T. dan Sato, T. 2011.
Perbedaan jenis kelamin asparagus dengan amlifikasi isotermal yang dimediasi
loop dan pengamatan fenotipe bibit. Euphytica
177: 91-97.
Singh, PR, Dilworth, DA, Singh, M. dan McLaren, LD 2004. Evaluasi protokol
persiapan asam nukleat berbasis membran sederhana untuk deteksi RT-PCR
virus kentang dari kutu daun dan jaringan tanaman. J. Viral. Metode 121:
163-170.
Singh, RP, Nie, X. dan Singh, M. 2000. Duplex RT-PCR: konsentrasi reagen pada
tahap transkripsi terbalik mempengaruhi kinerja PCR. J. Viral. Metode 86:
121-129.
Strange, RN 2005. Penyakit tanaman: ancaman terhadap ketahanan pangan global.
annu. Pdt. Fitopatol. 43: 83-116.
Su, CC, Wu, TZ, Chen, LK, Yang, HH dan Tai, DF 2003. Pengembangan imunochip
untuk mendeteksi gen virus dengue. anal Chim. Babak 479: 117-123.
Sun, W., Jiao, K., Zhang, S., Zhang, C. dan Zhang, Z. 2001. Deteksi elektro kimia
untuk immunoassay enzim berbasis peroksidase lobak menggunakan p-
aminofenol sebagai substrat dan aplikasinya dalam mendeteksi tanaman virus.
anal Chim. Babak 434: 43-50.
Susmel, S., O'Sullivan, CK dan Guilbault, GG 2000. Deteksi cyto megalovirus
manusia oleh microbalance kristal kuarsa immu nosensor. Mikroba Enzim.
Teknologi. 27: 639-645.
Tang, D.-Q., Zhang, D.-J., Tang, D.-Y. dan Ai, H. 2006. Amplifikasi interaksi antigen-
antibodi dari mikroba kristal kuarsa
Machine Translated by Google
Penelitian Penyakit Tanaman Vol. 20 No.3
ance immunosensors melalui imobilisasi pengisian kembali emas nano pada
permukaan biorecognition. J. Imun. Metode 316: 144-
152.
Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H. dan Notomi, T. 2008. Amplifikasi isotermal yang
dimediasi loop (LAMP) dari urutan gen dan deteksi visual sederhana produk.
Protektor Alam. 3: 877-882.
Tomlinson, JA, Boonham, N. dan Dickinson, M. 2010. Pengembangan dan evaluasi
ekstraksi DNA satu jam dan uji amplifikasi isotermal yang dimediasi loop untuk
deteksi cepat fitoplasma. Tanaman Pathol. 59: 465-471.
Torrance, L. 1998. Perkembangan metode serologis untuk mendeteksi dan
mengidentifikasi virus tanaman. Jaringan Sel Tumbuhan. organisasi Kultus. 52: 27-32. Yang, J.-G., Wang, F.-L., Chen, D.-X., Shen, L.-L., Qian, Y.-M., Liang, JY, Zhou, W.-
Uttenthaler, E., Schraml, M., Mandel, J. dan Drost, S. 2001. Sensor keseimbangan
mikro kristal kuarsa ultrasen untuk mendeteksi M13-
Fag dalam cairan. Biosens. Bioelektron. 16: 735-743.
van der Want, JPH dan Dijkstra, J. 2006. Sejarah virologi tumbuhan.
Lengkungan. virus. 151:1467-1498.
Vaskova, D., Spak, J., Klerks, MM, Schoen, CD, Thompson, JR dan Jelkmann, W.
2004. NASBA waktu-nyata untuk mendeteksi virus pita vena Straw berry. eur. J.
Tanaman Pathol. 110: 213-221.
Vemulapati, B., Druffel, KL, Husebye, D., Eigenbrode, SD and Pappu, HR 2014.
Pengembangan dan penerapan uji ELISA untuk mendeteksi dua anggota famili
Luteoviridae yang menginfeksi kacang-kacangan: Pea enation mosaic virus
(genus Enamovirus) dan virus buncis (genus luteovirus). annu. aplikasi Biol. 165:
130-136.
Vidaver, AK dan Lambrecht, PA 2004. Bakteri sebagai patogen tanaman. Instruktur
Kesehatan Tanaman. www.apsnet.org/.../Patho genGroups/Pages/B acteria.aspx
(Diakses 20 Juli 2014).
Wang, B., Ma, Y., Zhang, Z., Wu, Z., Wu, Y., Wanga, Q. dan Li, M. 2011.
181
Virus kentang di Cina. Tanaman Melindungi. 30: 1117-1123.
Wang, D., Coscoy, L., Zylberberg, M., Avila, PC, Boushey, HA dan Ganem, D. 2002.
Deteksi berbasis microarray dan genotipe patogen virus. Prok. Natal akad. Sci.
99: 15687-15692.
Wang, D., Urisman, A., Liu, YT, Springer, M., Ksiazek, TG, Erdman, DD, Mardis, ER,
Hickenbotham, M., Magrini, V., Eldred, J., Latreille, JP, Wilson, RK, Ganem, D.
dan DeRisi, JL 2003. Penemuan virus dan pemulihan urutan menggunakan
microarray DNA. PLoS Biol. 1: 257-260.
Webster, CG, Wylie, JS dan Jones, MGK, 2004. Diagnosis patogen virus tanaman.
Curr. Sci. 86: 1604-1607.
C . dan Yan, T.-H. 2012. Pengembangan uji RT-PCR real-time im munocapture
satu langkah untuk mendeteksi Virus Mosaik Tembakau di Tanah. Sensor 12:
16685-16694.
Yardimci, BCN dan Culal-Klllc, H. 2011. Deteksi virus dalam menginfeksi buah batu
di wilayah mediterania Barat Turki.
Patologi Tumbuhan J. 27: 44-52.
Zan, X., Sitatuwana, P., Powellb, J., Dreherb, TW dan Wang, Q. 2012.
Tampilan polivalen dari motif RGD pada virus mosaik kuning Turnip
untuk meningkatkan adhesi dan penyebaran sel punca. Akta Biomater.
8: 2978-2985.
Zhang, Y., Yin, J., Li, G., Li, M., Huang, X., Chen, H., Zhao, W. dan Zhu, S. 2010.
Microarray oligonukleotida dengan jumlah probe minimal untuk deteksi dan
identifikasi tiga belas genera virus tanaman. J. Viral. Metode 167: 53-60.